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    內(nèi)蒙古賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)馬鹿夏季腸道菌群多樣性

    2023-02-22 02:49:28劉夫仁張正一馮中華張梓琪鮑偉東
    野生動(dòng)物學(xué)報(bào) 2023年1期
    關(guān)鍵詞:馬鹿厚壁菌門

    劉夫仁,賽 罕,賀 偉,張正一,馮中華,張梓琪,鮑偉東

    (1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京,100083;2.山東省棗莊市山亭區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,山亭,277200;3.內(nèi)蒙古賽罕烏拉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,大板,025150;4.赤峰市森林草原保護(hù)發(fā)展中心,赤峰,024005;5.赤峰市野生動(dòng)植物保護(hù)協(xié)會(huì),赤峰,024005)

    動(dòng)物體內(nèi)腸道中有數(shù)以萬億計(jì)的菌群,不同季節(jié)、飲食和棲息地的變化都會(huì)導(dǎo)致腸道菌群組成發(fā)生變化,達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[1-3]。腸道菌群與宿主存在相互影響,在不同物種之間腸道菌群也會(huì)發(fā)揮不同作用,如食草動(dòng)物糞便中分離出的菌株多具有纖維素分解功能,而從食肉動(dòng)物糞樣中分離出的菌株多具有分解脂肪的功能,同時(shí)腸道菌群也會(huì)反作用于宿主本身,促進(jìn)物種對(duì)棲息地、食性的選擇[4]。Li 等[5]的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群還可以擴(kuò)大動(dòng)物的食物生態(tài)位,某些植物為防止被動(dòng)物取食,會(huì)合成一些次生化合物,而動(dòng)物腸道菌群則可以消化這些化合物。

    食性是影響野生動(dòng)物腸道菌群的重要因素,不同的食物組成會(huì)影響宿主腸道菌群的多樣性及其群落結(jié)構(gòu),可以反映物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)程度。在雌雄性坡鹿(Rucervus eldii)的研究中發(fā)現(xiàn),不同性別之間腸道菌群組成無明顯差異,但菌群豐度存在差異,這種結(jié)果主要是由食物不同造成的[6]。對(duì)野生和圈養(yǎng)林麝(Moschus berezovskii)腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn),野生個(gè)體和圈養(yǎng)個(gè)體腸道群落存在顯著差別,圈養(yǎng)林麝擁有更高豐度的變形菌門(Proteobacteria)[7]。

    馬鹿(Cervus elaphus)生活于范圍較大的針闊混交林、林緣或靠近水源的林地,是國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[8]。對(duì)于馬鹿的生態(tài)研究涵蓋了食性、家域、種群遺傳結(jié)構(gòu)和行為習(xí)性等多方面內(nèi)容[9-12]。阿拉善馬鹿(C.e.alashanicus)冬季腸道菌群以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,顯示菌群群落組成與食性密切相關(guān)[13]。不同性別東北馬鹿(C.e.xanthopygus)的冬季菌群多樣性無顯著差異[14]。在內(nèi)蒙古賽罕烏拉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)有蹄類動(dòng)物中,馬鹿的種群數(shù)量較多[15],其他有蹄類動(dòng)物還包括野豬(Sus scrofa)、狍(Capreolus pygargus)和中華斑羚(Naemorhedus griseus)等[16]。近年來,隨著保護(hù)政策的落實(shí),野生動(dòng)物保護(hù)成效得到極大提升,各類動(dòng)物種群密度增加,這導(dǎo)致不同物種在生態(tài)位中存在激烈競(jìng)爭(zhēng),了解不同物種的適應(yīng)對(duì)策,有助于改進(jìn)保護(hù)管理策略。本研究旨在分析保護(hù)區(qū)內(nèi)夏季馬鹿的腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu),從食物資源利用和動(dòng)物健康角度認(rèn)識(shí)馬鹿的適應(yīng)性,為后期開展同域分布的有蹄類物種資源利用及競(jìng)爭(zhēng)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時(shí)也為馬鹿的保護(hù)提供新視角。

