免疫原性細胞死亡基因風(fēng)險模型的建立及其對肝細胞癌預(yù)后和腫瘤微環(huán)境特征的預(yù)測價值

摘要：目的鑒定肝細胞癌（HCC）免疫原性細胞死亡（ICD）相關(guān)基因，并基于相關(guān)基因構(gòu)建評分模型預(yù)測HCC的預(yù)后和腫瘤微環(huán)境特征。方法通過癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫獲取HCC數(shù)據(jù)集，采用熱圖展示了HCC中57個ICD相關(guān)基因的表達。基于ICD相關(guān)基因表達進行聚類分析，對2種ICD相關(guān)亞型（ICD低表達組和ICD高表達組）進行基因本體富集、京都基因和基因組百科全書富集、體細胞突變差異、免疫細胞浸潤差異分析。構(gòu)建LASSO Cox回歸風(fēng)險預(yù)后模型，驗證其臨床應(yīng)用價值。構(gòu)建列線圖模型，預(yù)測患者1、3和5年的生存率。此外，采用qRT-PCR驗證模型中關(guān)鍵基因的表達水平。兩組間比較采用成組t檢驗，采用單因素和多因素Cox回歸分析確定臨床病理特征中的預(yù)后因素。采用Kaplan-Meier生存曲線進行預(yù)后分析。采用Spearman秩相關(guān)進行相關(guān)性分析。結(jié)果ICD低表達組預(yù)后較差，ICD高表達組與良好的臨床結(jié)果相關(guān)（P=0.004）。進一步研究表明ICD高表達組與免疫活性微環(huán)境相關(guān)，且ICD高表達組的基因主要富集于免疫相關(guān)通路（免疫球蛋白受體結(jié)合、造血細胞譜系和B淋巴細胞受體信號通路）。體細胞突變結(jié)果顯示，ICD高表達組的CD274、CTLA4、HAVCR2、TIGIT、PDCD1和PDCD1LG2的基因表達水平較高（P值均＜0.05）。利用8個ICD相關(guān)基因（HSP90AA1、ATG5、BAX、PPIA、HSPA4、TLR2、TREM1、LY96）建立風(fēng)險預(yù)后模型，該模型在不同臨床特征中均有較好的預(yù)測價值。單因素和多因素Cox回歸分析表明，在訓(xùn)練集中，年齡和風(fēng)險評分是總生存期的獨立預(yù)后因素（P值均＜0.05）。qRT-PCR結(jié)果表明，HSPA4和REM1在HCC腫瘤樣本中的相對表達水平顯著高于瘤旁組織（P值均＜0.001）。ICD風(fēng)險評分升高的患者與γamp;T淋巴細胞（r=-0.29）、漿細胞（r=-0.3）和CD8+T淋巴細胞（r=-0.37）呈負相關(guān)（P值均＜0.05），與記憶B淋巴細胞（r=0.38）、靜止樹突狀細胞（r=0.47）和M0型巨噬細胞（r=0.49）呈正相關(guān)（P值均＜0.05）。結(jié)論本研究確定了與HCC預(yù)后相關(guān)的ICD基因，為理解不同ICD表達譜相關(guān)的免疫特性提供了見解。構(gòu)建的風(fēng)險模型和列線圖對于預(yù)測HCC患者的預(yù)后預(yù)測和免疫治療指導(dǎo)具有重要的價值。

關(guān)鍵詞：癌，肝細胞；免疫原性細胞死亡；預(yù)后；腫瘤微環(huán)境

肝細胞癌（HCC）作為一種常見的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)引發(fā)了嚴重的公共衛(wèi)生問題。HCC發(fā)現(xiàn)時常在晚期，限制了早期干預(yù)和治療的機會[1-3]。因此，探索能夠準確預(yù)測早期HCC患者預(yù)后的生物標志物和分子機制顯得尤為重要。據(jù)相關(guān)報道[4-8]，近年來免疫療法在多種惡性腫瘤治療中取得了顯著的突破。然而，在HCC治療中的應(yīng)用受到了限制。可能的原因是肝癌組織微環(huán)境的免疫抑制作用，其中包括細胞死亡途徑的紊亂。近期研究[9-10]表明，免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答方面起著重要作用。然而，關(guān)于ICD與HCC早期患者預(yù)后之間潛在關(guān)系的了解還相對有限。

