補腎活血方中l(wèi)ncRNA00667的分子作用與絕經(jīng)后膀胱過度活動癥的關(guān)系研究

【摘要】目的 通過揭示lncRNA00667在補腎活血方治療絕經(jīng)后膀胱過度活動癥（OAB）中的作用和相關(guān)機制，以期為全面和深入認(rèn)識OAB的分子遺傳學(xué)特征提供實驗研究依據(jù)。方法 選擇30只C57BL/6J大鼠（雌），隨機選取其中10只作為假手術(shù)組，另外20只經(jīng)切割卵巢構(gòu)建OAB模型，建模成功后隨機分成補腎活血方組和生理鹽水組，各10只，3組大鼠術(shù)后均常規(guī)飼喂1周。術(shù)后1周補腎活血方組、生理鹽水組分別灌胃補腎活血方與等量生理鹽水，干預(yù)12周。記錄3組大鼠每天的排尿量、排尿間隔時間及排尿次數(shù)；處死

3組大鼠，比較3組大鼠體質(zhì)量、膀胱稱重及臟器指數(shù)；取大鼠血漿、膀胱上皮細(xì)胞檢測lncRNA00667基因表達情況。結(jié)果 假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量和膀胱稱重均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組的體質(zhì)量高于生理鹽水組（均P<0.05），生理鹽水和補腎活血方組大鼠膀胱稱重，以及3組大鼠間膀胱臟器指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）；假手術(shù)組大鼠每次尿量、排尿次數(shù)均少于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組每次尿量少于生理鹽水組，假手術(shù)組排尿間隔時間長于生理鹽水組（均P<0.05），生理鹽水組和補腎活血方組排尿次數(shù)和排尿間隔時間比較，以及補腎活血方組和假手術(shù)組排尿間隔時間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）；假手術(shù)組大鼠血漿和膀胱平滑肌的lncRNA00667表達量均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組大鼠血漿lncRNA00667的表達均高于生理鹽水組（均P<0.05），但補腎活血方組和生理鹽水組大鼠膀胱平滑肌中l(wèi)ncRNA00667的表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 采用補腎活血方對絕經(jīng)后OAB大鼠模型進行干預(yù)，可提高lncRNA00667表達水平，改善大鼠排尿活動，促進體質(zhì)量的恢復(fù)，從而獲得較好的效果。

【關(guān)鍵詞】膀胱過度活動癥 ; 補腎活血方 ; lncRNA00667 ; 分子功能

【中圖分類號】R694 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.23.0030.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.23.010

膀胱過度活動癥（overactive bladder， OAB）作為臨床上的一種常見病、多發(fā)病，其常見癥狀有尿急、尿失禁、夜尿增多及尿頻等，且該病具有病程長、遷延不愈的特點，不僅危害患者身心健康，在一定程度上還加重了患者的精神和生理負(fù)擔(dān)。OAB是老年婦女常見病，考慮可能與絕經(jīng)后女性雌激素水平降低，從而促使膀胱頸周圍致密彈力纖維組織、膀胱頸腺體及其導(dǎo)管變薄，導(dǎo)致疾病的發(fā)生有關(guān)。對于OAB患者，臨床上以對癥治療為主，雌激素替代治療是預(yù)防OAB和絕經(jīng)后綜合征的主要方法。但內(nèi)分泌替代療法會產(chǎn)生嚴(yán)重的心、血管、肝臟等不良反應(yīng)，以及增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生風(fēng)險。因此尋找和研發(fā)OAB的更有效的治療方法和手段是臨床研究的重點。一般來說，大部分疾病的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因改變、多步驟演進的復(fù)雜過程，目前有許多基因如miR-139-5p、miR-98-5p、Arg已被證實與OAB的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，并有望成為OAB新的分子標(biāo)記物和治療靶點[1]。有研究指出，在生物調(diào)控中，蛋白質(zhì)作為一種執(zhí)行元件，其中長鏈非編碼核糖核酸

