花粉直感對李果實香氣成分的影響

關(guān)鍵詞：李；花粉直感；HS-SPME-GC-MS；香氣成分；主成分分析

李PrunussalicinaLindl.屬于薔薇科Rosaceae李屬Prunus植物，果實色澤鮮艷、口感豐富、富含多種有機酸、維生素及礦物質(zhì)，在我國具有悠久的栽培歷史。但由于品質(zhì)參差不齊，人均消費量在世界各地普遍偏低。因此，改善果實風(fēng)味對于提高消費量具有重要意義[1]。其中，果實香氣物質(zhì)種類和含量是區(qū)分不同品種、新鮮度、成熟度和評價果實風(fēng)味的重要指標[2]。水果本身具有的特異香氣能夠提高食欲，提升果實香氣是提高果實品質(zhì)和商業(yè)價值的重要途徑[3]。為滿足不同人群對李果實的要求，實現(xiàn)品種改良升級，果實香氣育種逐漸成為研究的熱門領(lǐng)域。探究花粉直感對不同李品種香氣成分的影響，對于明確香氣成分、選取適宜授粉品種、提高坐果率和品質(zhì)研究具有重要意義。王寶俠等[4]在探究‘塞外紅’果實花粉直感效應(yīng)中指出，‘龍豐’和‘紫秋香’授粉的‘塞外紅’果實中具有較濃果香味的酯類香氣成分。不同授粉品種對‘福麗’蘋果品質(zhì)研究中也指出，‘福九紅’和‘福蕾’授粉的蘋果果實香氣成分及含量顯著提高，其中乙酸己酯含量變化最為顯著[5]。香氣種類和含量差異是呈現(xiàn)各異香氣特征的主要原因?，F(xiàn)已在李果實中檢測出醇、酯、醛、酮、萜和酚等香氣成分100多種，其中醇類、酯類和醛類含量占比最高[6-7]。香氣強度值（odoractivityvalue，OAV）是鑒定香氣成分對果實香氣貢獻作用大小的有效評價方法，OAV越大，貢獻越大[8]。王華瑞等[9]對‘黑寶石’李香氣測定時發(fā)現(xiàn)，3-羥基-2-丁酮、乙酸丁酯、γ-十二內(nèi)酯等香氣物質(zhì)是其果實主要成分。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)苯、1，2-二甲氧基-4-（1-丙烯基）、苯甲酸、2，6-壬二烯醛等香氣成分是‘空心李’的主要香氣成分。目前，對花粉直感效應(yīng)的研究主要集中在蘋果、梨和柑橘。關(guān)于李果實品質(zhì)的研究主要集中在果實大小、糖酸組分和花色苷含量，對香氣育種的調(diào)查僅通過嗅覺來辨別香氣的有無[11]。本研究選取北方地區(qū)優(yōu)質(zhì)的3個李主栽品種‘大紅袍’‘秋姬’‘紅壽’，針對‘大紅袍’飽滿多汁、香氣濃郁，經(jīng)濟價值高但產(chǎn)量偏低，‘秋姬’早果性好、豐產(chǎn)性強，極晚熟、大果型，‘紅壽’早熟、品質(zhì)優(yōu)，紅肉、豐產(chǎn)但香味淡等特點設(shè)置雜交組合。通過研究不同授粉組合的果實香氣成分及含量，明確花粉直感對李果實的影響，為李的生產(chǎn)栽培和種質(zhì)創(chuàng)制提供參考。

1材料與方法

1.1試驗地概況

在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所李名優(yōu)品種試驗區(qū)內(nèi)開展試驗。研究所位于遼寧省興城市（120°06′～120°50′E，40°16′～40°50′N）。該地區(qū)地處于北溫帶半濕潤大陸性氣候區(qū)，四季分明，氣候溫和，光照充足，年平均氣溫8.7℃，年平均降水量600mm，雨熱同季，無霜期175d左右。試驗地土壤為黃壤土，黏性中等，土層深厚，灌溉條件和管理水平一般。

1.2試驗材料

通過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)‘秋姬’ב紅壽’和‘秋姬’ב大紅袍’當年坐果率較低，不滿足本試驗設(shè)計，故本試驗共只設(shè)置7個處理，包括3個品種的自交（‘紅壽’‘秋姬’‘大紅袍’）和4個雜交組（‘紅壽’ב秋姬’、‘紅壽’ב大紅袍’、‘大紅袍’ב秋姬’、‘大紅袍’ב紅壽’）。

