基于生物信息學(xué)分析構(gòu)建肝細(xì)胞癌患者新型雙硫死亡相關(guān)預(yù)后模型

通信作者：楊永平，yongpingyang@hotmail.com（ORCID：0000-0002-8307-1095）

摘要：目的探討雙硫死亡基因在肝細(xì)胞癌（HCC）中的表達(dá)情況，研究雙硫死亡對HCC的預(yù)后價(jià)值并構(gòu)建預(yù)后模型，分析其影響HCC的生物學(xué)過程和對索拉非尼耐藥的影響。方法從TCGA-LIHC數(shù)據(jù)庫中收集HCC患者的mRNA表達(dá)譜和相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)。利用LASSO-Cox回歸算法構(gòu)建TCGA隊(duì)列中的4基因預(yù)后預(yù)測模型。在外部數(shù)據(jù)集ICGC和GSE14520隊(duì)列中驗(yàn)證模型的預(yù)后效能?；诎┌Y藥物敏感性基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析雙硫死亡模型對索拉非尼治療反應(yīng)的預(yù)測作用。此外，進(jìn)行GO和KEGG功能分析，以深入了解雙硫死亡相關(guān)基因的生物學(xué)功能。計(jì)量資料兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗(yàn)評估預(yù)后差異；采用單因素和多因素Cox回歸分析研究風(fēng)險(xiǎn)評分是否獨(dú)立影響患者預(yù)后。結(jié)果在TCGA隊(duì)列中行單因素Cox回歸分析，7個(gè)已知的雙硫死亡相關(guān)基因與HCC總生存期（OS）顯著相關(guān)（P值均lt;0.05）；進(jìn)一步通過LASSO-Cox回歸分析，構(gòu)建雙硫死亡相關(guān)的基因（DRG）預(yù)后模型，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評分（RS-DRG），RS-DRG=0.061 6×GYS1表達(dá)水平+0.152 8×LRPPRC表達(dá)水平+0.268 3×RPN1表達(dá)水平+0.183 5×SLC7A11表達(dá)水平。Log-rank檢驗(yàn)表明雙硫死亡模型中高風(fēng)險(xiǎn)評分患者的OS明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)評分患者（Plt;0.001）。根據(jù)多因素Cox回歸結(jié)果，在TCGA和ICGC隊(duì)列中，風(fēng)險(xiǎn)評分都是OS的獨(dú)立預(yù)測因子（TCGA：HR=1.869，P=0.002；ICGC：HR=3.469，P=0.004）。Spearman相關(guān)分析表明RS-DRG與腫瘤微環(huán)境中的多種免疫細(xì)胞類型（包括B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的浸潤水平呈顯著正相關(guān)（P值均lt;0.05）。高風(fēng)險(xiǎn)評分組患者索拉非尼IC50值更低，對索拉非尼更敏感（Plt;0.001）。KEGG/GO富集分析顯示雙硫死亡風(fēng)險(xiǎn)差異基因顯著富集于多種有絲分裂相關(guān)的分子功能。結(jié)論本研究構(gòu)建了一種新的雙硫死亡相關(guān)基因預(yù)后模型，在預(yù)測HCC預(yù)后方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值；以雙硫死亡基因?yàn)榘悬c(diǎn)可能是治療HCC的一種很有前景的方法。

關(guān)鍵詞：癌，肝細(xì)胞；二硫化物類；計(jì)算生物學(xué)；比例危險(xiǎn)度模型

基金項(xiàng)目：中國科技部傳染病專業(yè)國家重點(diǎn)項(xiàng)目（2018ZX10725506）；首都臨床特色診療技術(shù)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用（Z221100007422002）

Construction of a novel disulfidptosis-related prognostic model for patients with hepatocellular carcinoma based on bioinformatics analysis

SONG Zheng1，2，LUO Wei3，CHANG Xiujuan2，YANG Yongping1，2.（1.Peking University 302 Clinical Medical School，Beijing 100039，China；2.Department of Hepatology，The Fifth Medical Center of PLA General Hospital，Beijing 100039，China；3.School of Pharmacy，Hubei University of Science and Technology，Xianning，Hubei 437100，China）

Corresponding author：YANG Yongping，yongpingyang@hotmail.com（ORCID：0000-0002-8307-1095）