（lncRNA）與蛋白質(zhì)通過互相作用，可以作用于生物調(diào)控。lncRNA對基因表達進行調(diào)控的方法較多，并且呈現(xiàn)出多樣化的特點[2]。lncRNA00667作為lncRNA家族的一員，在絕經(jīng)后機體表達上調(diào)后，lncRNA00667可使雌激素水平增加，改善內(nèi)分泌，使肌肉收縮力下降，對逼尿肌收縮進行抑制，從而達到緩解疾病癥狀的目的[3]。對于絕經(jīng)后OAB，中醫(yī)經(jīng)典著作中并沒有相關(guān)論述，但是以其病證分析和癥狀表現(xiàn)特點為基本依據(jù)，可以將其劃分為“小便不禁”“遺尿”“小便頻數(shù)”“淋癥”等范疇，認(rèn)為其病機病因是命門火衰、腎氣虧虛，膀胱氣化無力，早期以濕熱入侵機體在下焦中聚集，或氣機阻滯、情志不舒，阻礙氣血正常運行，使“瘀”“熱”“濕”互結(jié)，對膀胱氣化功能產(chǎn)生影響，久至肝、腎、脾虧虛，本虛標(biāo)實，加劇氣化不利，所以治療應(yīng)遵循補腎益氣、活血化瘀的基本原則[4]。補腎活血方作為中醫(yī)的一個經(jīng)驗方，方中枸杞、熟地黃可以平補腎中陰陽以益腎氣，獨活、沒藥、山茱萸及杜仲等具有消瘀散結(jié)、活血化瘀的功效，與歸尾、補骨脂等合用，不僅可以活血破瘀，還能養(yǎng)血生新，全方共奏活血補腎的功效[5]?；诖耍狙芯恐荚谔接憀ncRNA00667在絕經(jīng)后OAB采用補腎活血方治療中的分子功能與作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇C57BL/6J雌性大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，3月齡，SPF級喂養(yǎng)5～7 d以適應(yīng)環(huán)境，觀察無不良反應(yīng)后，納入實驗。所有大鼠均是來自南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）醫(yī)學(xué)實驗動物中心的SPF級動物，動物許可證編號：SCXK（粵）2022-0002。

1.2 主要儀器和試劑 主要儀器：水套式二氧化碳培養(yǎng)箱[上海一恒科技有限公司，型號：BPN-80CW（UV）]，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測系統(tǒng)（杭州博日科技股份有限公司，型號：FQD-96A），DNA序列分析電泳儀（上海艾研生物科技有限公司，型號：Mini-SUB Cell），凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂生物科技有限公司，型號：ChemiDoc MP），倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會社，型號：IX73），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)[孚約生物科技（上海）有限公司，型號：ChemiDoc]等。

主要試劑：100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清（上海勁馬生物科技有限公司）；高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]等。

1.3 絕經(jīng)后OAB大鼠模型構(gòu)建與分組 選擇30只C57BL/6J雌性大鼠，隨機選取其中10只健康、體質(zhì)量相似的大鼠作為假手術(shù)組，接受與實驗組相同的手術(shù)操作，但未切除目標(biāo)器官；另外20只切割卵巢構(gòu)建絕經(jīng)后OAB大鼠模型，建模成功后隨機分為兩組，每組10只，分別是補腎活血方組和生理鹽水組，確保3組大鼠在術(shù)后體質(zhì)量和活動能力正常，無術(shù)后異常反應(yīng)表明建模成功，常規(guī)飼喂1周。術(shù)后1周，補腎活血方組灌胃補腎活血方，根據(jù)1 mL/（100 g·d）體質(zhì)量給予補腎活血方（熟地黃、肉蓯蓉各20 g，補骨脂、菟絲子、山茱萸各15 g，杜仲、枸杞、歸尾、沒藥、獨活各10 g組成，冷水煎煮藥材，取汁100 mL，含生藥量1.35 g/mL）灌胃，控制時間在3 min；而生理鹽水組于術(shù)后1周給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)干預(yù)12周。

1.4 研究方法

1.4.1 排尿活動測定 采用代謝籠法，即在簡易代謝籠內(nèi)放入大鼠，通過籠底部的大小便分離漏斗分開糞便與尿液，對尿液進行采集，并且記錄每天的排尿量、排尿間隔時間及排尿次數(shù)，持續(xù)30 d，計算平均值。

1.4.2 lncRNA00667基因表達水平檢測 干預(yù)12周后，通過切尾采血的方法進行全血采集，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑，然后放入離心管中，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速進行10 min離心處理后取上層血漿。膀胱平滑肌標(biāo)本制備：在無菌條件下，通過手術(shù)解剖取大鼠膀胱組織，運用磷酸鹽緩沖液對膀胱組織進行清洗后，將雜質(zhì)和血液去除，然后在低溫條件下，運用解剖刀對膀胱平滑肌層進行分離，操作時盡量避免對組織造成損傷，完成操作后，在液氮中冷凍組織。采用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將核糖核酸（RNA）逆轉(zhuǎn)錄為互補cDNA，將20 μL RNA應(yīng)用于整個反應(yīng)體系中。具體條件：95 °C條件下進行30 s變性后，56 °C條件下進行45 s退火，72 °C條件下進行45 s延伸，再根據(jù)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)針對PCR反應(yīng)循環(huán)35個，運用生物系統(tǒng)TaqMan微小RNA檢測試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供]方案進行逆轉(zhuǎn)錄后檢測lncRNA00667水平，其中l(wèi)ncRNA00667的正向引物序列為5’-CGACCCCAACACCTTCTTTG-3’，反向引物序列為5’-CTCACCCTAAGTTCGCTGG-3’。

