AMEP蛋白對(duì)玉米苗期低溫冷害脅迫抗性的影響

摘""" 要：為了探究AMEP蛋白對(duì)低溫冷害脅迫下玉米幼苗生理代謝的影響，對(duì)兩葉一心時(shí)期玉米幼苗的葉面噴施0.1 mg·mL-1AMEP蛋白，24 h后進(jìn)行低溫冷害脅迫，溫度0～4 ℃，持續(xù)時(shí)間6 h，脅迫結(jié)束24 h對(duì)玉米幼苗的形態(tài)指標(biāo)、地上部與地下部生物量、膜損傷指標(biāo)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明：在AMEP蛋白的作用下，玉米幼苗的形態(tài)指標(biāo)和有機(jī)物質(zhì)積累顯著增加，AMEP蛋白組比對(duì)照株高、根長分別提升23.7%和29.5%，地上部干質(zhì)量與鮮質(zhì)量分別提升39.3%和53.2%，地下部干質(zhì)量與鮮質(zhì)量分別提升64.4%和63.9%;低溫冷害脅迫對(duì)其細(xì)胞膜的損傷明顯降低，超氧陰離子含量、過氧化氫含量、丙二醛含量、相對(duì)電導(dǎo)率分別降低36.5%、23.4%、43.8%、26.1%，細(xì)胞內(nèi)滲透壓得到平衡，并且幼苗的抗氧化酶活性提升;可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、APX活性分別提升25.2%、46.1%、26.4%、28.6%、8.3%、22.8%、28.7%。綜上所述，AMEP蛋白可以有效提升玉米幼苗的抗逆性，從而降低低溫冷害脅迫對(duì)玉米幼苗的損害。

關(guān)鍵詞：AMEP蛋白;玉米;低溫冷害;抗逆性

中圖分類號(hào)：TQ458"""""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""""""" DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.09.002

Effect of AMEP Protein on Resistance to Low Temperature Chilling Stress in Maize Seedling Stage

LIU Ming， LAI Sitong， GUO Meijun， JIANG Jialiang， LIU Quan

（College of Life Science and Biotechnology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163319， China）

Abstract： To explore the effect of AMEP protein on the physiological metabolism of maize seedlings under low-temperature stress， maize seedlings at two-leaf and one-heart stage were sprayed with 0.1 mg·mL-1 AMEP protein. After 24 hours， the seedlings were treated with low-temperature stress at 0-4 ℃ for 6 hours. Then the morphological parameter， aboveground and belowground biomass， membrane damage indexes， osmoregulation substance， and antioxidant enzyme activities were measured 24 hours after the stress was removed. The results showed that the morphological parameter and organic matter accumulation increased significantly. Compared with the control group， the plant height and root length increased by 23.7% and 29.5%. The dry weight and fresh weight of the aboveground parts increased by 39.3% and 53.2%， and the dry weight and fresh weight of the belowground parts increased by 64.4% and 63.9%. The damage to cell membranes caused by low-temperature stress was significantly reduced， with superoxide anion content， hydrogen peroxide content， malondialdehyde content， and relative conductivity decreased by 36.5%， 23.4%， 43.8%， and 26.1%， respectively. The intracellular osmotic pressure was balanced， while the activity of antioxidant enzymes was also enhanced. The contents of soluble sugar， soluble protein and proline increased by 25.2%， 46.1%， 26.4%. The activities of SOD， POD， CAT， and APX increased by 28.6%， 8.3%， 22.8% and 28.7%， respectively. In conclusion， AMEP protein can effectively enhance the stress resistance of maize seedlings， thereby reducing the damage caused by low-temperature stress.