Abstract：Objective To investigate the expression of disulfidptosis-related genes in hepatocellular carcinoma（HCC）and the prognostic value of disulfidptosis in HCC，to construct a prognostic model，and to analyze its impact on the biological processes ofHCC and sorafenib resistance.Methods The TCGA-LIHC database was used to collect the mRNA expression profiles and corresponding clinical data of HCC patients，and the LASSO-Cox regression algorithm was used to construct a four-gene predictive model for prognosis in the TCGA cohort.The external datasets ICGC and GSE14520 were used to validate the prognostic efficacy of the model，and the Cancer Drug Sensitivity Genomics（GDSC）data were used to investigate the value of the disulfidptosis model in predicting sorafenib treatment response，and gene ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）analyses were used to investigate the biological functions of disulfidptosis-related genes.The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups，and the chi-square test was used for comparison of categorical data between two groups.The Kaplan-Meier curve and the log-rank test were used to evaluate the difference in prognosis，and univariate and multivariate Cox regression analyses were used to investigate whether risk score was an independent influencing factor for patient prognosis.Results The univariate Cox regression analysis in the TCGA cohort showed that seven known disulfidptosis-related genes were significantly associated with overall survival（OS）in HCC（all Plt;0.05）.The LASSO-Cox regression analysis was used to construct a prognostic model based on disulfidptosis-related genes（DRG），and the risk score RS-DRG was calculated as RS-DRG=（0.061 6）×GYS1 expression level+（0.152 8）×LRPPRC expression level+（0.268 3）×RPN1 expression level+（0.183 5）×SLC7A11 expression level.The log-rank test showed that the patients with a high risk score based on the disulfidptosis model had a significantly lower OS than those with a low risk score（Plt;0.001）.Based on the results of the multivariate Cox regression analysis，risk score was an independent predictive factor for OS in both TCGA and ICGC cohorts（TCGA：hazard ratio［HR］=1.869，P=0.002；ICGC：HR=3.469，P=0.004）.The Spearman correlation analysis showed that RS-DRG was significantly positively correlated with the infiltration level of various immune cells（including B lymphocytes，CD4+T lymphocytes，neutrophils，macrophages，and dendritic cells）in tumor microenvironment（all Plt;0.05）.The patients in the high-risk score group had a significantly lower IC50 value of sorafeniband were more sensitive to sorafenib（Plt;0.001）.The KEGG/GO enrichment analysis showed that the differentially expressed disulfidptosis-related genes were significantly enriched in various mitosis-related molecular functions.Conclusion This study constructed a novel prognostic model based on disulfidptosis-related genes，which has a potential clinical value in predicting the prognosis of HCC，and targeting disulfidptosis-related genes may provide a promising approach for HCC treatment.

Key words：Carcinoma，Hepatocellular；Disulfides；Computational Biology；Proportional Hazards Models

Research funding：The State Key Projects Specialized on Infectious Disease，Chinese Ministry of Science and Technology（2018ZX10725506）；Research and Translational Application of Clinical Characteristic Diagnosis and Treatment Technology in the Capital（Z221100007422002）

肝細(xì)胞癌（HCC）被公認(rèn)為全球第六大常見腫瘤，并且是導(dǎo)致肝硬化患者死亡的主要原因之一［1］。據(jù)預(yù)測，其發(fā)病率在未來還將有所上升［2］。盡管目前存在有效的治療方案，但患者的總體生存率仍然較低，晚期患者的5年生存率僅為10%［3］。高度的異質(zhì)性和復(fù)發(fā)率是HCC治療的重大挑戰(zhàn)，影響預(yù)后預(yù)測［4］。因此，迫切需要闡明HCC的分子機(jī)制，開發(fā)可以作為診斷和治療靶點(diǎn)的新型分子，以改善HCC患者的臨床預(yù)后。

近期研究揭示了一種新型細(xì)胞死亡方式——雙硫死亡，這是一種獨(dú)立于已知細(xì)胞死亡途徑的程序性細(xì)胞死亡方式。當(dāng)細(xì)胞過度表達(dá)SLC7A11時(shí)，在葡萄糖缺乏條件下會出現(xiàn)NADPH分子供應(yīng)不足，導(dǎo)致無法將胱氨酸還原為半胱氨酸，引發(fā)二硫化物的積累，進(jìn)而在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架蛋白中形成異常的二硫鍵。隨著這種積累的繼續(xù)，最終會導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白崩潰，細(xì)胞因此迅速死亡［5］。

