衰老標記物沉默信息調(diào)節(jié)因子1、超氧化物歧化酶2、p21和Ku70在支氣管擴張中的作用機制研究

【摘要】目的 探討衰老標記物沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、p21、Ku70 mRNA在支氣管擴張（BE）中的表達差異，并分析其與BE嚴重程度的相關(guān)性。方法 選取2022年7月至2024年6月于廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院確診的85例BE患者，作為疾病組，另納入46名肺炎康復期或其他非慢性肺部疾病而接受肺泡灌洗的患者作為對照組，進行前瞻性研究；并根據(jù)BE嚴重程度將疾病組患者分為輕度、中度及重度。通過支氣管鏡檢查獲取肺泡灌洗液，提取RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，采用熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)檢測肺泡灌洗液Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表達情況，比較疾病組和對照組，不同嚴重程度疾病組Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表達水平；通過受試者工作特征（ROC）曲線分析Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表達水平對BE的診斷價值。結(jié)果 疾病組患者Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對表達量均低于對照組，p21 mRNA相對表達量高于對照組；重度組Sirtuin 1、SOD2 mRNA相對表達量均低于輕度組，p21 mRNA相對表達量高于輕度組，Ku70 mRNA相對表達量低于輕、中度組（均P<0.05）。ROC曲線分析顯示，Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA的相對表達量的最佳診斷截斷值分別為0.983、1.068、1.223、0.860，且4 個衰老標志物的曲線下面積（AUC）均超過0.600，并以Ku70 mRNA的AUC最大，為0.721，診斷效能均良好（均P<0.05）。結(jié)論 BE患者對比健康人Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對表達量均顯著降低，p21 mRNA的相對表達量明顯增高，和BE疾病進展相關(guān)，且Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA相對表達量對BE疾病程度均有良好的診斷價值。

【關(guān)鍵詞】沉默信息調(diào)節(jié)因子1 ; 過氧化物歧化酶 ; 細胞周期蛋白 ; DNA修復因子 ; 支氣管擴張 ; 作用機制

【中圖分類號】R563 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.23.0115.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.23.036

支氣管擴張（bronchiectasia，BE）是一種慢性進行性的氣道炎癥性疾病，其特征為持續(xù)性咳嗽、咳痰及氣道結(jié)構(gòu)不可逆性擴張和破壞。盡管已有研究揭示了氣道感染、慢性炎癥及氣道結(jié)構(gòu)破壞與BE相關(guān)[1]，但該疾病的確切病理機制尚未清晰。近年來，衰老生物學的快速發(fā)展為理解慢性疾病提供了新的視角，衰老標記物在多種慢性疾病中的異常表達已被廣泛報道[2]。特別是沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin1），通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細胞生長和應激反應蛋白有助于細胞抗氧化和延長壽命；超氧化物歧化酶2（SOD2）、p21及Ku70 mRNA分別在中和有害的自由基、控制細胞周期以響應DNA損傷及修復DNA雙鏈斷裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。然而，這些衰老標記物在BE中的相關(guān)性研究尚屬空白，因此，本研究旨在探討Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA在BE患者肺泡灌洗液的表達差異，以及其表達情況與BE嚴重程度的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年7月至2024年6月于廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院確診的85例BE患者，作為疾病組，另納入46名肺炎康復期或其他非慢性肺部疾病而接受肺泡灌洗的患者作為對照組，進行前瞻性研究。對照組研究對象男性24例，女性22例；年齡42～64歲，平均（51.39±5.64）歲。疾病組患者中男性37例，女性48例；年齡34～65歲，平均（49.69±6.11）歲。兩組研究對象一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），組間可比。納入標準：⑴符合《中國成人支氣管擴張癥診斷與治療專家共識》 [5]中的相關(guān)診斷標準；⑵經(jīng)胸部高分辨率CT（HRCT）診斷為BE；⑶入組前至少4周內(nèi)無口服、靜脈滴注或霧化吸入抗生素治療（除了長期使用低劑量大環(huán)內(nèi)酯類維持治療），合并用藥情況應盡量維持穩(wěn)定；⑷對照組研究對象為同期住院治療病情好轉(zhuǎn)恢復至肺炎康復期繼續(xù)接受肺泡灌洗的患者或其他非慢性肺部疾病如支氣管異物需接受肺泡灌洗的患者。排除標準：⑴妊娠、惡性腫瘤疾病或合并嚴重疾?。ㄈ缁顒悠诜谓Y(jié)核或心肌梗死等）；⑵不愿意參加隨訪。本研究經(jīng)過廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（倫理批號：2022-057-03），研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 BE嚴重程度及分組 使用支氣管擴張嚴重程度指數(shù)（BSI）量表[6]（0～26分），將85例BE患者分為輕度（0～4分，29例）、中度（5～8分，39例）、重度（≥9分，17例）。

