提升甜菜紅色素光熱穩(wěn)定性的微乳液包封制備的研究

摘 要：本文采用助表面活性劑濃度法制備微乳液并將甜菜色素包封在W/O型微乳液體系內(nèi)，以提升甜菜色素的光、熱穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH3～7條件下色素比較穩(wěn)定。通過條件優(yōu)化得到甜菜色素微乳液的最佳制備工藝配方并得出以下數(shù)據(jù)：微乳體系中的水相占比為14.2%，葵花籽油占比為42.9%，混合乳化劑占比為42.9%，甜菜色素最大承載量約為1.42%。此外，制備的甜菜色素微乳液經(jīng)鑒定為W/O型乳液，具有良好的體系穩(wěn)定性，穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，微乳化對甜菜色素的光、熱穩(wěn)定性具有一定的提升效果。研究結(jié)果為甜菜色素的加工及其產(chǎn)品開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜菜色素；油包水；微乳液；穩(wěn)定性

中圖分類號： TS 201 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

顏色是評價食品的一項重要指標(biāo)，色素可分為天然色素和人工合成色素。甜菜色素作為一種生物堿類天然色素，它不僅可以作為食品添加劑提供染色效果，而且還能作為一種生物活性物質(zhì)提供保健功能。而甜菜色素的油不溶性和本身穩(wěn)定性較低是制約其應(yīng)用的最主要因素[1]。將甜菜色素制備成W/O型乳液后，不僅可以提升其本身的呈色穩(wěn)定性，而且可以促進(jìn)人們腸道吸收，能較大程度地發(fā)揮甜菜色素的保健作用。為了最大化乳液中的色素含量和提高乳液體系的穩(wěn)定性，通過制作甜菜色素微乳液的方式研究微乳液體系的臨界增溶水相條件，以獲得甜菜色素含量高且體系穩(wěn)定的甜菜色素乳液。本文對甜菜色素在不同pH體系下的呈色穩(wěn)定性進(jìn)行測定，以確定最適的水相pH范圍，以此為基礎(chǔ)展開甜菜色素微乳液制作方法的單因素試驗，得出甜菜色素微乳液的最佳制備工藝，并通過對比甜菜色素微乳液與水溶液在光照、加熱條件下的色素保留率，探究微乳液對甜菜色素穩(wěn)定性的保護(hù)效果及甜菜色素微乳液體系的穩(wěn)定性。研究結(jié)果可為甜菜色素的加工及其產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜菜色素粉末，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；葵花籽油，中國上海佳格食品有限公司；司班80、吐溫80、檸檬酸、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、丙三醇、無水乙醇（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL 104電子天平、PL 2002電子天平、Five Easy實驗室pH計，梅特勒-托利多（上海）有限公司；RHdigital型磁力攪拌器、VORTEX GENIUS 3 型旋渦振蕩器、ULTRA-TURRAX T 18 basic 型高速分散器，德國IKA公司；SPECTRA MAX 190型全波長酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；Centrifuge 5424離心機(jī)，德國Eppendorf公司；CU-420型電熱恒溫水槽，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GZP-150N光照培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；Smart-S2-30DH型實驗室級超純水機(jī)，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜菜色素在不同pH下的呈色穩(wěn)定性

用去離子水分別配置pH為3、5、7的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液（0.05mol/L）、pH為9的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液（0.05mol/L）、pH為11的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖溶液（0.05mol/L）。用不同pH的緩沖溶液精確配置0.1%的甜菜色素溶液。配置完成后在室溫下避光放置60min，觀察不同pH下色素溶液的顏色變化。用全波長酶標(biāo)儀對不同pH的色素溶液進(jìn)行200nm～700nm的全波長掃描，加樣量200μm，溫度為常溫，波長取10nm，記錄全波長掃描圖譜。