ICD是一種特殊的細胞死亡方式，它是由某些化學(xué)藥物、放療、光動力療法、溶瘤病毒等方式作用于腫瘤細胞，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和產(chǎn)生活性氧并從細胞內(nèi)釋放免疫信號分子，增強腫瘤細胞的免疫原性，激活腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞對腫瘤細胞的攻擊，從而引起機體抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤發(fā)生ICD時，會在細胞膜表面上調(diào)并釋放一系列免疫信號分子，被識別后，促進免疫效應(yīng)因子的合成與釋放，誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細胞，這一系列免疫信號分子被稱為損傷相關(guān)分子模式[11-14]。在過去的幾年中，已經(jīng)探索了ICD的分子機制，但是很少在臨床上研究患者來評估ICD的可能性。例如，根據(jù)患者對ICD免疫療法的反應(yīng)來識別和分類生物標志物，將具有重要的臨床價值。近年來有研究[15-16]表明，ICD相關(guān)的基因在免疫治療中起著關(guān)鍵的作用，但在HCC中的具體作用尚不清楚。因此，本研究將基于大規(guī)模的HCC患者隊列，利用系統(tǒng)生物學(xué)方法篩選與ICD 相關(guān)的基因，并構(gòu)建一個基于這些基因的模型，用于預(yù)測HCC患者對免疫治療的反應(yīng)和生存結(jié)果。在未來，這項技術(shù)可以幫助醫(yī)生對治療作出重要的判斷。

1"""" 資料與方法

1.1" 數(shù)據(jù)收集"""""" 獲取與HCC中ICD相關(guān)的基因特征隊列采集和特征分析：從癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因型-組織表達（GTEx）項目的存儲庫中獲取HCC隊列的臨床屬性以及相應(yīng)的對照肝組織樣本的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。共收集了252例早期HCC患者進行分析。根據(jù)文獻[17-18]報道的57個ICD相關(guān)基因用于后續(xù)分析（表1）。

1.2" HCC中ICD相關(guān)基因變異" 使用R（v4.3.1）在TCGA-HCC數(shù)據(jù)矩陣中識別出HCC與對照組之間表達改變的基因子集，遵循假陽性率（FDR）lt;0.05和絕對對數(shù)變化倍數(shù)（logFC）gt;1.5的閾值篩選原則。將這些差異表達基因（differentially expressed genes，DEG）與預(yù)先確定的ICD相關(guān)基因進行交集，以確定差異表達的ICD相關(guān)基因集合。使用“ConsensusClusterPlus”R包（v1.54.0）進行一致性聚類分析，基于非負矩陣分析的異質(zhì)性聚類分析方法將患者樣本進行分組，設(shè)置候選聚類數(shù)目k從2～9，通過多次重復(fù)聚類并計算一致性矩陣，確定最優(yōu)的聚類數(shù)目為k=2，并分為ICD高表達組和ICD低表達組。隨后使用GO（基因本體）框架和KEGG（京都基因和基因組百科全書）通路映射對這些差異表達的ICD相關(guān)基因進行功能注釋，利用R中的Cluster Profiler包（v4.0.2），調(diào)整后的Plt;0.05且最小計數(shù)為1。深入分析ICD高表達組相關(guān)的功能和信號通路，采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），選擇MSigDB數(shù)據(jù)庫中的“c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt”和“c5.go. bp.v7.0.symbols.gmt”基因集進行分析。

1.3" ICD基因表達與體細胞突變、免疫參數(shù)之間的關(guān)聯(lián) 通過下載HCC樣本的體細胞突變數(shù)據(jù)，使用Maftools包（v2.8.0）對突變數(shù)據(jù)進行處理和可視化分析。通過ESTIMATE算法評估HCC患者腫瘤中ICD表達與免疫微環(huán)境之間的相互作用，該算法檢查了這些腫瘤樣本中預(yù)測的基質(zhì)和免疫細胞含量。使用CIBERSORT算法計算HCC患者之間的免疫浸潤狀態(tài)。通過CIBERSORT算法進行t檢驗分析，以研究ICD表達與免疫細胞浸潤、免疫檢查點之間的差異。