目前，二硫化物代謝與癌癥之間的緊密聯(lián)系備受關(guān)注［6］。在過度表達(dá)SLC7A11的癌細(xì)胞中，抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體可以誘導(dǎo)二硫化物的耗竭，進(jìn)而顯著阻礙腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］。由于HCC細(xì)胞對氧化應(yīng)激顯示出高度敏感性［8］，并且SLC7A11在HCC組織中表達(dá)顯著，因此，以雙硫死亡通路為治療靶點(diǎn)成為HCC治療的新策略。然而，要深入了解雙硫死亡的具體機(jī)制并評估其在HCC中的治療潛力，仍需要進(jìn)一步研究。本研究收集了HCC患者的mRNA表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)，包括TCGA、ICGC和GEO數(shù)據(jù)庫。在TCGA-LIHC隊(duì)列中，建立了一個(gè)以雙硫死亡相關(guān)基因?yàn)榛A(chǔ)的4基因預(yù)后模型，通過時(shí)間依賴性受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析檢測了風(fēng)險(xiǎn)評分的預(yù)測準(zhǔn)確性，并通過ICGC-LIRI-JP和GSE14520（GPL3721）隊(duì)列驗(yàn)證其可靠性。隨后，通過深入進(jìn)行功能富集分析，探討了雙硫死亡調(diào)節(jié)HCC發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制。最后，結(jié)合藥物敏感性數(shù)據(jù)分析了雙硫死亡對HCC患者索拉非尼治療效果的影響。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集和整理從TCGA-LIHC數(shù)據(jù)庫中獲取了包含371例HCC患者的三級RNA測序數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息。為確保數(shù)據(jù)的一致性，采用了“edgeR”軟件包中的縮放方法，對基因表達(dá)譜進(jìn)行了歸一化處理。為了驗(yàn)證結(jié)果的穩(wěn)定性，引入了ICGC-LIRI-JP項(xiàng)目的231個(gè)HCC樣本和GSE14520（GPL3721）的225個(gè)HCC樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床信息進(jìn)行隊(duì)列驗(yàn)證。所有數(shù)據(jù)均符合TCGA、ICGC和GEO的數(shù)據(jù)訪問和發(fā)布政策，并且是公開可獲取的。為了深入探索SLC7A11在HCC組織不同細(xì)胞群中的表達(dá)水平，收集了GSE146409中經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量控制和細(xì)胞類型注釋的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，以確保分析的準(zhǔn)確性。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Huh7和HepG2細(xì)胞購買自American Type Culture Collection（ATCC）。細(xì)胞在含有10%FBS、10 U/mL青霉素和10 g/mL鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中生長。為了研究SLC7A11對肝癌細(xì)胞在葡萄糖缺乏環(huán)境下雙硫死亡的調(diào)控，使用Entranster-H4000（恩格林，中國）將SLC7A11過表達(dá)質(zhì)粒（擎科生物，中國）轉(zhuǎn)染到HCC細(xì)胞中。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）為了從樣本中提取總RNA，使用了TRIzol試劑（Thermo，Ambion）進(jìn)行細(xì)胞裂解。隨后，反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?5℃進(jìn)行5 min，55℃進(jìn)行30 min，75℃進(jìn)行10 min，接著使用SuperScriptⅢPlatinum一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒（Thermo Fisher Scientific，inc.）和SYBR qPCR Mix（Low ROX）（Genstar，Columbia）準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系。PCR的溫度循環(huán)條件如下：95℃57 s，95℃16 s，56.5℃33 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。SLC7A11的PCR正向引物：5'-TCTCCAAA GGAGTTACCTGC-3'；反向引物：3'-AGACTCCCCTCA GGTAAAGTGAC-5'。

1.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞蛋白提取后采用了雙唑酮酸（BCA）試劑盒進(jìn)行蛋白定量，并使用Western Blot進(jìn)行蛋白質(zhì)測定。SLC7A11抗體購買自MERCK公司（1∶1 000，GSAB5700735），次級抗體采用辣根過氧化物酶標(biāo)記，并使用ECL試劑盒（Promega，W1015）進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測。

1.5雙硫死亡指標(biāo)檢測采用NADP+/NADPH檢測試劑盒（WST-8法）（碧云天）、ATP檢測試劑盒（碧云天）和胱氨酸攝取熒光法測試盒（Elabscience）分別進(jìn)行NAPDH、ATP和胱氨酸攝取率檢測。所有操作均按照說明書進(jìn)行。