1.3.2 甜菜色素微乳液制備方法的確定

甜菜色素微乳液制備方法如下。1）混合乳化劑的復(fù)配。參照文獻(xiàn)[2]～文獻(xiàn)[4]進(jìn)行乳化劑的選擇和復(fù)配，選擇親油的司班80（HLB值為4.3）與親水的吐溫80（HLB值為15）進(jìn)行復(fù)配，以獲得較大的HLB值范圍。調(diào)整司班80與吐溫80的比例分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，計算得混合乳化劑的HLB值分別為5.37、6.44、7.51、8.58、9.65。2）甜菜色素微乳液的制備。微乳液的加料順序采用助乳化劑濃度法[5]，先固定助乳化劑與水相的比例，并按照比例將助乳化劑溶于初始水相配置成新水相，混合乳化劑和葵花籽油組成油相，再逐滴將新水相滴加油相中制備微乳液，滴加過程中磁力攪拌（800rad/min）。3）擬三元相圖的繪制。固定油相的總質(zhì)量為10g，葵花籽油和混合乳化劑的比例為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9，混合乳化劑中司班80與吐溫80的比例分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，選擇50%的丙三醇作為助表面活性劑，初始水相是pH為5的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液（0.05mol/L）。按照上述比例稱取相應(yīng)的葵花籽油、司班80和吐溫80混合均勻作為油相，在pH為5的緩沖溶液中以質(zhì)量比5∶5加入丙三醇作為新水相，然后按照1.3.2（2）中的方法制備微乳液。根據(jù)到達(dá)臨界增溶水時（乳液由澄清透明變渾濁），乳液中葵花籽油、混合乳化劑、新水相的百分比來確定該點在相圖中的位置，將每個臨界點連成曲線即得到該體系的擬三元相圖。4）助表面活性劑的選擇。在根據(jù)三元相圖確定油相中各組分的含量后，研究無水乙醇和丙三醇對臨界增溶水相的影響。5）助表面活性劑濃度的確定。根據(jù)1.3.2（4）的結(jié)果研究助表面活性劑濃度為30%、40%、50%、60%（w/w）時對臨界增溶水相的影響。6）甜菜色素最大添加量的確定。根據(jù)1.3.2其余步驟的結(jié)果，測定甜菜色素粉末在含有50%丙三醇的pH5磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中的最大溶解度，以接近最大溶解度的溶液作為水相制備微乳液，計算臨界點的最大增溶水相和色素含量。

1.3.3 甜菜色素微乳液的表征

在確定甜菜色素微乳液各組分含量后，按照制備方法制備甜菜色素含量為1.0%的微乳液并對其進(jìn)行表征。1）微乳液類型的鑒定。采用染色法[6]對甜菜色素微乳液的類型進(jìn)行鑒定。取一定量的微乳液置于培養(yǎng)皿中，在微乳液的中心滴入一滴亞甲基藍(lán)染劑，如果乳液為O/W型，那么染劑會快速從中心擴(kuò)散至整個乳液，反之乳液為W/O型。滴入染劑后常溫靜置30min，觀察染色狀態(tài)。2）微乳液的離心穩(wěn)定性。取適量的甜菜色素微乳液，在3000r/min下離心30min觀察離心前后的乳液狀態(tài)。3）微乳液的儲藏穩(wěn)定性。取適量的甜菜色素乳液在室溫下避光保存9d，保存期間每天觀察乳液的狀態(tài)。

1.3.4 微乳液對甜菜色素穩(wěn)定性的影響

參照文獻(xiàn)[7]采用測定吸光值的方法測定微乳液水相中甜菜色素的含量，當(dāng)pH為5時，甜菜色素乳液的最大吸收波長在530nm左右，因此以530nm處的吸光值表示甜菜色素的含量。1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液（0.05mol/L，pH5）分別配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%（w/w）的甜菜色素水溶液和微乳液。在530nm處測定吸光值，根據(jù)測定結(jié)果繪制甜菜色素微乳液與水溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2）光照穩(wěn)定性。移取5組質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%（w/w）的甜菜色素水溶液和微乳液，每個樣品5g，其中1組避光保存，其余4組放入恒溫光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度15000lx，設(shè)定溫度為28℃，分別在第4h、8h、12h、16h取出1組樣品并避光保存。樣品全部取出后，用全波長酶標(biāo)儀測定全部樣品在530nm處的吸光值，并根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算甜菜色素的保留率。對比水溶液和微乳液中色素的保留率，判斷微乳液對甜菜色素光照穩(wěn)定性的影響。3）熱穩(wěn)定性。移取5組質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%（w/w）的甜菜色素水溶液和微乳液，每個樣品5g，其中1組常溫避光保存，其余4組放入電熱恒溫水槽中，設(shè)定溫度為60℃，分別在第30min、60min、90min、120min取出1組樣品并冷卻至常溫，用全波長酶標(biāo)儀測定樣品在530nm處的吸光值，微乳液對色素?zé)岱€(wěn)定性的判斷方法同1.3.4（2）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均重復(fù)3次并設(shè)置對照組，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Statistix 9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用最小顯著性差異法分析平均值之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜色素在不同pH下的呈色穩(wěn)定性

分別用pH為3、5、7、9、11的緩沖溶液配置0.1%的甜菜色素溶液，室溫下避光放置60min后使用全波長酶標(biāo)儀測定全波長掃描圖譜，得到的結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)pH為3～7時，甜菜色素溶液的最大吸光值隨著pH的增大而增大，顏色由粉紅色變?yōu)樯罴t色，且吸光值下降可能是生成了新甜菜苷或異甜菜苷。當(dāng)pH為5～7時，顏色和最大吸收的波長基本保持不變，說明甜菜色素在弱酸性下較穩(wěn)定在530nm～540nm左右，這與張琳等[7]的測定結(jié)果一致。當(dāng)pH為7～11時，甜菜色素溶液的最大吸光值隨著pH增大而減小，顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色甚至紫色，可能是因為在堿性環(huán)境下甜菜紅素的穩(wěn)定性較差，使甜菜紅素的總量減少，溶液呈現(xiàn)紫色[8]，而最大吸收波長隨著pH增大而增加，這與曹機(jī)良等[9]的測定結(jié)果相似。

