牛尾山藥莖尖培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究

摘""" 要：為建立牛尾山藥脫毒培養(yǎng)和快繁體系，采用培養(yǎng)技術(shù)，篩選莖尖培培養(yǎng)、莖段擴(kuò)繁和生根培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基，并研究適宜的煉苗條件。結(jié)果表明：在MS+ 0.5 mg·L-16-BA +1.5 mg·L-1NAA 培養(yǎng)基中，莖尖的膨大率和成活率較高;對(duì)莖尖的褐變現(xiàn)象抑制效果最佳的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）濃度為0.01%，其褐變率僅為11.67%;培養(yǎng)基MS+1 mg·L-16-BA + 0.3 mg·L-1NAA誘導(dǎo)節(jié)莖段萌芽的效果較好;在生根培養(yǎng)中，MS+ 0.5 mg·L-16BA+1 mg·L-1NAA 培養(yǎng)基最合適;混合基質(zhì)（珍珠巖∶秸稈腐殖物=1∶1）、溫度20℃、遮光率75%、相對(duì)濕度80%是山藥組培苗最適宜的煉苗條件。綜上，本研究為牛尾山藥脫毒培養(yǎng)和快繁奠定基礎(chǔ)，對(duì)山藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有重要意義。

關(guān)鍵詞：山藥;莖尖培養(yǎng);莖段培養(yǎng);褐變抑制;煉苗

中圖分類號(hào)： S632.1"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"""""" DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.09.005

收稿日期：2024-03-29

基金項(xiàng)目：校企合作項(xiàng)目（KX142020067）;云南省曲靖市專家工作站項(xiàng)目（2021年）

作者簡(jiǎn)介：程園（1999—），女，云南紅河人，在讀碩士生，主要從事蔬菜學(xué)研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：龍?chǎng)┖纾?972—），女，云南紅河人，教授，博士，主要從事種質(zhì)資源研究與創(chuàng)新研究。

Research on Shoot Tip Culture and Rapid Propagation Technology of Niuwei Yam

CHENG Yuan1，XU Shengshen1，SU Yingnan1，WANG Shiyu1，GUO Fenggen2，LONG Wenhong1，3

（1. College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan， 650201， China;2. College of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan， 650201， China;3. Key Laboratory of Vegetable Biology of Yunnan Province， Kunming， Yunnan， 650201， China）

Abstract：In order to establish a virus-free culture and rapid propagation system for Niuwei yam， suitable culture media for shoot tip culture， stem segment propagation， and rooting culture were screened using tissue culture techniques， and the appropriate conditions of acclimatizating plantlets were studied. The results showed that the expansion rate and survival rate of shoot tips were higher in the medium MS+ 0.5 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA. The optimal concentration of polyvinylpyrrolidone （PVP） for inhibiting shoot tip browning was 0.01%， with a browning rate of only 11.67%. The medium MS+1 mg·L-16-BA + 0.3 mg·L-1NAA was better for adventitious bud emergence from a stem segment with a node. In the rooting culture， the medium MS+ 0.5 mg·L-16BA+1 mg·L-1NAA was the most appropriate.The optimal acclimatization conditions for yam plantlets were mixed substrate （perlite：straw humus=1：1）， temperature of 20 ℃， shading rate of 75%， and relative humidity of 80%. In summary， this study lays the foundation for virus-free culture and propagation of Niuwei yam， which is of great significance for the sustainable development of yam industry.

Key words：yam; shoot tip culture; shoot segment culture; browning inhibition; acclimatization

天津農(nóng)業(yè)科學(xué)" Tianjin Agricultural Sciences

2024，30（9）：28-33

山藥（Dioscoreae Rhizoma）是薯蕷科薯蕷屬。牛尾山藥俗稱斧把山藥、糍粑薯，是生長(zhǎng)在云南省祿豐縣的傳統(tǒng)地方品種，以其體型豐滿，肉質(zhì)甜美白嫩，多粘液和高品質(zhì)聞名[1]。隨著山藥種植和加工業(yè)的發(fā)展，山藥種植和生產(chǎn)逐漸加強(qiáng)，但薯塊留種的栽培方式會(huì)導(dǎo)致山藥病毒病發(fā)生嚴(yán)重，降低光合速率，影響生理機(jī)能[2]，種性退化和產(chǎn)量下降。受病毒侵染的山藥終身帶毒，目前尚無(wú)有效藥物可以治愈，通過(guò)組織培養(yǎng)獲得脫毒種苗是解決這一問(wèn)題的有效途徑[3]。本研究以牛尾山藥有節(jié)莖段、莖尖為外植體，篩選莖尖培養(yǎng)基、莖段擴(kuò)繁培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基，研究煉苗的適宜條件，探索有節(jié)莖段系統(tǒng)育苗的過(guò)程，完善牛尾山藥組織培養(yǎng)技術(shù)，以期為牛尾山藥的莖尖脫毒培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

