溶出型抗菌紡織品的體外細(xì)胞毒性評價

周曉芳

摘要

目的：探究溶出型抗菌紡織品的體外細(xì)胞毒性。方法：用MTT比色法檢測溶出型抗菌紡織品浸提液濃度對小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞相對增殖率的影響，并評價其細(xì)胞毒性。結(jié)論：細(xì)胞存活率隨著溶出型抗菌織物浸提液濃度的提高有所下降，但均高于空白對照組的70%，不認(rèn)為被測試樣有潛在細(xì)胞毒性。

關(guān)鍵詞：抗菌；紡織品；溶出型；細(xì)胞毒性；MTT比色法

1 引言

據(jù)國內(nèi)外學(xué)者研究，人體皮膚表層存在三類菌群：（1）常駐菌群（是保護(hù)人體免受有害微生物侵襲的屏障）；（2）過路菌群（往往是致病菌或條件致病菌）；（3）共生菌群（對常駐菌群有支持作用，對過路菌群有拮抗作用）。這三類菌群與皮膚共同構(gòu)成一個動態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，一旦平衡被打破，即可能導(dǎo)致皮膚感染或其他疾病[1]?？咕徔椘肪哂锌咕l(wèi)生自潔功能，一般為內(nèi)衣、鞋襪等直接接觸皮膚的紡織品，所以對其生物安全性提出很高要求，需在抗菌的同時又不會對人體造成傷害[2]。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FZ/T 73023—2012中規(guī)定了用暈圈法評價抗菌紡織品所用抗菌劑的溶出安全性。一方面可對抗菌劑的溶出性進(jìn)行判斷，另一方面為抗菌紡織品的安全性提供判定依據(jù)。其中規(guī)定：按照標(biāo)準(zhǔn)程序洗滌一次后測試，若抑菌圈寬度D>1mm，可判定為溶出型抗菌織物；經(jīng)洗滌一次后，用暈圈法測試溶出性，要求D<5mm。非溶出型抗菌劑與纖維上的羥基、氨基起反應(yīng)后與纖維結(jié)合，穩(wěn)定性強、緩釋速度均勻，故只觸及織物纖維被污染的微生物，絕少接觸到皮膚黏膜，具有較高的耐久性與安全性。溶出型的抗菌劑則用交聯(lián)樹脂固著在纖維上，抗菌物質(zhì)緩釋但不均勻，此類產(chǎn)品抗菌效果雖好，但會影響到皮膚層的菌群，所以無論從安全性還是從織物抗菌作用的耐久性考慮，這類抗菌劑不是最佳選擇[1]。本文將主要探究溶出型抗菌紡織品的體外細(xì)胞毒性。

2 試驗原理、試劑和材料

MTT細(xì)胞毒性檢測（參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.5—2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗》進(jìn)行）。

原理：該檢測方法是建立在通過細(xì)胞的代謝活性衡量細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上，黃色水溶性MTT[3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5，二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)]在活細(xì)胞內(nèi)會轉(zhuǎn)化為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。在甲瓚溶解于乙醇后，通過分光光度計可以測出顏色強度的變化從而推算出活細(xì)胞數(shù)。

試驗材料：細(xì)胞系，小鼠成纖維結(jié)締組織細(xì)胞（L929細(xì)胞），由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

設(shè)備和試劑：培養(yǎng)箱、超凈工作臺、水浴鍋、倒置相差顯微鏡、酒精燈、離心機(jī)、電子天平、96孔板分光光度計（配備570nm濾光片，參照650nm）、微板振蕩器、細(xì)胞計數(shù)器或血球計數(shù)器、移液器、8道移液器（批量稀釋用）、組織培養(yǎng)瓶、96孔組織培養(yǎng)微孔板、注射過濾器?；瘜W(xué)試劑、培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基（不含酚紅指示劑）、谷氨酰胺和碳酸氫鈉、胎牛血清（FCS）、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、MTT[3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5，二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)]、異丙醇（分析純）。

3 試驗部分

3.1 試驗準(zhǔn)備工作

培養(yǎng)基：準(zhǔn)備DMEM （含碳酸氫鈉緩沖體系）用于日常培養(yǎng)。10% 胎牛血清、4mM/L 谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素完全培養(yǎng)基置于4℃保存，且保存時間不超過兩周。

MTT溶液：將MTT溶解于無添加物、無酚紅的MEM培養(yǎng)基，濃度為1mg/mL。配好的溶液用注射過濾器過濾除菌（孔徑≤0.22?m）。MTT溶液應(yīng)在配制當(dāng)天使用。

樣品及其浸提準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備10份日常檢測中收集的來自不同公司生產(chǎn)的溶出型抗菌織物，厚度均小于0.5mm。樣品按ISO 10993-12：2012進(jìn)行浸提。試樣大小：6cm×10cm；陰性對照：2g高密度聚乙烯；萃取液：10mL不含血清的DMEM培養(yǎng)基。振蕩24h浸提所有溶液，玻璃器皿等應(yīng)消毒處理，且所有操作應(yīng)在超凈工作臺中的無菌條件和環(huán)境下進(jìn)行。