1.3方法

1.3.1花粉采集與授粉

2021年3月，選取10年生‘紅壽’‘秋姬’‘大紅袍’花蕾，人工剝?nèi)』ㄋ幒笾糜谑覂?nèi)，常溫陰干后保存待用。同年4月，選擇樹勢、樹形、長勢良好、管理水平相對一致的10年生‘紅壽’‘大紅袍’為授粉母本，疏花后人工去雄，采用自然授粉模擬生產(chǎn)上噴灑花粉的方式授粉并掛牌標記。

1.3.2取樣

由于不同品種果實成熟期間存在差異，在各個品種果實成熟時（2021年7—9月）分批采收。每種組合選取30個大小均一、色澤均勻、無機械損傷、無病蟲害的果實，采摘后立即帶回實驗室進行樣品處理。

1.4測定

參照王陽等[12]的方法，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)包括10個果實。果實去核后經(jīng)研磨制成果漿，按照果漿和氯化鈉質(zhì)量比5∶1稱取8g的果漿和1.6g的氯化鈉固體，置于20mL樣品瓶內(nèi)。每個樣品瓶中加20μL濃度為8.75mg/L的3-辛醇溶液，橡膠隔片密封后上機測定各果實香氣成分（TSQQuantumXLS氣質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技，美國）。

固相微萃取條件：用50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭（美國Supelco公司）對樣品進行萃取，萃取30min，孵化溫度60℃，在GC進樣口進行解吸附，解吸附3min，老化時間10min，老化溫度250℃。

色譜條件：色譜柱，HP-INNOWAX（60m×0.25mm×0.25μm，美國安捷倫科技公司），萃取頭（50/30μmDVB/CAR/PDMS）；程序升溫至250℃，進樣口溫度250℃，連接口溫度280℃，載氣為高純氦氣，不分流進樣，流速1mL/min；程序升溫，起始溫度為30℃，保持5min，先以3℃/min速率升溫至210℃，保持5min，再以10℃/min速率升溫至250℃，保持5min。

質(zhì)譜條件：電子能量70eV，離子源溫度230℃，掃描模式為scan。

參考王珊珊等[7]的數(shù)據(jù)分析方法，測定香氣成分、香氣含量和香氣強度值。

香氣成分采用質(zhì)譜全離子掃描，對采集的總離子流與NIST11譜庫進行譜圖分析，結(jié)合保留指數(shù)（RI）確定香氣成分。

香氣成分含量根據(jù)檢測出的香氣成分的峰面積、內(nèi)標物的峰面積和含量進行比較，計算得出。

香氣強度值（OAV）=香氣成分含量/香氣成分閾值。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Office2010進行數(shù)據(jù)整理，采用Origin2024和SPSS20.0軟件進行熱圖及主成分分析，利用OmicSharetools進行Upset維恩圖分析。

2結(jié)果與分析

2.1花粉直感對不同組合果實香氣成分種類的影響

如圖1所示，在7個組合中共鑒定出了46種香氣物質(zhì)，包含16種酯類、12種醛類、11種醇類、4種酮類和3種其他化合物。

‘秋姬’自交授粉果實香氣成分種數(shù)最為豐富，共檢測出31種香氣成分物質(zhì)；‘紅壽’自交授粉果實香氣成分種數(shù)最少，僅有17種；‘大紅袍’自交授粉果實香氣成分數(shù)量在兩者之間，檢測出香氣成分23種?！t壽’ב秋姬’果實的醛類和其他香氣物質(zhì)的種類數(shù)均多于‘紅壽’自交授粉果實，酯類、醇類和酮類香氣物質(zhì)種類與‘紅壽’自交授粉數(shù)量相同?！t壽’ב秋姬’果實的酯類、醛類、醇類香氣物質(zhì)種數(shù)少于‘秋姬’自交授粉果實，酮類和其他香氣物質(zhì)與‘秋姬’自交授粉種數(shù)相同?！t壽’ב大紅袍’除醛類和醇類外，其他類香氣物質(zhì)種類均多于‘紅壽’自交授粉，但醛類、酯類、醇類物質(zhì)種數(shù)少于‘大紅袍’自交授粉?！蠹t袍’ב秋姬’果實的酯類、醛類、醇類及酮類物質(zhì)種類與‘大紅袍’‘秋姬’自交授粉相比，都出現(xiàn)不同程度的減少；‘大紅袍’ב紅壽’果實香氣物質(zhì)種類明顯高于‘大紅袍’‘紅壽’自交授粉。