Key words： AMEP protein; maize; low temperature damage; stress resistance

收稿日期：2024-08-02

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（UH2021C064）

作者簡介：劉銘（1999—），男，黑龍江雙鴨山人，在讀碩士生，主要從事生物與醫(yī)藥研究。

通訊作者簡介：劉權(quán)（1982—），男，河北辛集人，教授，博士，主要從事植物病害生物防治與植物生物脅迫研究。

玉米是世界第一大糧食作物，也是我國重要的糧食作物，是飼料行業(yè)以及工業(yè)生產(chǎn)中的重要原料[1]。玉米作為一種喜溫作物，對(duì)溫度變化及其敏感[2]。黑龍江省是我國春玉米種植的主要地區(qū)之一，其獨(dú)特的高緯度地理?xiàng)l件以及氣候條件極易引發(fā)低溫冷害現(xiàn)象[3]，嚴(yán)重影響早期玉米幼苗植株生長發(fā)育過程[4]。研究表明，低溫冷害脅迫對(duì)玉米生長發(fā)育的影響主要集中在早期幼苗生長時(shí)期。在此階段，低溫冷害對(duì)玉米的形態(tài)特征以及生理生化指標(biāo)產(chǎn)生顯著的影響。這些不良影響會(huì)導(dǎo)致玉米幼苗生長速度減緩，發(fā)育周期延長，籽粒灌漿不足，幼苗葉尖出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，玉米產(chǎn)量顯著降低[5-6]。因此，研究玉米耐冷機(jī)制、提高玉米的耐冷性是減少低溫冷害對(duì)玉米的損傷和促進(jìn)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的有效措施。

蛋白激發(fā)子是一類來源于微生物及寄主植物或寄主-病原物互作后產(chǎn)生的一類能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的一類化合物，可誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生乙烯、植保素、水楊酸、茉莉酸等，使植物發(fā)生多種防衛(wèi)反應(yīng)[7]，是提高植物抗性的理想材料。蛋白激發(fā)子還可以調(diào)控離子通道，促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生和植保素的積累，防御相關(guān)基因的表達(dá)[8]。AMEP 蛋白是從枯草芽孢桿菌中提取出來的一種多功能植物免疫蛋白，具有激發(fā)植物免疫和抗病抗逆作用[9]，該蛋白激發(fā)子由76個(gè)氨基酸組成，分子量為8.36 kD，富含賴氨酸和亮氨酸等疏水氨基酸，其17～36位氨基酸被預(yù)測為跨膜結(jié)構(gòu)域。AMEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋組成，以多聚體形式穩(wěn)定存在于水性溶液中，并且具有良好的熱穩(wěn)定性。前期試驗(yàn)表明，AMEP蛋白通過提升抗逆相關(guān)蛋白酶的表達(dá)水平等早期防衛(wèi)反應(yīng)，激活植物自身免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗病抗逆能力，以提高植物自身對(duì)病原菌（丁香假單胞菌和瘡痂鏈霉菌）抗性[10-11，12]。此外，在非生物脅迫方面，AMEP蛋白通過提升干旱脅迫下大豆幼苗抗氧化酶活性，改善相關(guān)形態(tài)指標(biāo)與干物質(zhì)積累，調(diào)控抗逆相關(guān)基因表達(dá)等途徑緩解干旱脅迫對(duì)大豆幼苗的損傷[13]。在非生物脅迫中，低溫冷害對(duì)苗期植物尤其是以玉米為代表的喜溫作物有著不可逆的損傷，是限制作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素之一。因此，探究AMEP蛋白對(duì)玉米苗期低溫冷害脅迫的緩解作用和生理生化指標(biāo)的影響尤為重要。

綜上所述，為了驗(yàn)證AMEP蛋白降低低溫冷害脅迫對(duì)玉米幼苗的損傷效果，本研究對(duì)兩葉一心時(shí)期玉米幼苗噴施AMEP蛋白，進(jìn)行低溫冷害脅迫后，對(duì)玉米幼苗形態(tài)指標(biāo)、生物量、膜損傷指標(biāo)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行測定，為減少早春極端低溫天氣對(duì)玉米的損傷提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米品種龍高L2、AMEP蛋白、蒸餾水、蛭石、營養(yǎng)土、土培培養(yǎng)器。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取籽粒飽滿的種子，使用2%次氯酸鈉溶液（NaClO）浸泡20 min，蒸餾水沖洗5次，營養(yǎng)土與蛭石按質(zhì)量體積比1∶3比例混合。播種于土培培養(yǎng)器（直徑7 cm，高7.5 cm），扎淺穴播種，每盆栽種9粒種子，覆蓋相同土壤，放置于植物生長室內(nèi)，每日傍晚復(fù)水1 L。培養(yǎng)條件：光照與黑暗周期設(shè)置為16 h照明和8 h黑暗，相對(duì)濕度維持在75%，光照強(qiáng)度為4 000 lx，溫度設(shè)置為（28±1） ℃。在玉米兩葉一心時(shí)期，去除長勢過高或過低的幼苗植株并保持每盆5棵植株，以噴施蒸餾水組為對(duì)照組，以噴施0.1 mg·mL-1 AMEP蛋白組為處理組[10]。幼苗植株處理24 h后進(jìn)行低溫冷害，溫度0～4 ℃，脅迫時(shí)間6 h。脅迫結(jié)束后，將玉米幼苗重新置于植物生長室內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件同脅迫前培養(yǎng)條件，測定形態(tài)指標(biāo)與生理指標(biāo)[14-15，16]。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 生物量的測定 將脅迫結(jié)束24 h的玉米幼苗根莖交界處剪斷，使用直尺分別測量玉米幼苗的株高和根長，并將其記錄為地上部與地下部。為了去除樣品表面的水分，采用濾紙進(jìn)行吸干處理，利用分析天平分別測定地上部質(zhì)量和地下部質(zhì)量，記錄為地上部鮮質(zhì)量和地下部鮮質(zhì)量。將樣品放入烘箱中，烘箱溫度為105 ℃，殺青處理20 min，再以80 ℃烘干至恒質(zhì)量，并再次進(jìn)行測量，記錄為地上部干質(zhì)量和地下部干質(zhì)量。