1.4" 構(gòu)建風(fēng)險模型""""" 在來自TCGA-HCC數(shù)據(jù)集的252例具有總生存期（OS）數(shù)據(jù)的HCC病例隊列中，對差異表達的DE-IRG集合進行單變量Cox回歸分析，以篩選出Plt;0.05的基因。隨后通過應(yīng)用最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）技術(shù)，對基因選擇進行進一步優(yōu)化，確定用于構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型的基因。使用R包中的ggplot2包（v3.3.5）對這些基因在HCC和對照組樣本之間的表達進行比較分析，并通過人類蛋白質(zhì)圖譜資源進行免疫組化驗證。根據(jù)各自Cox系數(shù)加權(quán)的基因表達水平線性組合計算每位患者的風(fēng)險評分（風(fēng)險評分=α1×X1+α2×X2+...+αn×Xn），根據(jù)中位數(shù)風(fēng)險評分將患者分為高風(fēng)險或低風(fēng)險類別。進行比例風(fēng)險假設(shè)檢驗以評估風(fēng)險模型的擬合度。通過Kaplan-Meier生存分析提供高風(fēng)險與低風(fēng)險隊列的比較生存指標，以圖形方式表示生存分布和風(fēng)險特征。模型的預(yù)測可靠性通過pROC包中的受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析進行量化。使用類似的方法論，應(yīng)用GTEx數(shù)據(jù)集進行外部驗證。此外，為了確定風(fēng)險模型輸出與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性，將來自TCGA-HCC的HCC樣本分為高于和低于中位數(shù)基因表達的兩個組，并對每個亞組執(zhí)行生存分析。

1.5" 確定早期HCC患者獨立的預(yù)后因素 利用來自TCGA-HCC數(shù)據(jù)庫HCC的完整臨床數(shù)據(jù)集，首先進行單變量Cox比例風(fēng)險分析，以確定具有Plt;0.05的臨床和風(fēng)險模型因素。然后將這些顯著因素進行多變量Cox回歸分析，以識別與HCC患者顯著相關(guān)的獨立預(yù)后指標。構(gòu)建整合這些獨立變量的預(yù)后列線圖，以預(yù)測早期HCC患者1、3、5年的生存概率。通過生成校準圖，評估列線圖的預(yù)測準確性和可靠性。

1.6" 臨床樣本采集及RT-PCR""" 選取2022—2023年南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的HCC患者5例。手術(shù)或活檢后立即將標本保存在氣相液氮中。采用E.Z.N.A法提取標本中的總RNA?？俁NA試劑盒I（Omega）遵循制造商的協(xié)議。采用CFX96 Touch實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio- Rad）進行qRT-PCR，采用比較Ct法檢測目的基因的相對表達水平。以GAPDH作為歸一化對照。引物序列見表2。

1.7" 統(tǒng)計學(xué)方法"" 使用R（v4.3.1）進行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用成組t檢驗。采用單因素和多因素Cox回歸分析確定臨床病理特征中的預(yù)后因素。采用Kaplan- Meier生存曲線進行預(yù)后分析。采用Spearman秩相關(guān)進行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2"""" 結(jié)果

2.1" 基于ICD差異基因分組結(jié)果""""" 通過一致性聚類，根據(jù)最優(yōu)聚類數(shù)目（k=2），將患者樣本分為ICD低表達組和ICD高表達組（圖1a～c）。構(gòu)建了ICD基因表達的熱圖（圖1d），ICD低表達組顯示ICD相關(guān)基因的低表達水平，而ICD高表達組顯示高表達水平。此外，生存分析表明，ICD低表達組預(yù)后較差，ICD高表達組與良好的臨床結(jié)果相關(guān)（P=0.004）（圖1e）。

2.2" ICD高表達組DEG和信號通路的分析""""" 由于ICD高表達組的臨床治療效果好，而ICD低表達組的預(yù)后差，在不同的表達組中確定了關(guān)鍵的DEG信號通路，以了解調(diào)控預(yù)后的分子機制。研究分析了上調(diào)基因的信號通路，發(fā)現(xiàn)這些基因在ICD高表達時富集于細胞黏附的調(diào)節(jié)、細胞活化的正調(diào)控、細胞黏附的正調(diào)控、白細胞活化的正調(diào)控、細胞因子-細胞因子受體相互作用、PI3K- Akt信號通路（圖2a、b）。這些結(jié)果表明，ICD的高表達與免疫活性微環(huán)境有關(guān)。為了進一步確定與ICD高表達相關(guān)的信號通路，對ICD高表達組和低表達組進行了GSEA。結(jié)果表明，ICD高表達組中的基因集中于免疫相關(guān)通路，如免疫球蛋白受體結(jié)合、造血細胞譜系和B淋巴細胞受體信號通路（圖2c、d）。