在7個組合李果實香氣成分含量中，醇類香氣成分數(shù)量為5～8種；酯類香氣成分數(shù)量為4～13種；醛類香氣成分數(shù)量為4～11；酮類物質(zhì)香氣成分數(shù)量較少，為1～3種；其他類香氣成分數(shù)量在1～3種。7個組合果實中，共同擁有的香氣成分有12種，包含丁酸甲酯、反式-2-己烯-1-醇、2-己醇甲醚、正己醛、2-乙基己醇、反式-2-己烯醛、2-己烯醛、里那醇、壬醛、乙酸己酯、乙酸葉醇酯、大馬士酮。‘秋姬’‘大紅袍’‘紅壽’自交授粉的果實共有的香氣成分物質(zhì)有15種；‘紅壽’自交授粉無獨有的香氣成分；‘紅壽’ב秋姬’果實含有獨有的2-乙基己基醛；‘紅壽’ב大紅袍’果實香氣中含有獨有香氣成分4-羥基-2-丁酮，3-甲基-4-氧絡(luò)戊酸；‘大紅袍’自交授粉含有獨有的4-甲基環(huán)己醇；‘秋姬’自交授粉獨有的香氣成分有5種，包含（Z）-2-庚烯醛、庚醛、反-2-辛烯醛、順-3-己烯基丁酯、醋酸異辛酯；‘大紅袍’ב秋姬’無獨有香氣成分；‘大紅袍’ב紅壽’獨有的香氣成分有4種，包括1-戊醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙酸庚酯、（E）-3-丁酸己烯酯；‘紅壽’ב大紅袍’含有2種獨有香氣成分；‘紅壽’ב秋姬’含有1種獨有香氣成分。以上結(jié)果表明，不同授粉組合的果實香氣物質(zhì)種類及獨有香氣物質(zhì)均存在差異，花粉直感效應(yīng)明顯。

2.2花粉直感對不同組合果實香氣成分含量的影響

對7個授粉組合李果實香氣組分和含量分析可知（圖2，表1），由于授粉品種的差異，果實表現(xiàn)出明顯的花粉直感效應(yīng)。‘秋姬’自交授粉果實香氣總含量最高，為144804.68μg/kg；其次為‘大紅袍’自交授粉，總含量為67513.22μg/kg；‘紅壽’自交授粉香氣成分總含量最少，為31582.68μg/kg?！t壽’ב秋姬’和‘紅壽’ב大紅袍’雜交果實香氣成分總含量分別比‘紅壽’自交授粉升高了21.12%和74.82%；‘大紅袍’ב秋姬’和‘大紅袍’ב紅壽’雜交果實香氣成分總含量則比‘大紅袍’自交授粉分別降低了10.40%和27.56%。

醛類物質(zhì)中，‘秋姬’自交授粉果實最高，為74177.12μg/kg，占總香氣含量的67.99%，‘大紅袍’次之，‘紅壽’最少；‘紅壽’ב秋姬’和‘紅壽’ב大紅袍’醛類物質(zhì)含相較‘紅壽’自交授粉分別增長了22.73%和39.37%。‘大紅袍’自交授粉和‘大紅袍’ב秋姬’含量較高的香氣成分為酯類和醛類，兩類成分總和分別占果實總香氣含量的77.50%和77.58%?！蠹t袍’ב紅壽’主要香氣成分為酯類，其雜交果實表現(xiàn)為除醇類物質(zhì)種類低于‘大紅袍’自交授粉，其他種類含量較‘大紅袍’自交授粉變化并不顯著。

酯類物質(zhì)中，‘紅壽’ב秋姬’、‘紅壽’ב大紅袍’及‘紅壽’自交授粉香氣成分中均含有丁酸甲酯、乙酸己酯、（Z）-乙酸葉醇酯和（Z）-乙-2-烯基乙酸酯，‘紅壽’ב秋姬’、‘紅壽’ב大紅袍’及‘紅壽’自交授粉果實醇類香氣物質(zhì)以反式-2-己烯-1-醇為主，‘大紅袍’ב秋姬’、‘大紅袍’ב紅壽’、‘大紅袍’和‘秋姬’自交授粉香氣物質(zhì)均以反式-2-己烯-1-醇和正己醇為主。

‘紅壽’ב大紅袍’果實香氣含量中酮類物質(zhì)含量占總體比重最大，達12.29%，其中4-羥基-2-丁酮占該品種總酮類物質(zhì)的99.30%，其他組合果實酮類物質(zhì)含量在該品種果實香氣總含量占比不足1%。