1.3.2 葉綠素含量的測定 相對(duì)葉綠素含量使用SPAD-502型葉綠素儀測定。

1.3.3 抗氧化酶活性的測定 取0.3 g脅迫結(jié)束24 h的玉米幼苗葉片，參考李合生[17]的方法測定超氧化物岐化酶活性（SOD）、過氧化物酶活性（POD）、過氧化氫酶活性（CAT），參考高俊鳳[18]的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性。

1.3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和膜損傷相關(guān)指標(biāo)的測定 丙二醛采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定，相對(duì)電導(dǎo)率用電導(dǎo)率儀（DDS-307）測量，H2O2含量采用碘化鉀分光光度法測定，O2-含量采用羥胺氧化法測定[18]，游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理，使用IBM SPSS Statistics 27軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMEP蛋白對(duì)低溫冷害脅迫下玉米幼苗株高和根長的影響

玉米幼苗葉片噴施0.1 mg·mL-1AMEP蛋白后，進(jìn)行低溫脅迫處理，溫度為0～4 ℃，持續(xù)時(shí)間6 h。低溫脅迫結(jié)束后，將玉米幼苗重新置于植物生長室培養(yǎng)24 h，測定玉米幼苗的株高根長。如圖1所示，葉片噴施AMEP蛋白后，玉米幼苗的株高和根長均明顯優(yōu)于未噴施AMEP蛋白組。與未噴施AMEP蛋白組相比，株高和根長分別提高23.7%、29.5%。其中，低溫脅迫結(jié)束后，將玉米幼苗重新置于植物生長室培養(yǎng)24" h，測定AMEP蛋白組的株高與根長分別為7.3和15.8 cm。株高和根長是玉米生長發(fā)育的重要指標(biāo)，對(duì)玉米的生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性、最終產(chǎn)量等方面都有重要的作用。上述結(jié)果表明，AMEP蛋白可以顯著增加玉米的株高和根長，增強(qiáng)玉米對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)性，抵抗低溫對(duì)植物帶來的不利影響，使植株正常生長發(fā)育。

2.2 AMEP蛋白對(duì)低溫冷害脅迫下玉米幼苗生物量的影響

在低溫冷害條件下，AMEP蛋白對(duì)玉米幼苗株高、根長、生物量均有促進(jìn)作用。低溫冷害脅迫24 h后，AMEP蛋白處理組的地上部和地下部鮮質(zhì)量與干質(zhì)量均顯著高于對(duì)照組。與未噴施AMEP蛋白處理組的玉米幼苗相比，AMEP蛋白處理組的地上部與地下部鮮質(zhì)量分別提高39.3%和53.2%。對(duì)于地上部與地下部干質(zhì)量，AMEP蛋白處理組比未噴施AMEP蛋白處理組提高64.4%和63.9%。上述結(jié)果顯示，對(duì)玉米幼苗進(jìn)行AMEP蛋白葉面噴施會(huì)增加玉米生物量，降低低溫冷害對(duì)玉米生長的抑制作用（表1）。