2.3" 免疫細胞浸潤的體細胞突變分析與評價"" 研究對ICD高表達組和ICD低表達組進行了體細胞突變分析，發(fā)現(xiàn)TP53、CTNNB1和MUC16是兩組中相對常見的突變，且具有不同的相對頻率（圖3）。此外，使用ESTIMATE算法分析HCC患者樣本數(shù)據(jù)，比較了患者免疫細胞和基質(zhì)細胞的相對評分，與ICD低表達組相比，ICD高表達組的免疫評分更高（P＜0.05）（圖4a～c）?；贑IBERSORT算法，本研究發(fā)現(xiàn)在ICD低表達組中血漿細胞和CD8+T淋巴細胞的浸潤增加，而ICD高表達組中樹突狀細胞和巨噬細胞M0的浸潤增加（圖4d）。對免疫檢查點的分析發(fā)現(xiàn)，ICD高表達組CD274、CTLA4、HAVCR2、TIGIT、PDCD1和PDCD1LG2的基因表達水平較ICD低表達組明顯升高（P值均＜0.05）（圖4e）。同時，ICD高表達組的HLA-A、HLA-C、HLA-DPA1等基因表達水平也高于ICD低表達組（P值均＜0.05）（圖4f）。

2.4" ICD風(fēng)險特征的構(gòu)建與驗證 在訓(xùn)練集中，通過單因素Cox比例風(fēng)險分析確定了8個與HCC預(yù)后相關(guān)的ICD基因（圖5a）。這些與OS相關(guān)的ICD基因隨后被用于通過LASSO Cox生成預(yù)后特征回歸方法（圖5b、c），其中來自2個ICD基因?qū)Φ南禂?shù)被用于計算風(fēng)險評分。風(fēng)險評分模型采用以下算法開發(fā)：風(fēng)險評分=HSPA4×0.131 8+TREM1×0.395 6。根據(jù)風(fēng)險評分的中位數(shù)將HCC患者分層為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組，然后在訓(xùn)練集中評估其預(yù)測價值。高風(fēng)險組的HCC患者OS較差（P=0.002）（圖5d）。然后將相同的公式和截止閾值應(yīng)用于驗證集（GEO，GSE76427），同樣揭示了高風(fēng)險組的HCC患者有更差的OS（P＜0.001）（圖5e）。隨著風(fēng)險評分的增加，死亡風(fēng)險增力口。在驗證集中也觀察到了相同的分析結(jié)果（圖5f～i）。

2.5" 列線圖的構(gòu)建、評估及qRT-PCR驗證"""" 通過結(jié)合患者的臨床病理特征，將年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期和風(fēng)險評分納入到單因素和多因素Cox回歸進行分析。結(jié)果表明，在訓(xùn)練集中，年齡和風(fēng)險評分是OS的獨立預(yù)后因素（P值均＜0.05）（圖6a、b）。為了更好地應(yīng)用這一結(jié)果，將TNM分期分三個參數(shù)納入，構(gòu)建了列線圖來預(yù)測患者1、3和5年的生存率（圖6c），校準圖顯示該列線圖具有良好的預(yù)測能力（圖6d）。此外，還通過qRT-PCR在5個臨床樣本中驗證了風(fēng)險評分模型中2個基因的表達水平。結(jié)果表明，HSPA4和REM1在HCC腫瘤樣本中的相對表達水平顯著高于瘤旁組織（P值均＜0.001）（圖7）。

2.6" 風(fēng)險評分與免疫微環(huán)境特征""""" 考慮到ICD在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的重要生物學(xué)作用，進一步探究了ICD風(fēng)險評分與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系。結(jié)果表明，風(fēng)險評分升高的患者與γδT淋巴細胞、漿細胞和CD8+T淋巴細胞呈負相關(guān)，與記憶B淋巴細胞、靜止樹突狀細胞和M0型巨噬細胞呈正相關(guān)（P值均＜0.05）（圖8）。

3"""" 討論

HCC是世界上第六大常見的惡性腫瘤，也是惡性腫瘤死亡的第四大常見原因[19]。在治療過程中，由于化療藥物的選擇性不強，故易誘發(fā)多藥耐藥，這導(dǎo)致肝癌治療過程中化療藥物的臨床效果大大被降低。目前，許多HCC的化療方案均未達到預(yù)期效果，其中化療耐藥是影響肝癌化療療效的最關(guān)鍵因素[20-22]。免疫治療近年來在多種惡性腫瘤中取得了顯著的突破，然而，在HCC的治療中，免疫療法的應(yīng)用仍受限制。一個可能的原因是肝癌組織微環(huán)境的免疫抑制作用。近期研究[23]表明，ICD在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答方面起著重要作用。