1.6構(gòu)建和驗(yàn)證雙硫死亡相關(guān)預(yù)后模型從已發(fā)表的文獻(xiàn)中確定了10個(gè)與雙硫死亡相關(guān)的基因（disulfidptosis-related gene，DRG）。使用“circlize”軟件包評估這些基因在HCC中的相互關(guān)系，并進(jìn)行可視化。采用單因素Cox分析法評估DRG對總生存期（OS）的影響。為防止過度擬合，使用“glmnet”軟件包中的LASSO-Cox回歸算法構(gòu)建預(yù)后模型。候選預(yù)后DRG的歸一化表達(dá)矩陣作為自變量，患者OS作為響應(yīng)變量。通過十倍交叉驗(yàn)證確定了模型的懲罰參數(shù)λ，選擇偏離度部分似然值最低的λ值。根據(jù)基因的歸一化表達(dá)水平和回歸系數(shù)計(jì)算患者風(fēng)險(xiǎn)評分，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。之后，對風(fēng)險(xiǎn)評分的預(yù)測準(zhǔn)確性進(jìn)行時(shí)間依賴性ROC分析；同時(shí)，進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，以研究風(fēng)險(xiǎn)評分是否獨(dú)立影響患者預(yù)后。

1.7免疫浸潤相關(guān)性分析為了確保免疫評分評估的準(zhǔn)確性，采用TIMER算法中的“immuneconv”軟件包進(jìn)行免疫評分分析，考慮組織特異性估算免疫細(xì)胞數(shù)量。因數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，使用Spearman相關(guān)性分析評估DRG與免疫評分的相關(guān)性。

1.8免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性分析從TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中提取了SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3和PDCD1LG2等免疫檢查點(diǎn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)值進(jìn)一步分析。根據(jù)SLC7A11的中位表達(dá)水平，將TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中的HCC樣本分為兩組。研究兩組間免疫檢查點(diǎn)表達(dá)水平差異。

1.9功能富集分析根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評分，TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP項(xiàng)目中的HCC患者被分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，分析兩組之間差異表達(dá)基因（DEG）（|LogFC|≥1，Padjlt;0.05）。兩個(gè)數(shù)據(jù)集的DEG交集被視為可靠的雙硫死亡風(fēng)險(xiǎn)差異基因（RDDG）。為了深入了解RDDG的生物學(xué)功能，使用R軟件包\"clusterProfiler\"進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因組百科全書（KEGG）分析。為了校正多重檢驗(yàn)，使用本杰明-霍奇伯格方法調(diào)整這些分析得出的P值。

1.10索拉非尼治療反應(yīng)評估每個(gè)樣本的索拉非尼治療反應(yīng)預(yù)測均基于最大的公開藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫——癌癥藥物敏感性基因組學(xué)進(jìn)行。預(yù)測過程采用“pRRophetic”軟件包實(shí)現(xiàn)。樣本的半數(shù)最大抑制濃度（IC50）通過脊回歸估算得出，所有參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值。為消除不同組織和組織類型之間的批次效應(yīng)，對重復(fù)基因表達(dá)量進(jìn)行平均處理。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R軟件（4.0.3版）進(jìn)行。為了比較腫瘤和鄰近非腫瘤組織的基因表達(dá)水平，采用成組t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。采用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗(yàn)評估預(yù)后差異；采用單因素和多因素Cox回歸分析研究風(fēng)險(xiǎn)評分是否獨(dú)立影響患者預(yù)后。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 SLC7A11在HCC中的差異表達(dá)和潛在生物學(xué)功能在TCGA-LIHC隊(duì)列中，與癌旁組織相比，SLC7A11在HCC中表達(dá)明顯升高（圖1a）。根據(jù)GSE146409數(shù)據(jù)集的單細(xì)胞測序結(jié)果分析各細(xì)胞簇（圖1b），在具有惡性增殖能力的癌細(xì)胞中SLC7A11的表達(dá)量相比于正常肝細(xì)胞大幅增加（圖1c）。為了深入研究，根據(jù)SLC7A11在TCGA-LIHC隊(duì)列中的中位表達(dá)水平，將HCC組織分為高SLC7A11組和低SLC7A11組。高SLC7A11組的多種免疫細(xì)胞浸潤顯著增加，包括B淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（圖1d）。此外，高SLC7A11組中免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因CD274、CTLA4、HAVCR2、PDCD1、PDCD1LG2和TIGIT的表達(dá)水平也顯著上調(diào)（圖1e）。以上結(jié)果提示，SLC7A11可能在HCC的免疫微環(huán)境中扮演重要角色。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SLC7A11在肝癌細(xì)胞中相對于正常肝細(xì)胞的表達(dá)差異，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在HepG2和Huh7細(xì)胞中，SLC7A11的表達(dá)量顯著高于LO2細(xì)胞（圖1f）。在HepG2和Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SLC7A11過表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western Blot實(shí)驗(yàn)，提示SLC7A11的mRNA（圖1g、h）和蛋白（圖1i、j）表達(dá)均增加。給予低葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，CCK8實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染了SLC7A11過表達(dá)質(zhì)粒的HepG2和Huh7細(xì)胞活力相比轉(zhuǎn)染了空載體的HepG2和Huh7細(xì)胞活力顯著下降（圖1k、l）。此外，在給予低葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，過表達(dá)SLC7A11的HCC細(xì)胞中表現(xiàn)出更低的NADPH水平（圖2a），更低的ATP水平（圖2b）和更高的胱氨酸攝取率（圖2c），證明了在肝癌細(xì)胞中SLC7A11過表達(dá)在葡萄糖缺乏的環(huán)境下引起肝癌細(xì)胞雙硫死亡。