綜上所述，pH為5時是甜菜色素溶液的最適pH。

2.2 甜菜色素微乳液制備方法的確定

2.2.1 混合乳化劑中司班80和吐溫80比例的確定

當(dāng)司班80和吐溫80的比例為9∶1、8∶2、7∶3（HLB值為5.37～7.51）時，能夠形成微乳液的區(qū)域面積很小，無論葵花籽油和混合乳化劑的比例是多少，增溶的水相都沒有明顯的變化。當(dāng)司班80和吐溫80的比例為6∶4（HLB值為8.58）時，有較大面積的微乳區(qū)域出現(xiàn)，且在混合乳化劑用量＜5g時，增溶水量隨著混合乳化劑用量的增加而增加。當(dāng)司班80和吐溫80的比例到達(dá)5∶5（HLB值為9.65）時，微乳區(qū)域面積最大為16.2%，對應(yīng)的葵花籽油和混合乳化劑的比例為5∶5。因此，選取司班80和吐溫80比例為5∶5進(jìn)行后續(xù)單因素試驗。

2.2.2 助表面活性劑的選擇

根據(jù)上述結(jié)果，固定油相總質(zhì)量為10g，司班80和吐溫80的比例為5∶5，分別設(shè)置無水乙醇和丙三醇兩種助表面活性劑的濃度為50%（w/w）。醇類的助表面活性劑能夠和乳化劑形成混合界面膜，同時提高界面膜的柔順性，使體系更容易形成微乳液并包裹更多的水相[10]。根據(jù)食品體系的原則，只研究葵花籽油與混合乳化劑的比例為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6的結(jié)果，2種助表面活性劑對臨界增溶水量影響的結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，當(dāng)用無水乙醇作為助表面活性劑且混合乳化劑用量＞5g時，其對臨界增溶水量有提高的趨勢，推測其在混合乳化劑含量更高的體系中能有更好的表現(xiàn)，但這不符合食品體系選取的原則；用丙三醇作為助表面活性劑，當(dāng)混合乳化劑用量≤5g時，臨界增溶水量隨著混合表面活性劑用量的增加而增加，當(dāng)混合乳化劑用量＞5g時，臨界增溶水量開始有下降的趨勢。2種助表面活性劑展示出的不同趨勢表明不同的助表面活性劑對相同體系的助乳化效果不同。根據(jù)食品體系的原則，選擇在混合乳化劑含量較低時增溶效果最明顯的丙三醇作為最佳的助表面活性劑。

2.2.3 助表面活性劑濃度的確定

根據(jù)上述結(jié)果，固定油相總質(zhì)量為10g，司班80和吐溫80的比例為5∶5，助表面活性劑為丙三醇，設(shè)置丙三醇在水相中的濃度分別為30%、40%、50%、60%（w/w）。不同濃度的丙三醇對臨界增溶水量的影響如圖3所示。

當(dāng)丙三醇濃度低（30%、40%）時，臨界增溶水量隨著混合乳化劑用量的增加始終保持上升趨勢；當(dāng)丙三醇濃度高（50%、60%）時，混合乳化劑用量＞5g后，臨界增溶水量隨濃度的升高出現(xiàn)明顯下降的趨勢。按照臨界增溶水質(zhì)量分析可以得出，當(dāng)混合乳化劑＜5g時，助乳化效果為60%＞50%＞40%＞30%；當(dāng)混合乳化劑用量＞5g時，助乳化效果為50%＞40%＞30%＞60%。

在混合乳化劑與葵花籽油的比例為5∶5時，60%丙三醇的臨界增溶水相為2.15g，增溶水相中初始水相占比為總?cè)橐旱?.95%，而50%丙三醇的臨界增溶水相為1.93g，增溶水相中初始水相占比為總?cè)橐旱?.07%。研究目的是為了獲得能承載更多甜菜色素的乳液，而甜菜色素是溶于初始水相中，因此選取初始水相占比更大的50%丙三醇作為最佳助表面活性劑濃度。

2.2.4 甜菜色素最大添加量的確定

經(jīng)測定，甜菜色素粉末在含有50%丙三醇的pH5磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中的最大溶解度約為20%（w/w）。根據(jù)上述結(jié)果，固定油相總質(zhì)量為10g，司班80和吐溫80的比例為5∶5，助表面活性劑為50%的丙三醇，最大色素溶解度下的臨界增溶水質(zhì)量為1.65g。此時微乳體系中水相占比14.2%，葵花籽油占比42.9%，混合乳化劑占比42.9%，最大色素含量約為1.42%。