1.2.2 肺泡灌洗液衰老標記物mRNA表達水平檢測 在進行支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)前，患者需完成血常規(guī)、凝血功能、輸血前四項檢查及心電圖，并在術(shù)前6 h禁食、禁飲。手術(shù)采用局部麻醉，使用2%鹽酸利多卡因注射液（廣西南寧百會藥業(yè)集團有限公司，國藥準字H45020569，規(guī)格：5 mL∶0.1 g）對鼻腔和咽喉部進行表面麻醉。使用纖支鏡（日本奧林巴斯公司，型號：Olympus P60）經(jīng)鼻腔進入氣管，根據(jù)胸部CT結(jié)果，通過活檢孔注入生理鹽水以清除痰栓，最后回收灌洗液，目標回收率為40%～50%。

使用TRIZOL試劑（Invitrogen，貨號：15596026）結(jié)合氯仿進行RNA的粗提取，并通過異丙醇沉淀進一步純化，得到的RNA在超微量分光光度計（Thermo Fisher，型號：NanoDrop Lite）上定量分析，并用無RNase水稀釋至工作濃度，逆轉(zhuǎn)錄反應將RNA轉(zhuǎn)換為cDNA，以備后續(xù)的基因表達分析。使用染料法熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測4種衰老標記物的表達水平，使用實時熒光定量PCR儀器（蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司，型號：Q2000B）及多重PCR擴增試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，編號：KT109]，對Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70及HRRT1（作為內(nèi)參基因）進行定量擴增分析。每個反應孔的體積設定為20 mL，包括2 mL的cDNA、10 mL的TB Green Premix Ex Tag Ⅱ、各0.8 mL的正反向引物（10 μmol/L），以及6.0 mL的無菌水。PCR程序包括95 ℃預變性5 min，隨后40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s的步驟，用于信號收集。每個樣本進行3次獨立測定，利用2-ΔΔCT方法計算肺泡灌洗液中Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA相對表達水平。

1.3 觀察指標 ⑴Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在對照組與疾病組研究對象肺泡灌洗液中的表達情況。⑵Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在不同嚴重程度BE患者肺泡灌洗液中的表達情況。⑶Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在BE病情診斷中的準確性。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析評估這些衰老標記物mRNA相對表達水平對BE的診斷價值。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 27.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料經(jīng)S-W法檢驗證實符合正態(tài)分布，用（ x ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；通過ROC曲線分析評估這些衰老標記物mRNA相對表達水平對BE的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和疾病組研究對象肺泡灌洗液衰老標志物mRNA表達量 疾病組患者Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對表達量均低于對照組，p21 mRNA相對表達量高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見表1。

2.2 不同嚴重程度BE患者肺泡灌洗液中衰老標志物mRNA表達量 重度組Sirtuin 1、SOD2 mRNA相對表達量均低于輕度組，p21 mRNA相對表達量高于輕度組，Ku70 mRNA相對表達量低于輕、中度組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見表2。

2.3 4種衰老標志物mRNA表達量對BE病情的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，4個衰老標志物 mRNA表達量的曲線下面積（AUC）均超過0.600，其中Ku70 AUC最大，為0.721，診斷效能均良好，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見圖1、表3。

3 討論

BE的病理機制涉及氣道炎癥、感染及結(jié)構(gòu)破壞的復雜相互作用，盡管已有研究揭示了這些因素與BE的相關(guān)性[7]，但具體的作用機制仍不完全清楚，研究已表明，衰老標記物的變化與多種慢性疾病的發(fā)展有關(guān)[2]。例如，氣道上皮細胞的衰老可能在BE的進展中發(fā)揮作用，但衰老標記物如Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA在BE中的表達及其與疾病嚴重程度的相關(guān)性尚需闡明。