2.2 TCGA隊(duì)列中預(yù)后相關(guān)DRG的鑒定在HCC組織中，與配對的鄰近組織相比，所有DRG的表達(dá)水平均顯著升高（圖3a），其中7個(gè)DRG在單因素Cox回歸分析中與OS有顯著相關(guān)性，包括GYS1、OXSM、LRPPRC、NCKAP1、RPN1、SLC3A2和SLC7A11（圖3b）。

2.3依據(jù)TCGA隊(duì)列構(gòu)建預(yù)后模型通過LASSO-Cox回歸分析，構(gòu)建一個(gè)納入DRG的預(yù)后模型（圖4a、b）。使用最小λ值0.040 1，并計(jì)算了雙硫死亡基因相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評分（RS-DRG），具體公式如下：RS-DRG=0.061 6×GYS1表達(dá)水平+0.152 8×LRPPRC表達(dá)水平+0.268 3×RPN1表達(dá)水平+0.183 5×SLC7A11表達(dá)水平。

根據(jù)RS-DRG的中位值，將患者分為高RS-DRG組（n=185）和低RS-DRG組（n=185）。TCGA隊(duì)列中高RS-DRG與高AFP水平、更高的組織學(xué)分級以及晚期病理分期有顯著的相關(guān)性（Plt;0.05）（附錄A）。圖4c顯示，與低RS-DRG組相比，高RS-DRG組的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)更高。此外，Kaplan-Meier生存曲線也證實(shí)，高RS-DRG組患者的總體生存概率明顯低于低RS-DRG組（Plt;0.001）（圖4d）。使用時(shí)間依賴的ROC曲線評估了風(fēng)險(xiǎn)評分對OS的預(yù)測能力，結(jié)果顯示在1、3和5年時(shí)的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.765、0.681和0.611（圖4e）。最后，對RS-DRG進(jìn)行免疫評分分析，結(jié)果顯示RS-DRG與腫瘤微環(huán)境中的多種免疫細(xì)胞類型（包括B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的浸潤水平呈顯著正相關(guān)（P值均lt;0.05）（圖4f）。

2.4外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證預(yù)后模型在ICGC隊(duì)列中，經(jīng)過生存期分析驗(yàn)證，除了CYS1（Padjlt;0.05）以外，其他3個(gè)基因（LRPPRC、RPN1和SLC7A11）均與不良的OS有顯著的相關(guān)性（圖5a）。為了評估這個(gè)基于TCGA隊(duì)列構(gòu)建的模型的穩(wěn)定性，采用了同樣的公式計(jì)算中位數(shù)，將ICGC隊(duì)列的患者也區(qū)分為高RS-DRG組和低RS-DRG組。在ICGC隊(duì)列中，高RS-DRG組患者與更高級的TNM分期以及更多的門靜脈和靜脈侵犯有顯著的相關(guān)性（P值均lt;0.05）（附錄B）。相較于低RS-DRG組，高RS-DRG組的患者面臨更高的早期死亡風(fēng)險(xiǎn)（圖5b），并且其生存率也顯著較低（Plt;0.001）（圖5c）。此外，該模型在預(yù)測1、2、3年生存率時(shí)的AUC分別為0.723、0.746、0.771（圖5d）。