    1 研究方法

    1.1 樣品采集

    樣品采集于內(nèi)蒙古賽罕烏拉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),該保護(hù)區(qū)位于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市巴林右旗北部(43°59'—44°27' N,118°18'—118°55' E),屬于大興安嶺南段山地,占地總面積10.04萬 hm2[17]。2020年7—8 月,在保護(hù)區(qū)正溝、大東溝和大西溝按照樣線法取馬鹿糞便樣品35份(圖1),樣線間距500 m左右,每條樣線只取1份樣品(10粒),記錄糞便樣品形狀、大小和位置信息,樣品放入收集管中倒入95%乙醇冷凍保存。

    圖1 馬鹿腸道菌群多樣性分析糞樣采集點(diǎn)Fig.1 Pellets sampling sites for red deer gut microbiota diversity analysis

    1.2 DNA提取及測(cè)序

    使用E.Z.N.A 糞便DNA 提取試劑盒(Omega Bio-Tek)從糞便樣本中提取總DNA。使用腸道細(xì)菌通用引 物343F:5'-TACGGRAGGCAGCAG-3' 和798R:5'-AGGGTATCTAATCCT-3' 擴(kuò)增細(xì) 菌16S rRNA 基因V3—V4 高變區(qū)。通過PCR 反應(yīng)向16S rRNA 的產(chǎn)物末端加上帶有Index 的接頭,用于Illumina MiSeq 的NGS 測(cè)序。PCR 反應(yīng)體系為25.0 μL:模板DNA 20.0 ng,dNTPs 2.0 μL,引物各1.0 μL(10 μmol/L),TransStart Buffer 2.5 μL,TransStartTaqDNA 0.5 μL,用ddH2O 補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)設(shè)置:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性5 s,57 ℃退火90 s,72 ℃延伸10 s,24 個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸5 min。通過Qubit 3.0熒光計(jì)檢測(cè)DNA 樣品的濃度,采用MetaVx文庫(kù)試劑盒構(gòu)建DNA文庫(kù)。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    使用QIIME 數(shù)據(jù)包分析16S rRNA 測(cè)序數(shù)據(jù),使用UCHIME 去除嵌合序列,參考數(shù)據(jù)庫(kù)Silva 128 比對(duì)16S rRNA 序列,使用聚類程序Vsearch(1.9.6)將序列聚類為操作分類單位(OTU),序列相似性閾值設(shè)為97%?;贠TU 分析的結(jié)果,采用對(duì)樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法,以QIIME軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)(Chao1、Shannon和Simpson指數(shù))以反映腸道微生物群落的物種豐度和多樣性,采取Good’s coverage 曲線用于評(píng)估測(cè)序結(jié)果的群落物種總數(shù),判斷測(cè)序深度是否足夠。使用unweighted UniFrac 比較分析樣本間是否有顯著差異,基于Bray-Curtis 樣本間距離矩陣用于主坐標(biāo)分析(PCoA)可視化圖展示Beta多樣性,并進(jìn)行非度量多維尺度(NMDS)排序。

    2 結(jié)果

    2.1 測(cè)序結(jié)果

    經(jīng)過對(duì)16S rRNA 基因測(cè)序數(shù)據(jù)分析,35份馬鹿樣品共獲得2 287 019 條有效序列,其中最大有效序列數(shù)為70 650,最小有效序列數(shù)為50 488,每個(gè)樣品平均獲得有效序列為65 343。對(duì)有效序列進(jìn)行聚類分析,OTU 平均數(shù)量為2 553,其中核心OTU 數(shù)量為169(圖2)。Good’s coverage 曲線顯示測(cè)序深度平均達(dá)到99%以上,說明測(cè)序深度足以充分反映樣本真實(shí)性,可以進(jìn)一步分析(圖3)。

    圖2 馬鹿糞便樣品OTU的Venn圖Fig.2 Venn diagram of red deer fecal sample OTU

    圖3 馬鹿糞便樣品Good’s coverage曲線Fig.3 Good’s coverage curve of red deer fecal samples

    2.2 多樣性分析

    Chao1指數(shù)在樣本序列達(dá)到20 000時(shí),曲線趨于平緩,Chao1 最高值為4 358,最低值為2 648(圖4A);Shannon 指數(shù)在樣本序列為4 000 時(shí),曲線趨于平緩,最高值為9.9,最低值為6.3(圖4B);Simpson指數(shù)在樣本序列達(dá)到2 300 時(shí),曲線趨于平緩,最高值為0.99,最低值為0.96(圖4C)。結(jié)果表明,樣品的豐富度和多樣性都較高。