國(guó)內(nèi)外有多數(shù)學(xué)者針對(duì)組織培養(yǎng)技術(shù)展開研究，但不同基因型山藥組織培養(yǎng)的適宜條件不同，有關(guān)紫山藥[4-5]、懷山藥[6-8]、鐵棍山藥[9]等組織培養(yǎng)與快繁的研究已見報(bào)道，但有關(guān)云南牛尾山藥組織培養(yǎng)的研究報(bào)道很少。本研究以牛尾山藥有節(jié)莖段和莖尖作為試驗(yàn)材料，探索適于牛尾山藥生長(zhǎng)快繁的培養(yǎng)條件，為牛尾山藥的莖尖脫毒培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為云南省祿豐縣牛尾山藥，采摘較綠嫩頂芽與有節(jié)莖段作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 莖尖培養(yǎng) 切取牛尾山藥植株頂芽，用自來(lái)水沖洗，放到超凈工作臺(tái)上，用75%酒精浸泡30 s，蒸餾水沖洗3～5次，再用0.1%HgCl2浸泡5～7 min，消毒后用無(wú)菌水沖洗3～5次，最后用滅菌濾紙濾干表面水分。在解剖鏡下，剝?nèi)?.5、1 mm莖尖，放于已經(jīng)滅菌的MS培養(yǎng)基上。MS培養(yǎng)基中，MS、蔗糖和瓊脂含量分別為4.74、30、7 g·L-1，6-BA和NAA含量見表1。培養(yǎng)室內(nèi)溫度保持在（25±2） ℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

1.2.2 聚乙烯吡咯烷酮對(duì)山藥莖尖的褐變抑制 所用材料及消毒方法同1.2.1部分。材料消毒完畢后，用解剖鏡將莖尖剝至0.5 mm大小，分別接種于抑制褐變的培養(yǎng)基上。所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為 MS+0.5 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA，添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。PVP設(shè)3個(gè)濃度水平，分別為0.020%、0.010%、0.005%。每個(gè)處理接種20個(gè)莖尖，重復(fù)3次。在初代培養(yǎng)基水分不足時(shí)，及時(shí)更換培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基濕潤(rùn)，放置于組培實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照12 h·d-1，溫度27 ℃。記錄第45 天和第60 天莖尖發(fā)芽率、褐化率、成活率。公式如下：

發(fā)芽率= 全部發(fā)芽莖尖數(shù)/供試莖尖總數(shù)）×100% （1）

成活率= 全部成活莖尖數(shù)/供試莖尖總數(shù)）×100% （2）

褐化率=褐化莖尖數(shù)/接種數(shù)×100%（3）

1.2.3 莖段培養(yǎng) 將植株采摘莖蔓剪成有節(jié)莖段，長(zhǎng)度為2 cm。首先，用洗滌劑清洗凈表面污物，再用自來(lái)水沖洗30 min，然后在超凈工作臺(tái)上消毒。消毒完畢后，用無(wú)菌水沖洗5～7次，用滅菌濾紙濾干表面水分，將有節(jié)莖段作為外植體備用。

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光培養(yǎng)，共設(shè)6個(gè)處理（表2），每個(gè)處理接種10個(gè)有節(jié)莖段，3次重復(fù)，接種后觀察萌芽情況，30 d后記錄萌芽率、多芽率和生芽數(shù)。公式如下：

萌芽率=萌芽外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%"" （1）

多芽率=產(chǎn)生多芽體外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100% （2）

1.2.4 生根培養(yǎng) 以MS+7 g·L-1瓊脂+15 g·L-1蔗糖為基本培養(yǎng)基，所用到的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度見表3，pH值范圍為5.8～6.0。將外植體材料接種在已消毒處理的培養(yǎng)基上，隨后進(jìn)行生根培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)處理，每個(gè)處理接種5個(gè)有節(jié)莖段，3次重復(fù)。