2.3 甜菜色素微乳液的表征

由上述結(jié)果得出的甜菜色素微乳液最佳配方如下：混合乳化劑中司班80和吐溫80的比例用5∶5，葵花籽油和混合乳化劑的比例用5∶5，助表面活性劑選用50%丙三醇。以此配方配置1.0%（w/w）的甜菜色素乳液并用于后續(xù)甜菜色素微乳液的表征。

2.3.1 微乳液類型的鑒定

根據(jù)1.3.3中（1）的方法進(jìn)行測定，亞甲基藍(lán)染劑在微乳液中因重力有些許移動、沒有擴(kuò)散，可以認(rèn)為制得的微乳液是W/O型乳液。

2.3.2 微乳液的離心穩(wěn)定性

根據(jù)1.3.3中（2）的方法進(jìn)行離心，通過離心前后對比可以得出，微乳液的外觀幾乎沒有任何變化，在經(jīng)過高強(qiáng)度的離心后仍然保持澄清透明，無沉淀、無聚集、無渾濁、無分層，反映此微乳液體系的穩(wěn)定性良好。

2.3.3 微乳液的儲藏穩(wěn)定性

根據(jù)1.3.3中（3）的方法進(jìn)行測定，微乳液在儲藏期間內(nèi)始終保持澄清透明，無沉淀、無聚集、無渾濁、無分層，說明甜菜色素微乳液體系的儲藏穩(wěn)定性良好。

2.4 微乳化對甜菜色素穩(wěn)定性的影響

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)上述結(jié)果確定的最優(yōu)微乳液配方，分別配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%（w/w）的甜菜色素微乳液和水溶液。在530nm處測定吸光值，根據(jù)測定結(jié)果繪制出甜菜色素微乳液與水溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4所示。

使用Excel 2013對測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，甜菜色素微乳液和水溶液擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均大于0.99，說明擬合效果好，微乳液和水溶液中甜菜色素含量與吸光值呈一定的線性關(guān)系。后續(xù)試驗可以使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線將530nm處測得的吸光值換算為樣品中的甜菜色素的含量。

2.4.2 光照穩(wěn)定性

將分別光照了0h（對照樣）、4h、8h、12h、16h的甜菜色素微乳液和水溶液在530nm處測定吸光值，之后通過2.4.1的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算甜菜色素含量并換算成保留率。甜菜色素水溶液在經(jīng)過16h自然光照射后，溶液的紅色略有變淡，甜菜色素的保留率在83%左右，這與其他學(xué)者研究得出的結(jié)果相似[10]。而甜菜色素微乳液在經(jīng)過16h自然光照射后，色澤基本沒有發(fā)生變化，且仍然保持澄清透明，甜菜色素的保留率在90%以上，說明制成微乳液對甜菜色素的光照穩(wěn)定性有一定的提升效果。

2.4.3 熱穩(wěn)定性

將在60℃電熱恒溫水槽中保溫了0min（對照樣）、30min、60min、90min、120min的甜菜色素微乳液和水溶液在530nm處測定吸光值，并對數(shù)據(jù)做與2.4.2相同的處理。

甜菜色素水溶液在經(jīng)過120min的保溫后，色澤發(fā)生明顯的變化，紅色變淡，甜菜色素保留率僅在61%左右。經(jīng)過120min保溫的微乳液顏色也有明顯的變淡，但整體體系仍然保持澄清透明，甜菜色素保留率在77%左右，說明制成微乳液對甜菜色素的熱穩(wěn)定性也有明顯提升。這與其他學(xué)者研究微乳化對花青素?zé)岱€(wěn)定性的提升有一定的相似性[11]。

3 結(jié)語

本文采用助表面活性劑濃度法制備微乳液并將甜菜色素包封在W/O型微乳液體系內(nèi)，研究微乳液體系對甜菜色素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，甜菜色素穩(wěn)定性最佳的pH為5；甜菜色素微乳液的最佳制備配方為混合乳化劑中司班80、吐溫80的質(zhì)量比為5∶5（HLB值為9.65），葵花籽油和混合乳化劑的質(zhì)量比為5∶5，助表面活性劑選用50%的丙三醇溶液，初始水相使用pH為5的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液（0.05mol/L，pH5）。最終微乳體系中的水相占比14.2%，葵花籽油占比42.9%，混合乳化劑占比42.9%，最大承載的甜菜色素量約為1.42%。經(jīng)鑒定甜菜色素微乳液為W/O型乳液，且具有良好的體系穩(wěn)定性和光熱穩(wěn)定性，研究結(jié)果為甜菜色素的穩(wěn)定性方法的開發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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