同樣地，GSE14520隊(duì)列中的患者也被分為高RS-DRG組和低RS-DRG組。與低RS-DRG組相比，高RS-DRG組的患者早期死亡概率更高（圖5e），其生存時(shí)間也顯著較短（P=0.028）（圖5f）。在該隊(duì)列中，該模型在預(yù)測預(yù)測1、2、3年生存率時(shí)的AUC分別為0.585、0.620、0.576（圖5g）。

2.5 RS-DRG風(fēng)險(xiǎn)評分的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值在TCGA和ICGC兩個(gè)隊(duì)列中，單因素和多因素Cox回歸分析均顯示RS-DRG風(fēng)險(xiǎn)評分為OS的獨(dú)立影響因子（P值均lt;0.05）（圖6）。此外，在GSE14520（GPL3721）隊(duì)列中進(jìn)行的單因素Cox回歸分析也顯示，RS-DRG與OS之間存在顯著關(guān)聯(lián)（HR=1.608，95%CI：1.050～2.464，P=0.029）。但在該隊(duì)列的多因素分析中，RS-DRG并未顯示出作為OS獨(dú)立預(yù)測因子的能力（HR=1.501，95%CI：0.964～2.336，P=0.072）。

2.6 RS-DRG風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)測HCC患者使用索拉非尼治療的反應(yīng)在評估HCC藥物療效和反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)組的患者索拉非尼IC50值更低，索拉非尼治療效果更好（圖7a），RS-DRG預(yù)測索拉非尼反應(yīng)的AUC達(dá)0.791（圖7b）。進(jìn)一步評估RS-DRG中4個(gè)基因與索拉非尼敏感性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GYS1、LRPPRC、RPN1和SLC7A11的表達(dá)均與治療反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)（Padjlt;0.05）（圖7c～f）。

2.7 TCGA和ICGC隊(duì)列中RS-DRG風(fēng)險(xiǎn)評分功能分析為了深入了解與RS-DRG相關(guān)的生物學(xué)功能和通路，通過結(jié)合TCGA和ICGC隊(duì)列中的DEG（|LogFC|gt;1；Padjlt;0.05）鑒定了可靠的RDDG（圖8a～c），并進(jìn)行了GO富集和KEGG通路分析。結(jié)果符合預(yù)期，顯示出RDDG顯著富集于多種有絲分裂相關(guān)的分子功能，如核分裂、有絲分裂中的微管細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞器裂變以及有絲分裂紡錘體組織等（Padjlt;0.05）。同時(shí)，也揭示出RDDG在細(xì)胞基底部分、基質(zhì)膜和質(zhì)膜上的富集（Padjlt;0.05）（圖8d）。此外，PPI網(wǎng)絡(luò)分析揭示出相互作用的核心蛋白主要集中于調(diào)控細(xì)胞周期和有絲分裂的蛋白上（相互作用得分閾值為0.7，高置信度）（圖8e）。最后對TCGA-LIHC和ICGC項(xiàng)目中的DEG執(zhí)行了GSEA富集分析，結(jié)果顯示主要富集于細(xì)胞連接組織、過氧物酶體和角質(zhì)化等通路（Padjlt;0.05）（圖8f）。

3討論

本研究探索了4個(gè)與雙硫死亡有關(guān)的基因，通過Lasso-Cox方法構(gòu)建了一個(gè)新型HCC預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，并在2個(gè)外部獨(dú)立隊(duì)列（ICGC；GSE14520）中進(jìn)行了模型驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，雙硫死亡風(fēng)險(xiǎn)評分與HCC的免疫浸潤程度有顯著關(guān)聯(lián)，且較低的雙硫死亡風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)示著HCC患者索拉非尼的治療效果更佳。進(jìn)一步的功能分析揭示了肝癌細(xì)胞中雙硫死亡與細(xì)胞有絲分裂過程以及細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的緊密聯(lián)系。重要的是，研究首次揭示了雙硫死亡與HCC預(yù)后之間的相互作用，為當(dāng)前對該疾病的理解提供了新的視角。