    圖4 馬鹿腸道菌群Alpha多樣性Fig.4 Alpha diversity of red deer gut bacteria community

    NMDS stress 數(shù)值小于0.2,除一份樣品(R25)可能存在測(cè)序深度不足外,其余樣本分布較均勻,個(gè)體無明顯差異(圖5A)。在PCoA 分析中,樣本分布較均勻,除R25 有明顯分隔,其余個(gè)體無明顯分離,種內(nèi)并無顯著差異(圖5B)。

    圖5 馬鹿腸道菌群β多樣性Fig.5 Beta diversity of red deer gut bacteria community

    2.3 群落結(jié)構(gòu)分析

    通過對(duì)OTU 聚類注釋分析,35 份馬鹿糞便樣品中共獲得38 菌門、777 菌屬,用相對(duì)豐度描述腸道菌群的組成。在門水平,相對(duì)豐度之和>95%的是擬桿菌門(29.55%)、變形菌門(29.30%)、厚壁菌門(29.30%)、放線菌門(Actinobacteria,5.78%)和芽單孢菌門(Gemmatimonadetes,1.99%),其余門水平的腸道菌群相對(duì)豐度較低(圖6)。

    圖6 馬鹿腸道菌群門水平相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of gut bacteria composition at the phylum level

    在屬水平,取相對(duì)豐度前15的菌屬進(jìn)行作圖,其中豐度超過1%的菌屬共11種,分別是擬桿菌屬(Bacteroides,4.30%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_UCG-005,3.34%)、埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella,2.87%)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter,2.62%)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group,2.43%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_UCG-014,1.98%)、另枝菌屬(Alistipes,1.88%)、普雷沃菌屬(Prevotella_1,1.70%)、乳桿菌屬(Lactobacillus,1.52%)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas,1.23%)(圖7)。

    圖7 馬鹿腸道菌群屬水平相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of gut bacteria composition at the genus level

    3 討論

    隨著第三代測(cè)序技術(shù)愈發(fā)成熟,高通量測(cè)序技術(shù)成為研究動(dòng)物腸道微生物的重要技術(shù)手段,如在大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)[18]、黑 犀(Diceros bicornis)[19]、駝鹿(Alces alces)[20]和川金絲猴(Rhinopithecus roxellana)[21]等腸道微生物研究中均使用該技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析。在駝鹿[20]、東北馬鹿[22]和牦牛(Bos grunniens)[23]等動(dòng)物腸道中,厚壁菌門和擬桿菌門都是優(yōu)勢(shì)菌門;在大熊貓[24]、野豬[25]中變形菌門是優(yōu)勢(shì)菌門??梢?,不同物種之間腸道微生物存在差異,這與物種棲息地、食性、年齡、性別甚至季節(jié)都有很大關(guān)系。