2.3 AMEP蛋白對(duì)低溫冷害脅迫下玉米幼苗膜損傷指標(biāo)的影響

如圖2所示，低溫脅迫24 h后，與未噴施AMEP蛋白組相比，噴施AMEP蛋白組的幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率降低26.1%，并且差異顯著。

超氧陰離子（O2-）含量測定結(jié)果顯示，與未噴施AMEP蛋白組相比，AMEP蛋白處理組的幼苗葉片超氧陰離子含量降低36.5%，并且差異顯著。丙二醛（MDA）含量測定結(jié)果顯示，未噴施AMEP處理組與AMEP蛋白處理組的葉片丙二醛（MDA）含量分別為0.051、0.011 μmol·g-1，與未噴施AMEP處理組處相比，AMEP蛋白處理組的葉片丙二醛（MDA）含量降低43.8%。過氧化氫含量測定結(jié)果顯示，與未噴施AMEP蛋白組相比，AMEP蛋白處理組的過氧化氫含量降低23.4%。超氧陰離子和相對(duì)電導(dǎo)率測定結(jié)果顯示，與未噴施AMEP蛋白組相比，AMEP蛋白處理組的超氧陰離子含量和相對(duì)電導(dǎo)率分別降低36.5%和26.1%。上述結(jié)果表明，噴施AMEP蛋白能有效減少低溫脅迫下玉米幼苗在過氧化氫、超氧陰離子與丙二醛的積累，降低葉片相對(duì)電導(dǎo)率，從而減緩細(xì)胞液外滲，使細(xì)胞膜損傷程度降低。

2.4 AMEP蛋白對(duì)低溫冷害脅迫下玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

如圖3所示，低溫脅迫后，與未噴施AMEP組相比，AMEP蛋白處理組的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)明顯提升。其中，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量分別提高25.2%、46.1%、26.4%。這證明AMEP蛋白可以維持低溫冷害脅迫下玉米幼苗細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定，維持幼苗正常生長發(fā)育。

2.5 AMEP蛋白對(duì)低溫冷害脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

如圖4所示，AMEP蛋白可以有效增加低溫條件下玉米幼苗抗氧化酶活性。與未噴施AMEP蛋白組相比，AMEP蛋白組的抗氧化物酶活性SOD、POD、CAT、APX分別提升28.6%、8.3%、22.8%、28.7%。上述結(jié)果表明，AMEP蛋白對(duì)玉米幼苗的抗氧化物酶SOD、POD、CAT、APX活性均有不同程度的提高。這說明AMEP蛋白可以有效降低低溫脅迫活性氧ROS對(duì)玉米幼苗的損傷，減緩低溫冷害對(duì)玉米幼苗的影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 低溫冷害對(duì)玉米苗期生物量的影響 在玉米苗期，根系是吸收水分和營養(yǎng)的關(guān)鍵部分。當(dāng)遭受低溫脅迫時(shí)，根系生長減緩、根部變短，進(jìn)而影響其吸收營養(yǎng)的效率，這對(duì)幼苗的生長發(fā)育造成不利影響[19]。此外，低溫還會(huì)使幼苗根部干質(zhì)量和鮮質(zhì)量減輕，分支數(shù)量減少，根的形態(tài)出現(xiàn)變化[20-21]。低溫脅迫還會(huì)導(dǎo)致玉米葉片生長緩慢，進(jìn)而導(dǎo)致植株矮小，地上部干質(zhì)量和鮮質(zhì)量降低[22]。本研究中，AMEP蛋白處理組的株高、根長均高于噴施蒸餾水組。這說明 AMEP蛋白可以有效促進(jìn)玉米幼苗生長發(fā)育，增加幼苗根系對(duì)土壤水分以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。此外，噴施蒸餾水組的幼苗地上部和地下部干質(zhì)量與鮮質(zhì)量均低于AMEP蛋白處理組。這說明AMEP蛋白可以促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)的積累和根系的生長發(fā)育。