1.2.5 煉苗 用消毒鑷子將瓶?jī)?nèi)組培苗輕輕夾出，用清水洗凈根系，用紙巾吸干根系表面水分。移苗后，以珍珠巖與秸桿腐殖物混合基質(zhì)（珍珠巖∶秸稈腐殖物=1∶1）作為基質(zhì)進(jìn)行煉苗。將基質(zhì)裝于育苗缽中，澆足定根水，蓋上塑料育苗箱（38 cm×24 cm×20 cm）的蓋子，保證育苗箱內(nèi)肥水管理?xiàng)l件一致，注意進(jìn)行病蟲害防治。

煉苗以及煉苗影響因子的篩選均在塑料育苗箱中進(jìn)行。在不同煉苗基質(zhì)、不同溫度作用、不同遮光作用、不同相對(duì)濕度作用4個(gè)試驗(yàn)中（表4），對(duì)牛尾山藥組培苗成活率以及生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

生長(zhǎng)45 d后，每個(gè)處理隨機(jī)選擇5株試驗(yàn)苗進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量每株試驗(yàn)苗的根粗（選基部長(zhǎng)出的根）、莖長(zhǎng)（植株根部到最上部展開葉片著生處的莖長(zhǎng)度）、根數(shù)（根長(zhǎng)≥1 mm的根數(shù)量）、苗高（植株根部到頂芽的長(zhǎng)度），計(jì)算存活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究使用 Microsoft Excel 2016 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，采用 SPSS 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著性差異法（LSD）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體培養(yǎng)

2.1.1 不同大小莖尖對(duì)成活率的影響 由表4可知，當(dāng)莖尖剝離至0.5 mm時(shí)，處理2的成活率最高，為80.00%，處理2與處理1的成活率差異不顯著，但顯著高于其他水平組合的成活率。處理1的成活率次之，為（73.33±0.23）%，顯著高于處理3、處理4、處理5和處理6的成活率。成活率最低的是處理5，為（26.67±0.11）%。

當(dāng)莖尖為1 mm時(shí)，處理2、處理3、處理4和處理5的成活率均為100%，與處理6差異不顯著，但顯著高于處理1。成活率最低的是處理1，為（80.00±0.06）%。

在相同配方的培養(yǎng)基中，1 mm莖尖的成活率比0.5 mm莖尖的成活率高。處理3、處理4、處理5和處理6，1 mm莖尖的成活率均顯著高于0.5 mm莖尖的成活率。莖尖的大小影響了成活率，較大的莖尖更有利于膨大生長(zhǎng)。

由表5可知，當(dāng)莖尖培養(yǎng)7 d時(shí)，處理2的膨大率最高，為（50.00±0.01）%，顯著高于處理1、處理3和處理5。莖尖培養(yǎng)至15 d時(shí)，處理3和處理5的膨大率較高，為（96.67±0.01）%。莖尖培養(yǎng)至90 d時(shí)，以處理3的成苗率最高，為（30.00±0.02）%，與處理1和處理4差異顯著，與處理5和處理6差異顯著。處理5的成苗率最低，為（6.67±0.05）%。

莖尖培養(yǎng)至90 d時(shí)，處理1、處理2、處理3、處理4的組培苗均具有一定的株高以及多片綠色葉片（圖1），其中處理3的組培苗生長(zhǎng)情況最好，株高較高，植株挺立，葉片著綠。

綜上所述，0.5 mg·L-16-BA +1.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基對(duì)0.5 mm莖尖和1 mm莖尖的培養(yǎng)效果較好。

2.1.2 不同濃度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）對(duì)山藥莖尖褐變抑制的影響 由表6可知，植株生長(zhǎng)第45天和第60天，處理2的莖尖褐變數(shù)量和褐變率較處理1和處理3低。處理2的褐變抑制效果最好，褐變莖尖數(shù)最低，分別為（0.00±0.00） 個(gè)、（2.33±1.12） 個(gè)，褐變率最低，分別為（0.00±0.00）%和（11.67±0.06）%。另外，筆者觀察到莖尖再生芽較為健壯。由此可知，添加0.010%PVP的培養(yǎng)基對(duì)牛尾山藥莖尖的褐變抑制效果最好。