3.2 試驗方法

第1天：細(xì)胞復(fù)蘇后，要經(jīng)過2～3次傳代才能用于檢測。通過酶消化法（胰蛋白酶）將細(xì)胞培養(yǎng)物從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移出來，離心細(xì)胞懸液（200g、3min），然后將細(xì)胞重懸且將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×105 cells/mL。用多道排槍吸取100?L培養(yǎng)基加到96孔培養(yǎng)板的外圍孔（空白孔）。在剩余的孔中，加入100?L濃度為1×105cells/mL或1×104cells/mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h（5%CO2、37℃、濕度>90 %）至細(xì)胞形成半?yún)R合單細(xì)胞層。這個培養(yǎng)期確保細(xì)胞恢復(fù)且趨向?qū)?shù)生長期，為了避免試驗誤差，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞生長狀況。

第2天：培養(yǎng)24h之后，將孔中的培養(yǎng)基吸去。向每孔加入100?L含適當(dāng)濃度（100%、50%）樣品浸提液的處理培養(yǎng)基，加入100?L陰性對照（高密度聚乙烯0.2g/mL浸提）、陽性對照（含10% DMSO的MEM培養(yǎng)基）、空白對照（含10%血清MEM培養(yǎng)基），各試樣均做5個平行孔。培養(yǎng)細(xì)胞24h（5%CO2、37℃、濕度>90 %）。

第3天：處理24h之后，在倒置相差顯微鏡下檢查確認(rèn)接種細(xì)胞是否存在系統(tǒng)誤差，并觀察各試驗組和對照組細(xì)胞的生長特點。記錄下細(xì)胞由于檢測樣品浸提液的細(xì)胞毒性而產(chǎn)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。對照組細(xì)胞異常生長則說明試驗有錯誤，試驗需重做。在檢測完培養(yǎng)板后，小心棄去板中的培養(yǎng)基，因為浸提液中的還原劑同樣會降低MTT，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。然后向各孔中加入50?L的MTT溶液，培養(yǎng)2h（5%CO2、37℃、濕度>90%）之后棄去MTT溶液，每孔加入100?L異丙醇，輕輕晃動培養(yǎng)板約30min，隨后將板放入裝配了570nm濾光片的酶標(biāo)儀中讀取吸光度（參考波長650nm）。

3.3 試驗數(shù)據(jù)分析

計算細(xì)胞相對增殖率（RGR），RGR=試驗組吸光度平均值/空白對照組吸光度平均值×100%。將試驗組RGR轉(zhuǎn)化為0～4級材料毒性評級（CTS）。當(dāng)RGR≥100%、80%～99%、50%～79%、30%～49%、0～29%時，分別對應(yīng)細(xì)胞毒性等級0、1、2、3、4級。如果細(xì)胞存活率低于空白對照組的70%，那么被測樣品有潛在細(xì)胞毒性。

加入MTT檢測前，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，可見陽性對照組細(xì)胞數(shù)明顯降低，細(xì)胞胞體圓縮，大量壞死、崩解；空白對照組細(xì)胞輪廓清晰，呈梭形或多角狀，胞質(zhì)透明、較大，細(xì)胞數(shù)明顯增加；試驗組細(xì)胞形態(tài)無明顯異常，可見少量的細(xì)胞碎片和胞體圓縮（圖1）。

細(xì)胞毒性測定結(jié)果見表1。統(tǒng)計學(xué)分析表明，各試驗組、空白對照組的OD值與陽性對照組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；而各試驗組的OD值與空白對照組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。試驗組細(xì)胞毒性級別均為1級。

4 總結(jié)

MTT比色法是一種能快速檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性的比色分析法，已被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物毒理學(xué)和醫(yī)用材料的生物相容性評價。本試驗結(jié)果顯示：細(xì)胞存活率隨著溶出型抗菌織物浸提液濃度的提高有所下降，但均高于空白對照組的70%，試驗組細(xì)胞毒性評級均為1級，不認(rèn)為被測10份試樣有潛在細(xì)胞毒性。紡織品抗菌性能及安全性能的測試方法與實際穿著或其他應(yīng)用尚有相當(dāng)?shù)木嚯x，本試驗僅對10份溶出型抗菌紡織品進(jìn)行了相關(guān)評價和分析，具有一定的局限性。如果想要全面了解溶出型抗菌紡織品的安全性能，還需對該類抗菌紡織品進(jìn)行大量的試驗和考察，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]張復(fù)全， 郭金福. Cleancool?纖維的抗菌性能檢測及安全性評述[J].針織工業(yè)，2010（10）：27-31.

[2]張娟， 田新階， 龔?. RTCA技術(shù)對抗菌劑APP的體外細(xì)胞毒性評價[A]. 2014年（首屆）抗菌科學(xué)與技術(shù)論壇論文摘要集[C]. 2014：122-125.

（作者單位：廣州市纖維產(chǎn)品檢測研究院）endprint