3.1.2 低溫冷害對(duì)玉米苗期細(xì)胞膜系統(tǒng)的影響 植物的抗寒能力與細(xì)胞膜系統(tǒng)的關(guān)系密切[23-24]，低溫環(huán)境主要影響玉米的細(xì)胞膜系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂發(fā)生從液態(tài)到凝膠狀態(tài)的相變，改變細(xì)胞膜的形態(tài)。這種變化增強(qiáng)了細(xì)胞膜的通透性，促使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和電解質(zhì)滲出。因此，細(xì)胞內(nèi)的丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2-）、相對(duì)電導(dǎo)率等指標(biāo)顯著升高[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施AMEP蛋白組與噴施蒸餾水相比，丙二醛含量（MDA）、過氧化氫（H2O2）含量、超氧陰離子（O2-）、相對(duì)電導(dǎo)率均有不同程度的降低。這說明AMEP蛋白能夠降低低溫脅迫下玉米幼苗膜脂過氧化物質(zhì)的積累，平衡細(xì)胞膜通透性，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，減少低溫脅迫對(duì)玉米幼苗的損傷。

3.1.3 低溫冷害對(duì)玉米苗期滲透調(diào)節(jié)的影響 滲透調(diào)節(jié)是玉米為應(yīng)對(duì)逆境環(huán)境脅迫而演化出的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)玉米受到低溫脅迫時(shí)，其體內(nèi)會(huì)生成多種與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的物質(zhì)，例如脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等。在低溫脅迫條件下，這些物質(zhì)的濃度會(huì)顯著增加，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓和酶活性等重要作用，進(jìn)而減輕低溫脅迫對(duì)玉米細(xì)胞造成的損傷。這種滲透調(diào)節(jié)機(jī)制是玉米適應(yīng)惡劣環(huán)境的一種重要生存策略，有助于提高玉米植株的抗逆性和生存能力[28-29]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)結(jié)果顯示，在低溫脅迫下，玉米幼苗噴施AMEP蛋白組比蒸餾水處理組的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量分別提升25.2%、46.1%、26.4%。這說明AMEP蛋白能有效增加玉米葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，調(diào)節(jié)幼苗細(xì)胞滲透壓，降低低溫對(duì)植物的損傷。

3.1.4 低溫冷害對(duì)玉米苗期抗氧化酶系統(tǒng)的影響 在玉米的防御機(jī)制中，抗氧化酶系統(tǒng)扮演著極為重要的角色，它能夠有效幫助玉米清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧（ROS）。當(dāng)玉米經(jīng)歷低溫脅迫時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)的相關(guān)酶活性及酶促清除機(jī)制會(huì)顯著增強(qiáng)，其中包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等，這些酶能夠有效清除體內(nèi)多余的活性氧[30]。此外，抗氧化系統(tǒng)還會(huì)迅速合成維生素C（抗壞血酸）和類胡蘿卜素等非酶促清除物質(zhì)，以提升清除體內(nèi)過量活性氧的能力[31]?？寡趸笢y定結(jié)果顯示，AMEP蛋白處理組的幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性均有明顯提高，分別提高28.6%、8.3%、22.8%、28.7%。這說明AMEP蛋白可能會(huì)提高抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)抗氧化酶活性的提升，加速玉米幼苗自身對(duì)ROS的清除，從而提升植物自身來自低溫脅迫的影響，減少ROS對(duì)玉米幼苗的損傷。

3.2 結(jié)論

本研究中，在低溫脅迫條件下，AMEP蛋白組的幼苗株高、根長和生物量均顯著高于對(duì)照組，其中株高與根長分別提高23.7%和29.5%，地上部干質(zhì)量與鮮質(zhì)量分別提升39.3%和53.2%，地下部干質(zhì)量與鮮質(zhì)量分別提升64.4%和63.9%。上述結(jié)果表明，AMEP蛋白可以促進(jìn)玉米幼苗有機(jī)物質(zhì)的積累。此外，AMEP蛋白還可以增加玉米幼苗的抗氧化酶活性，SOD、POD、CAT、APX分別提升28.6%、8.3%、22.8%、28.7%;葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量得到提升，分別為25.2%、46.1%、26.4%;膜損傷物質(zhì)指標(biāo)中，丙二醛、過氧化氫、超氧陰離子含量降低，相對(duì)電導(dǎo)率降低，葉片超氧陰離子含量、過氧化氫含量、丙二醛含量與相對(duì)電導(dǎo)率分別降低36.5%、23.4%、43.8%、26.1%，以達(dá)到減少低溫脅迫對(duì)玉米幼苗損傷的目的。綜上所述，噴施AMEP蛋白可以提高玉米苗期抗低溫脅迫的能力，具備進(jìn)一步開發(fā)的潛力。

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