BE的病理癥狀主要表現(xiàn)于肺部，肺部組織或其他肺部檢測樣本是反映衰老加速的最佳組織，因此本研究選取的檢測樣本是肺泡灌洗液。本研究結(jié)果顯示，與對照組比，疾病組中Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對表達量均降低，而p21 mRNA的相對表達量升高，且Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對表達量隨著病情嚴重而降低，p21 mRNA隨著病情嚴重而升高，這表明在BE的病理過程中，可能存在抗氧化和DNA修復能力的減弱，以及細胞周期調(diào)控的改變。分析其原因，Sirtuin家族在人體成熟組織、胚胎期組織及生殖細胞中廣泛存在[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Sirtuin 1能夠通過去乙酰化作用影響叉頭蛋白盒轉(zhuǎn)錄因子1（FOXO1），從而抑制氧化應激反應，降低細胞損傷[9]。一項初步研究顯示，BE患者氣道中Sirtuin 1 mRNA的相對表達量較健康人明顯減少[10]。在BE中，Sirtuin 1的表達下調(diào)可能通過促進細胞衰老、減弱抗氧化和抗炎能力，以及損害DNA修復機制，加劇氣道炎癥和結(jié)構(gòu)損傷。

SOD2主要作用為中和超氧自由基，以防止氧化應激引起的細胞損傷。有研究表明，急性肺損傷小鼠對比正常鼠SOD2顯著降低，槲皮素可干預激活Nrf2/HO-1信號通路轉(zhuǎn)導，減輕氧化應激與炎癥反應，提高SOD2，改善肺功能[11]。SOD2的降低可能意味BE患者氣道上皮細胞清除活性氧的能力受損，導致氧化應激的累積，進而加劇氣道炎癥和組織損傷[12]。

Ku70蛋白是參與DNA雙鏈斷裂修復的主要分子之一。Sirtuin 1對Ku70的去乙?；揎椏稍鰪奒u70的活性，并增強其介導的DNA修復[13]。LIU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從衰老個體分離的成纖維細胞DNA中Ku70的表達水平顯著降低。另一項研究中，DNA損傷可導致哮喘小鼠模型中氣道上皮細胞的Ku70表達下降，這表明Ku70蛋白可能通過穩(wěn)定細胞器功能來減少細胞死亡，其表達降低與哮喘患者氣道上皮的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞器障礙相關(guān)[15]。在BE中，Ku70的減少加劇了氣道上皮的損傷和功能障礙，進而促進了炎癥和病理進展。

在BE中，p21的高表達標志著氣道上皮細胞的衰老和功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)基因方法每月清除衰老小鼠中高表達p21的衰老細胞，能顯著延長其壽命和健康期[16]。有研究進一步指出，通過調(diào)控p53/p21信號通路抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞衰老抗肺纖維化，顯著降低肺纖維化模型中p21的表達，減輕Ⅱ型肺泡上皮細胞的衰老，從而有效降低炎癥反應，改善了肺纖維化[17]。這提示了p21在BE中的表達增加可能通過促進細胞周期停滯進而加劇氣道炎癥和結(jié)構(gòu)損傷。

此外，本研究中ROC曲線分析結(jié)果顯示，衰老標記物Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA診斷BE的AUC均超過0.600，均有較好的診斷價值。既往研究發(fā)現(xiàn)，Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在診斷牙周炎合并2型糖尿病、支氣管哮喘等疾病中同樣發(fā)揮一定應用價值[18-19]。這些發(fā)現(xiàn)進一步證實了衰老標記物在不同炎癥性疾病中的潛在診斷作用，強調(diào)了其作為生物標志物的廣泛適用性。

綜上，在BE患者中，Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的表達量較對照組低，而p21 mRNA的表達量則較高。且隨著BE病情的加重，Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA表達進一步下降，p21 mRNA表達上升，與疾病的嚴重程度相關(guān)，且均對BE病情具有良好的診斷價值。但研究受限于樣本量和橫斷面設計，難以推廣結(jié)果或確定因果關(guān)系，未來需擴大樣本，采用縱向研究以深入分析。

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