    本研究探究了夏季賽罕烏拉馬鹿腸道微生物的多樣性,除1 份樣品可能存在測(cè)序深度不足外,其余樣品中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門是主要優(yōu)勢(shì)菌門,這與賀蘭山馬鹿夏季腸道微生物的研究結(jié)果[26]類似,但菌群豐度存在一定差距,賽罕烏拉馬鹿的變形菌門和擬桿菌門的豐度大于賀蘭山馬鹿,厚壁菌門則較低。在一些有蹄類動(dòng)物腸道微生物研究中,往往都是厚壁菌門占優(yōu)勢(shì),擬桿菌門次之,變形菌門和其余菌門豐度較小,這可能與菌群在體內(nèi)發(fā)揮的作用不同有關(guān)。厚壁菌門在動(dòng)物體內(nèi)往往起到降解纖維、促進(jìn)消化與吸收的作用,同時(shí)厚壁菌門會(huì)促進(jìn)脂肪積累和動(dòng)物體重增加,但厚壁菌門中的鏈球菌會(huì)引起猩紅熱、膿皰病等[27];擬桿菌門同樣可以促進(jìn)食物的消化與吸收,其主要對(duì)蛋白質(zhì)及碳水化合物發(fā)揮作用,在消化方面往往與厚壁菌門達(dá)到協(xié)同作用,同時(shí)擬桿菌門也會(huì)感染宿主出現(xiàn)炎癥,如腹瀉或膿腫[28];變形菌門被認(rèn)為是體內(nèi)的危險(xiǎn)因素,當(dāng)其豐度劇烈變化時(shí)往往會(huì)伴隨疾病的發(fā)生[29],可見變形菌門是體內(nèi)腸道微生物健康與否的預(yù)警者,在個(gè)體尚未出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)動(dòng)物體內(nèi)的變形菌群豐度就已經(jīng)快速上升,食性、環(huán)境改變也會(huì)使得個(gè)體的變形菌門快速響應(yīng)[30]。本研究中的菌群構(gòu)成與李俊樂[26]的冬、夏季馬鹿研究結(jié)果相對(duì)比,變形菌門、酸桿菌門和志賀氏菌的豐度偏高,可能與賽罕烏拉保護(hù)區(qū)馬鹿感染腸炎等有關(guān)。出現(xiàn)腸炎的小鼠變形菌門豐度明顯高于正常小鼠,肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)等會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)發(fā)生不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng),造成局部炎癥[31]。田麗[32]在對(duì)炎癥性腸病研究中也證實(shí),炎癥個(gè)體腸道菌群變形菌門、Epsilonbacteraeota 和酸桿菌門豐度升高,厚壁菌門和擬桿菌門豐度明顯降低。在腸炎小鼠與正常小鼠腸道菌群研究中,在屬水平上普雷沃菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬和檸檬酸桿菌屬腸炎組豐度增加,與正常組小鼠有顯著區(qū)別[30]。檸檬酸桿菌中許多血清變型的抗原與埃希氏菌-志賀氏菌屬的抗原有關(guān),而普雷沃菌屬也是常見的條件致病菌,由其介導(dǎo)的黏膜炎癥可能會(huì)影響全身疾?。?3];毛螺菌屬和另枝菌屬有促進(jìn)腸黏膜修復(fù)的功能[34]。因此,賽罕烏拉保護(hù)區(qū)馬鹿或許存在腸道疾病風(fēng)險(xiǎn),具體原因還需進(jìn)一步研究,但在以后保護(hù)策略制定中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。

    本研究中馬鹿個(gè)體腸道微生物之間分散均勻,無明顯差別,這可能是食物影響造成不同個(gè)體腸道微生物趨同。在大熊貓的腸道微生物研究中發(fā)現(xiàn),獨(dú)特的食性使得大熊貓腸道微生物產(chǎn)生適應(yīng),食物的改變會(huì)使得菌群隨之變化[35];在圈養(yǎng)馬麝(Moschus chrysogaster sifanicus)和野生馬麝的研究中也推測(cè)食物是造成腸道菌群差異的主要因素,圈養(yǎng)個(gè)體的變形菌門和擬桿菌門豐度都高于野生個(gè)體[36];有趣的是,駝鹿在夏季取食林間邊緣草本植物和沼澤旁的水生植物時(shí),體內(nèi)的腸道菌群會(huì)受到取食地所處環(huán)境的影響[20],顯示來自環(huán)境微生物的效應(yīng)。本研究與此前對(duì)赤峰地區(qū)東北馬鹿冬季腸道微生物多樣性研究在群落豐度[14]上有明顯區(qū)別,冬季時(shí)厚壁菌門豐度(79.43%)遠(yuǎn)大于本研究的夏季(29.30%),而擬桿菌門(冬季16.64%,夏季29.55%)和變形菌門(冬季0.40%,夏季29.30%)豐度明顯減少,冬季的馬鹿食物多是高纖維的木本植物,需要更多厚壁菌門參與高纖維的消化與吸收,為馬鹿活動(dòng)提供能量;夏季時(shí)馬鹿取食植物多為草本植物,主要采食嫩芽、嫩葉等,因此擬桿菌門豐度更高。在阿拉善馬鹿冬、夏腸道菌群結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn),季節(jié)對(duì)馬鹿腸道菌群有重要影響,但發(fā)揮主要作用的還是食物[26]。以上研究都說明食物是動(dòng)物腸道微生物群落進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力,腸道微生物構(gòu)成反映了食物變化對(duì)動(dòng)物的影響。為更加深入了解季節(jié)變化對(duì)本區(qū)域馬鹿的影響以及動(dòng)物的適應(yīng),建議后期開展不同季節(jié)和食物組成的對(duì)比研究,從而為提高馬鹿保護(hù)管理成效提供充分的基礎(chǔ)信息。

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