將0.5 mm莖尖接種在添加PVP的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，第45天所有處理的莖尖褐變數(shù)量普遍較少，第60天莖尖褐變數(shù)量明顯上升，未褐變莖尖逐漸變綠再生出小芽（圖2-A），褐變莖尖變褐腐爛死亡（圖2-B）。

2.1.3 莖段培養(yǎng) 由表7可知，不同處理下，有節(jié)莖段的萌芽率差異不顯著，并且各處理的萌芽率平均值變化小，萌芽率范圍為56.70%～66.70%。隨著NAA濃度的增加，有節(jié)莖段的萌芽率呈上升趨勢(shì)?？傮w來(lái)看，當(dāng)6-BA濃度為1 mg·L-1時(shí)，有節(jié)莖段的萌芽率較高，最高萌芽率為（66.70±1.13）%。

不同處理下，有節(jié)莖段均有多芽情況出現(xiàn)，其中處理3的多芽率最高，為（60.00±0.00）%，并且顯著高于處理4。各處理的平均生芽數(shù)無(wú)顯著性差異，其中處理3的生芽數(shù)最多，為（1.57±0.01） 個(gè)。

總體來(lái)說(shuō)，不同濃度的6-BA和NAA對(duì)莖段萌芽的促進(jìn)作用差異不顯著，但在培養(yǎng)基中添加1 mg·L-1

6-BA和0.3 mg·L-1NAA，可使有節(jié)莖段萌芽多且生長(zhǎng)健壯，此激素組合可作為有節(jié)莖段芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。2.2 生根培養(yǎng)

由表8可以看出，培養(yǎng)15 d，處理1的平均根數(shù)顯著高于處理2和處理3，3個(gè)處理之間差異不顯著;培養(yǎng)30 d，處理1全部生根，根的顏色為白色，生長(zhǎng)狀態(tài)好，平均根數(shù)、根長(zhǎng)和生根率顯著高于處理2和處理3。MS+0.5 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1瓊脂為較為理想的生根培養(yǎng)基。

2.3 煉苗

由表9可知，處理1的成活率最高，為（87.13±4.67）%，并且顯著高于其他處理;成活率最低的是處理4（地表土），為（72.35±3.78）%，與處理1之間差異顯著。處理1的根粗最粗，為（0.31±0.04） mm，與其他處理的之間差異不顯著;處理1的莖長(zhǎng)最長(zhǎng)，為（10.09±0.56） cm，苗高最高，為（14.07±1.56） cm，與其他處理存在顯著差異。綜上所述，處理1更有利于山藥組培苗生長(zhǎng)。

處理6的成活率最高，為（85.00±6.32）%，與處理5、處理8之間差異顯著，但與處理7之間差異不顯著;處理5的成活率最低，為（71.67±4.08）%。處理6的根粗最粗，為（0.21±0.04） mm，與處理5、處理8之間差異顯著;處理6的莖長(zhǎng)最長(zhǎng)，為（8.70±1.02） cm，苗高最高，為（12.81±0.92） cm，與其他處理存在顯著差異。綜上所述，處理6更有利于山藥組培苗生長(zhǎng)。

處理9的成活率最高，為（84.35±3.78）%，并且顯著高于其他處理;成活率最低的是處理12，為（77.13±4.67）%，顯著低于處理9。處理12的根粗最粗，為（0.20±0.06） mm，莖長(zhǎng)最長(zhǎng)，為（10.87±2.73）cm，顯著高于處理9，但與處理10差異不明顯;處理12的苗高最高，為（11.87±1.35） cm，與其他處理差異不顯著。處理9的根數(shù)最多，為（8.17±1.07）條，顯著高于處理12。綜上所述，雖然處理12的根粗、苗高較為優(yōu)異，但成活率低，而擁有最高存活率的處理9，只有根數(shù)具有優(yōu)勢(shì)。綜上可知，處理10更有利于山藥組培苗生長(zhǎng)。

處理14的組培苗成活率最高，為（88.41±4.00）%，顯著高于處理13和處理16。處理14的根粗最粗，為（0.27±0.03） mm，莖長(zhǎng)最長(zhǎng)，為（10.11±3.89） cm，顯著高于處理16，苗高最高，為（12.11±2.75） cm，顯著高于其他處理;處理14的根數(shù)最多，為（6.88±0.43） 條，顯著高于處理16。試驗(yàn)證明，處理14更有利于山藥組培苗生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 莖尖組織培養(yǎng)適宜的激素配比及褐變抑制