在高表達(dá)SLC7A11的癌細(xì)胞中，葡萄糖缺乏所引發(fā)的雙硫死亡與過去研究中觀察到的細(xì)胞凋亡存在顯著差異。Liu等［5］的研究取得了重大突破，抑制二硫化物的積累能有效防止細(xì)胞在葡萄糖缺乏的環(huán)境中死亡，從而確立了這種特殊類型的細(xì)胞死亡與二硫化物應(yīng)激之間的直接聯(lián)系。HCC的腫瘤微環(huán)境常伴隨著缺氧狀況［9］。SLC7A11在腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于其周圍正常組織。此外，單細(xì)胞分析進(jìn)一步顯示，具有高強(qiáng)度惡性增殖能力的HCC細(xì)胞中，SLC7A11的表達(dá)水平更高。因此，本研究結(jié)果表明，相較于鄰近的正常組織，HCC組織對缺氧環(huán)境引發(fā)的雙硫死亡表現(xiàn)出更高的敏感性。該發(fā)現(xiàn)開啟了一個(gè)全新的研究窗口，即針對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行治療，以在HCC細(xì)胞中誘導(dǎo)雙硫死亡的產(chǎn)生，同時(shí)保護(hù)正常細(xì)胞。這是一個(gè)充滿希望的研究途徑，有望在未來為HCC的治療提供新的策略。

HCC的高度異質(zhì)性導(dǎo)致了不同的臨床結(jié)果和治療反應(yīng)［10］。靶向雙硫死亡有望成為治療HCC的新策略。為了深入探索這一可能性，本研究聚焦于雙硫死亡如何抑制HCC的進(jìn)展，建立了一個(gè)由4個(gè)基因構(gòu)成的新型雙硫死亡預(yù)后模型：SLC7A11、LRPPRC、GYS1和RPN1。這4個(gè)基因都在HCC的發(fā)展和免疫浸潤中扮演了重要角色。SLC7A11的高表達(dá)會增加胱氨酸的攝取，進(jìn)而導(dǎo)致二硫化物的積累和隨后的二硫化物應(yīng)激反應(yīng)［11］。然而，在葡萄糖缺乏的環(huán)境中，由于磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的NADPH有限，細(xì)胞無法有效應(yīng)對這種二硫化物應(yīng)激［5］。GYS1是一個(gè)在糖原合成中起關(guān)鍵作用的酶，它在缺氧條件下會被迅速誘導(dǎo)，并與糖原積累呈正相關(guān)。盡管過去的腫瘤學(xué)研究表明GYS1的表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，但它對HCC的具體影響仍然未知［12-13］。LRPPRC參與線粒體的氧化磷酸化過程，在HCC組織中顯著上調(diào)，并與更高級的病理分期、更低的總生存率和無病生存率有關(guān)［14-15］。有趣的是，抑制GYS1和LRPPRC可以與葡萄糖饑餓協(xié)同作用，從而誘導(dǎo)雙硫死亡［5］。RPN1編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種N-寡糖轉(zhuǎn)移酶［16］，是雙硫死亡過程中必不可少的基因，但其潛在機(jī)制仍不清楚。綜上所述，預(yù)后模型中的所有基因都與調(diào)節(jié)細(xì)胞雙硫死亡相關(guān)，且每一個(gè)都是導(dǎo)致HCC預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)因素。

盡管對于雙硫死亡與癌癥的關(guān)系已有一定了解［6］，但腫瘤免疫與雙硫死亡之間的具體作用仍不明確。在HCC中，雙硫死亡風(fēng)險(xiǎn)特征模型評分與免疫細(xì)胞浸潤之間存在顯著相關(guān)性，進(jìn)一步證明了雙硫死亡機(jī)制與免疫浸潤之間的密切關(guān)系。筆者分析表明，HCC患者中出現(xiàn)較高雙硫死亡風(fēng)險(xiǎn)與腫瘤微環(huán)境中B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤增加有關(guān)。然而，雙硫死亡如何影響抗腫瘤免疫細(xì)胞的具體功能和機(jī)制尚未明了，還需要實(shí)驗(yàn)室和臨床研究的進(jìn)一步證據(jù)。

本研究觀察到RS-DRG評分與HCC患者接受索拉非尼治療的敏感性之間存在顯著相關(guān)性。一些研究人員［17］提出，索拉非尼通過誘導(dǎo)鐵死亡來對HCC產(chǎn)生抑制作用。本研究中，RS-DRG值高的患者，其索拉非尼的IC50值較低，這意味著對索拉非尼的治療反應(yīng)更為敏感。因此，這部分患者可以被視為索拉非尼治療的理想人選。在臨床治療中，臨床醫(yī)生可以根據(jù)患者的基因檢測結(jié)果預(yù)測患者的雙硫死亡風(fēng)險(xiǎn)，從而更有效地指導(dǎo)患者進(jìn)行索拉非尼的靶向治療。然而，對于RS-DRG值較低的HCC患者，可能代表了對索拉非尼治療具有耐藥性的特定亞組。通過深入了解這些發(fā)現(xiàn)，可以為這一特定亞群探索潛在的治療方法，這有助于克服索拉非尼的耐藥性，從而提高療效。