ICD是一種獨特的受調(diào)控的細胞死亡類型，通過釋放免疫信號分子如損傷相關(guān)分子模式，能夠增強樹突狀細胞的抗原呈遞能力，并激活腫瘤特異性T淋巴細胞的殺傷作用，從而促進宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫反應(yīng)[24-25]。未來的研究可以進一步探索ICD相關(guān)基因/通路在個性化HCC治療中的應(yīng)用前景，特別是通過結(jié)合ICD與其他臨床參數(shù)的預(yù)后模型，以幫助醫(yī)生更精準地預(yù)測患者的治療反應(yīng)和生存結(jié)果?；贗CD相關(guān)基因的表達，本研究通過聚類分析在HCC中確定了2種聚類分型，即ICD低表達組和ICD高表達組。結(jié)果顯示ICD低表達組預(yù)后較差，ICD高表達組與良好的臨床結(jié)果相關(guān)。進一步分析了不同表達組的關(guān)鍵DEG和信號通路，結(jié)果顯示，ICD的高表達組與免疫活性微環(huán)境相關(guān)。GSEA分析結(jié)果顯示，ICD高表達組的基因主要集中在免疫相關(guān)途徑。體細胞突變分析表明，TP53、CTNNB1和MUC16在ICD高表達組中的相對頻率與ICD低表達組不同，TP53突變在ICD高表達組中相對更為普遍，而CTNNB1和MUC16在ICD低表達組中更為突出。這些差異可能反映了不同ICD表達亞型對免疫細胞浸潤和腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)方式。另外，與ICD低表達組相比，ICD高表達組的免疫評分明顯較高，腫瘤純度較低?；贑IBERSORT算法，發(fā)現(xiàn)在ICD 低表達組中血漿細胞和CD8+T淋巴細胞的浸潤增加，而ICD高表達組中樹突狀細胞和巨噬細胞M0的浸潤增加。對免疫檢查點的分析發(fā)現(xiàn)，ICD高表達組的CD274、CTLA4、HAVCR2、TIGIT、PDCD1、PDCD1LG2、HLA-A、HLA-C、HLA-DPA1等基因的表達水平明顯高于ICD低表達組。

此外，研究還構(gòu)建并驗證了8個ICD相關(guān)基因的預(yù)后風(fēng)險特征。高風(fēng)險組的HCC患者OS較差，且死亡風(fēng)險隨著風(fēng)險評分的增加而增加。Cox回歸分析表明，年齡和風(fēng)險評分是OS的獨立預(yù)后因素。為了更好地應(yīng)用該結(jié)果，構(gòu)建了列線圖，預(yù)測患者1、3、5年的生存率，結(jié)果顯示列線圖具有較好的預(yù)測能力。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，風(fēng)險評分升高的患者與Y8T淋巴細胞、漿細胞和CD8+T淋巴細胞呈負相關(guān)；與記憶B淋巴細胞、靜止樹突狀細胞和M0型巨噬細胞呈正相關(guān)。ICD作為一種可引起免疫反應(yīng)的細胞死亡，有望打破免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，啟動T淋巴細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，動員全身的免疫反應(yīng)，從而實現(xiàn)長期抑制腫瘤的作用[26]。

雖然該研究利用生物信息學(xué)分析，對ICD相關(guān)基因在免疫微環(huán)境中的潛在意義及其在HCC免疫治療反應(yīng)中的預(yù)測價值提供了深入見解，但本研究存在一定局限性。本研究的數(shù)據(jù)來源于TCGA公共數(shù)據(jù)庫，即使全面分析了ICD基因表達、免疫應(yīng)答和突變的各個方面，仍需要進一步的臨床驗證和實驗探索。

綜上，本研究強調(diào)了與ICD相關(guān)的基因可能在塑造免疫微環(huán)境中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，并可能成為HCC免疫治療反應(yīng)的預(yù)測指標。此外，構(gòu)建的ICD風(fēng)險特征模型和列線圖對HCC患者的預(yù)后預(yù)測和制訂個體化治療方案具有重要的價值。然而，筆者認為持續(xù)的研究和嚴格的臨床驗證是確認這些結(jié)果準確性和可靠性不可或缺的步驟，將進一步推動對HCC患者與ICD相關(guān)基因的理解和應(yīng)用。

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