組織培養(yǎng)體系的建立，與培養(yǎng)基種類、植物生長(zhǎng)物質(zhì)的種類、濃度、配比密切相關(guān)[10]。MS+1 mol·L-1 6-BA+0.5 mol·L-1 NAA培養(yǎng)基是懷山藥適用的培養(yǎng)基配比，該培養(yǎng)基可誘導(dǎo)莖段得到多芽體[11];MS+2.0 mg·L-1 KT+1 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 NAA是懷山藥莖段最適宜的培養(yǎng)基[12]。不同植物以及相同植物的不同部位都需要不同的培養(yǎng)基[13]。本研究表明，在培養(yǎng)基中添加MS+0.5 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 NAA，莖尖萌芽多且生長(zhǎng)健壯。

褐變會(huì)影響組織培養(yǎng)，組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵是有效控制褐變[14]。PVP能夠有效抑制紫山藥褐化。添加抗褐化劑 PVP能顯著降低紫山藥外植體的褐化速度[15]。適宜的PVP濃度能夠有效抑制山藥組培苗的褐化。向培養(yǎng)基中添加PVP能夠有效降低淮山褐化效果，并且添加300 mg·L-1 PVP較200 mg·L-1 PVP抗褐化效果更好[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度PVP（0.020%）對(duì)莖尖褐變現(xiàn)象的抑制效果最差，略低濃度PVP（0.010%）對(duì)莖尖的褐變現(xiàn)象抑制效果較好，較低濃度PVP（0.005%）對(duì)莖尖的褐變現(xiàn)象抑制效果較差。這表明不同基因型山藥組培苗的最適PVP濃度不同，但最適濃度有待進(jìn)一步細(xì)化研究。

3.1.2 煉苗的影響因素 在移栽過(guò)程中，外界的溫度、基質(zhì)、光照、濕度均會(huì)影響組培苗的成活率[17]。不同的基質(zhì)種類和配比會(huì)影響植物的成活率。以樹皮屑∶刨花=1∶1配比作為煉苗基質(zhì)，紫菀石斛成活率可達(dá)到96%[18]。培養(yǎng)山藥組培苗的適宜基質(zhì)為地表土+珍珠巖，成活率可達(dá)到70.7%[19]。本試驗(yàn)探究不同基質(zhì)配比，牛尾山藥組培苗移栽的成活率，并且考慮到云南土壤為紅土，故增加培養(yǎng)基質(zhì)的種類，選擇本地土壤為對(duì)照組。結(jié)果表明，在珍珠巖與秸稈腐殖物混合基質(zhì)（珍珠巖∶秸稈腐殖物=1∶1）中，煉苗的成活率較高。

不同植物對(duì)濕度和溫度的需求存在明顯差異。在濕度大于70%的條件下，桃組培苗的移栽成活率較高[20]。文冠果組培苗在不同溫度條件下煉苗，組培苗的成活率具有明顯差異。在15～20 ℃條件下，文冠果具有較高的成活率[21]。本試驗(yàn)表明，在20 ℃條件下，山藥組培苗的成活率較高。文冠果和山藥都是喜溫植物，但文冠果和山藥的煉苗溫度都低于最適生長(zhǎng)溫度，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

3.2 結(jié)論

在MS+ 0.5 mg·L-16-BA +1.5 mg·L-1NAA" 培養(yǎng)基中，莖尖的成苗率最高。MS培養(yǎng)基添加1 mg·L-16-BA和0.3 mg·L-1 NAA，可使有節(jié)莖段萌芽多且生長(zhǎng)健壯。0.01%PVP對(duì)山藥莖尖的褐變現(xiàn)象抑制效果最佳，褐變率僅為11.67%。MS+0.5 mg·L-16BA +1 mg·L-1 NAA培養(yǎng)基最適宜生根培養(yǎng)。

混合基質(zhì)（珍珠巖∶秸桿腐殖物=1∶1）、溫度20 ℃、遮光率75%、濕度80%的煉苗條件最適合山藥組培苗生長(zhǎng)。

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