7個組合李果實其他物質(zhì)含量均較少，且各香氣成分在種類和含量上均不相同，表現(xiàn)出明顯的花粉直感效應(yīng)[13-17]。

2.3花粉直感對不同組合果實香氣成分層次聚類分析

對46種香氣成分含量進行聚類分析，將香氣種類相近組合的李果實聚類在一起，共分為4大類，如圖3所示。其中‘紅壽’、‘紅壽’ב秋姬’、‘紅壽’ב大紅袍’為第一大類，該類李果實均為以‘紅壽’為母本的雜交組合，說明以‘紅壽’品種為母本的果實香氣成分較為相似；‘大紅袍’、‘大紅袍’ב秋姬’為第二大類；‘大紅袍’ב紅壽’為第三大類；說明以‘大紅袍’為母本的李果實香氣含量具有多樣性；‘秋姬’為第四大類，其香氣物質(zhì)種類較為明顯，無法與其他組合聚類。

2.4不同組合李果實香氣成分主成分分析

由香氣成分特征值主成分分析（圖4）可知，7個組合可分為3類，‘秋姬’在第一象限，起主要貢獻作用的是1-辛烯-3-醇、醋酸異辛酯、反式-2-己烯醛、壬醛、（Z）-2-庚烯醛、庚醛、里那醇、丙位癸內(nèi)酯。‘大紅袍’ב紅壽’單獨在第二象限，起主要貢獻作用的是6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙酸庚酯、（E）-3-丁酸己烯酯、1-戊醇。其余5個組合在第三象限，具有類似香氣主成分。

根據(jù)主成分析結(jié)果，在7個組合李資源中共鑒定出19種關(guān)鍵香氣成分和8種特異香氣（OAV＞1），詳見表2。其中，酯類香氣成分5種，醛類香氣成分7種，醇類香氣成分3種，酮類香氣成分3種，其他香氣成分1種。在本研究中，反式-2-己烯醛、壬醛、2-乙烯醛、里那醇4種物質(zhì)是7個組合中共有的特異香氣物質(zhì)，具有清新水果、玫瑰、柑橘、木香果香味等，OAV值較高，對7個組合李果實香氣特征起主要貢獻作用。

‘秋姬’OAV值大于10的成分最多，包括丙位癸內(nèi)酯、反式-2-己烯醛、2-己烯醛、壬醛、丙位癸內(nèi)酯、里那醇、1-辛烯-3-醇共6種，其中壬醛和2-己烯醛OAV值較高，遠大于其他授粉組合，玫瑰、柑橘、油脂氣味更為顯著，且具有丙位癸內(nèi)酯獨有的香氣成分，是具有獨特桃子、椰子香氣的特異李組合。結(jié)果中，各授粉組合的里那醇OAV值都高于母本自交授粉，花、果香味更濃郁?！蠹t袍’ב紅壽’獨有的特異香氣成分1-辛烯-3-醇和6-甲基-5-庚烯-2-酮OAV值較高，說明它具有蘑菇、泥土、鮮味等香氣。

3討論

HS-SPME-GC-MS技術(shù)是通過色譜法分析固定相中吸附的組分，是目前國內(nèi)外較為先進的香氣物質(zhì)提取和測定技術(shù)之一。王環(huán)等[18]應(yīng)用此項技術(shù)檢測了62個葡萄資源中的99種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括醇類、酯類和萜烯類。王陽等[12]在8個南果梨產(chǎn)地共檢測出香氣成分109種，包括酯類、醛類、醇類、酮類等。劉澤靜等[19]首次利用GC-MS技術(shù)檢測的‘蓋縣李’果肉中的38種香氣物質(zhì)和林炎娟等[20]鑒定的福洪李果肉中25種香氣物質(zhì)實驗結(jié)果均顯示李果實香氣成分主要是醛類、酯類、醇類和酮類，這些成分會影響果實的風(fēng)味。本研究共鑒定了7個雜交李組合的果實香氣，共46種，包括16種酯類、11種醛類、4種酮類、12種醇類和3種其他化合物。其中以醛類和酯類為主，與前人研究結(jié)果相似。