在研究不同風(fēng)險(xiǎn)組之間的DEG時(shí)，進(jìn)行了GO和KEGG分析，觀察到與有絲分裂相關(guān)的各種分子功能出現(xiàn)富集，包括核分裂、微管細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞器裂變和有絲分裂紡錘體組織等。從雙硫死亡的分子學(xué)機(jī)制上判斷，這很有可能是由于葡萄糖缺乏的環(huán)境下，SLC7A11過表達(dá)的肝癌細(xì)胞內(nèi)二硫化物異常積累，影響了細(xì)胞有絲分裂中紡錘體的形成。Liu等［5］發(fā)現(xiàn)，二硫化物積累導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架蛋白中的二硫鍵異常，肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)崩潰，隨后細(xì)胞死亡。本研究首次提出，HCC細(xì)胞的雙硫死亡可能與細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期關(guān)系密切。這一新穎發(fā)現(xiàn)表明，細(xì)胞骨架蛋白中二硫鍵的形成以及細(xì)胞分裂初始階段紡錘體的形成過程和運(yùn)動(dòng)功能與二硫化物積累誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡之間存在潛在聯(lián)系。本研究為了解HCC進(jìn)展的內(nèi)在機(jī)制開辟了新的途徑。然而，要驗(yàn)證和支持這一假設(shè)，還迫切需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種基于肝癌細(xì)胞雙硫死亡機(jī)制的新型HCC預(yù)后模型，并驗(yàn)證了該模型在TCGA數(shù)據(jù)庫中能夠獨(dú)立預(yù)測HCC患者的總體生存率，同時(shí)通過外部數(shù)據(jù)集（ICGC；GSE14520）進(jìn)一步確認(rèn)了其預(yù)測性能。此外，研究還揭示了雙硫死亡與HCC腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤以及索拉非尼治療反應(yīng)之間的潛在關(guān)聯(lián)，為深入了解HCC的生物學(xué)機(jī)制提供了新的線索。研究還發(fā)現(xiàn)雙硫死亡與細(xì)胞有絲分裂之間存在潛在關(guān)聯(lián)，這一發(fā)現(xiàn)為探索HCC的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制提供了新的視角。這些結(jié)果不僅有助于加深對HCC生物學(xué)特性的理解，還可能為開發(fā)更有效的治療策略提供重要參考。

但本研究也存在一些局限性。首先，面臨著缺乏前瞻性真實(shí)世界數(shù)據(jù)的問題，這無疑阻礙了確認(rèn)其臨床實(shí)用性的能力。因此，為了在真實(shí)世界環(huán)境中驗(yàn)證該模型的有效性，利用前瞻性數(shù)據(jù)開展進(jìn)一步的研究是至關(guān)重要的。其次，依靠單一標(biāo)志構(gòu)建預(yù)后模型的固有局限性，這可能會導(dǎo)致預(yù)后評估的不準(zhǔn)確和偏差。為了克服這個(gè)問題，未來的研究可以考慮結(jié)合多個(gè)標(biāo)志或因素，以更全面和準(zhǔn)確地預(yù)測患者的預(yù)后情況。此外，必須強(qiáng)調(diào)的是，本研究中涉及的關(guān)鍵環(huán)節(jié)即雙硫死亡和有絲分裂之間的具體關(guān)系尚未得到實(shí)驗(yàn)研究或闡明。雖然本研究確定了這兩種現(xiàn)象之間的潛在聯(lián)系，但要充分了解其潛在機(jī)制并闡明二者之間相互作用的性質(zhì)，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：宋錚、羅維參與研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程以及論文起草；常秀娟修改文章內(nèi)容；楊永平設(shè)計(jì)研究思路。

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收稿日期：2023-12-25；錄用日期：2024-03-18

本文編輯：劉曉紅

引證本文：SONG Z， LUO W， CHANG XJ， et al. Construction of a novel disulfidptosis-related prognostic model for patients with hepatocellular carcinoma based on bioinformatics analysis [J]. J Clin Hepatol， 2024， 40（9）： 1822-1832.

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