親本作為目標性狀的載體，是雜交育種的基礎(chǔ)，因此在選配親本時，要著重了解其遺傳傾向以及性狀在后代中的遺傳特點等信息。果實大小、風(fēng)味、顏色等性狀均能通過雜交育種手段篩選出符合育種目標的優(yōu)異資源[21-22]。與含有特異香氣成分的種質(zhì)資源雜交，可提高香氣育種效率[23]。以往對李果實香氣的研究主要集中在不同種質(zhì)類型之間香氣化合物的差異，尚未有花粉直感效應(yīng)的相關(guān)報道。為解決‘紅壽’和‘大紅袍’花期相近而‘秋姬’花期較晚導(dǎo)致的花期不重疊問題，可通過適度干旱、嫁接和植物生長調(diào)劑的使用調(diào)控開花時間，以獲得優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、紅肉、香氣濃郁的高品質(zhì)的后代。大多數(shù)李品種具有自交不親和或自交親和率低的特點，難以實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，故生產(chǎn)中常搭配授粉樹或噴灑混合品種花粉提高坐果率。本試驗采用自然授粉模擬生產(chǎn)上噴灑花粉的方式，更貼近生產(chǎn)，具有現(xiàn)實意義。3個品種在雜交授粉后，果實香氣成分均表現(xiàn)出明顯的花粉直感效應(yīng)，總體上表現(xiàn)為各類香氣成分種類及含量均發(fā)生了一定的改變。‘紅壽’ב秋姬’果實香氣中醛類種類數(shù)量及含量都高于‘紅壽’自交授粉，‘紅壽’ב大紅袍’果實香氣中醛類種類含量高于‘紅壽’自交授粉，都增加了1～2種獨有的香氣成分物質(zhì)；‘大紅袍’ב秋姬’、‘大紅袍’ב紅壽’較‘大紅袍’自交授粉，增加了獨有的香氣成分物質(zhì)，研究結(jié)果與于立洋等[24]的研究結(jié)果一致。

利用主成分分析和香氣物質(zhì)聚類熱圖，可以清楚地區(qū)分不同的授粉組合，并根據(jù)親本的不同將其分為2類。結(jié)果表明，同一母本的李果實，香氣物質(zhì)具有很高的相似性，但并不完全相同。此外，聚類熱圖可以清楚地顯示不同授粉組合的果實，香氣成分的類型和含量存在顯著差異，且4個雜交組合都一定程度地增加了香氣物質(zhì)種類、含量，說明對果實的香氣貢獻較大，可顯著改善果實香氣，該結(jié)論與劉婉君等[25]關(guān)于鴨梨的研究結(jié)果一致。

果實的香氣受到果實中多種化合物的影響，不是含量越高，貢獻越大，只有一部分OAV值較高的特征化合物在水果中起主要作用[26-27]。在本研究中，反式-2-己烯醛、壬醛、2-己烯醛、里那醇4種物質(zhì)是7個組合中共有的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，具有清新水果、玫瑰、柑橘、木香果香等氣味，且OAV值較高，對7個組合李果實香氣特征起主要貢獻作用，花粉直感效應(yīng)明顯。‘秋姬’自交授粉果實OAV＞10的關(guān)鍵香氣成分最多，共有6種，其中壬醛和2-己烯醛OAV值較高，遠大于其他組合，玫瑰、柑橘、油脂氣味更為顯著，且具有丙位癸內(nèi)酯獨有的香氣成分，是具有獨特桃子、椰子香氣的特異李組合。‘大紅袍’ב紅壽’獨有的特異香氣成分是1-辛烯-3-醇和6-甲基-5-庚烯-2-酮，具有蘑菇、泥土味、鮮味等香氣。其他各個組合香氣物質(zhì)OVA值也各不相同，充分反映了果實的花粉直感效應(yīng)，其結(jié)果與Deng等[28]在蜂糖李上的研究相似。里那醇被認為是典型的李香氣化合物之一[29-30]，是改善李果實香氣，濃郁香味的重要指標。在本研究中，該物質(zhì)在人工授粉后表現(xiàn)出OAV值明顯高于母本自交授粉，說明里那醇含量對花粉直感效應(yīng)敏感，這對進一步培育出具有典型濃郁李品種具有重要意義。

4結(jié)論

花粉直感效應(yīng)顯著影響李果實香氣中醛類、醇類、酮類和酯類物質(zhì)的種類及含量，影響果實香氣。同一母本的李果實，香氣物質(zhì)具有很高的相似性，但并不完全相同。不同授粉組合的果實，香氣成分的類型和含量存在顯著差異。其中反式-2-己烯醛、壬醛、2-己烯醛、里那醇4種物質(zhì)是7個組合中共有的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，其中具有清新水果、玫瑰、柑橘、木香果香等，且OAV值較高，對7個組合李果實香氣特征起主要貢獻作用。