1.4.3 體質(zhì)量、膀胱稱重及臟器指數(shù) 在結(jié)束實驗后對大鼠進行稱重，然后通過頸椎脫臼法處死后取膀胱，分別稱取總量；對膀胱臟器指數(shù)進行計算，即膀胱臟器指數(shù)=膀胱臟器質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（mg）×1 000，計算出每只實驗動物的膀胱臟器指數(shù)，并記錄各組數(shù)據(jù)。

1.5 觀察指標(biāo) ⑴比較3組大鼠的體質(zhì)量、膀胱稱重及臟器指數(shù)；⑵比較3組大鼠的排尿活動，包括每次尿量、排尿次數(shù)、排尿間隔時間；⑶比較3組大鼠血漿和膀胱平滑肌組織中l(wèi)ncRNA00667基因表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均使用S-W法檢驗證實服從正態(tài)分布，以（ x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體質(zhì)量、膀胱稱重及臟器指數(shù)比較 假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量和膀胱稱重均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組的體質(zhì)量高于生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），生理鹽水和補腎活血方組大鼠膀胱稱重，以及3組大鼠間膀胱臟器指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），見表1。

2.2 3組大鼠的排尿活動情況比較 假手術(shù)組大鼠每次尿量、排尿次數(shù)均少于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組每次尿量少于生理鹽水組；假手術(shù)組排尿間隔時間長于生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），生理鹽水組和補腎活血方組排尿次數(shù)和排尿間隔時間比較，以及補腎活血方組和假手術(shù)組排尿間隔時間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），見表2。

2.3 3組大鼠血漿和膀胱平滑肌lncRNA00667水平比較 假手術(shù)組大鼠血漿和膀胱平滑肌的lncRNA00667表達量均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組大鼠血漿lncRNA00667表達量均高于生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），而補腎活血方組和生理鹽水組小數(shù)膀胱平滑肌中l(wèi)ncRNA00667表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

3 討論

目前，關(guān)于OAB的發(fā)生機制，當(dāng)前學(xué)說較多如肌源性、神經(jīng)激肽、神經(jīng)源性及膀胱上皮屏障等，其是多種因素相互作用的結(jié)果。因此，深入探究OAB的發(fā)生機制，且對具有特異性和不良反應(yīng)較小的藥物進行開發(fā)是OAB治療的一個重要方向。

OAB基本病機包括膀胱氣化功能失常、腎虛、濕熱蘊結(jié)，作為一種本虛標(biāo)實之證，以膀胱濕熱和腎虛為主，所以治療原則是“虛則補之，實則瀉之”?！秱拼蟪伞窞檠a腎活血方的主要出處，方中杜仲、熟地黃、山茱萸、枸杞子、肉蓯蓉、補骨脂及菟絲子等可以強筋壯骨、溫補腎陽；輔以沒藥、獨活、歸尾可以溫腎補陽、填補精血、止痛通絡(luò)、祛瘀活血，全方共奏止痛、活血養(yǎng)血、壯筋補腎的功效。

由于女性泌尿生殖系統(tǒng)來源于胚胎原始生殖竇，共為雌激素依賴的器官，在生長發(fā)育中受雌激素影響，因此雌激素不足必然會對下尿路結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。絕經(jīng)期女性卵巢功能逐漸減退，內(nèi)分泌功能失調(diào)，減少體內(nèi)雌激素分泌，使下丘腦功能和自主神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，再加上雌激素水平下降，促使平滑肌對神經(jīng)刺激應(yīng)答性下降，引起膀胱平滑肌收縮無力，同時引起膀胱尿道黏膜血流供應(yīng)減少，導(dǎo)致黏膜萎縮，彈性纖維變薄，從而誘發(fā)膀胱上皮萎縮性改變，出現(xiàn)尿頻、尿急等尿路功能障礙癥狀。本次研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠每次尿量、排尿次數(shù)均少于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組每次尿量少于生理鹽水組，假手術(shù)組排尿間隔時間長于生理鹽水組，這表明補腎活血方能夠改善OAB大鼠臨床癥狀。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山茱萸中環(huán)烯醚萜苷可以抗血小板聚集，使血漿黏稠度下降，對膀胱尿道黏膜血流供應(yīng)血液循環(huán)起到一定的促進作用，使組織器官的生理功能維持正常，從而改善尿路功能障礙癥狀[6]；肉蓯蓉中的肉蓯蓉總苷、苯丙醇糖等能夠改善下丘腦 - 垂體 - 性腺軸平衡失調(diào)，以促性腺激素釋放激素、性激素、促性腺激素釋放，從而促進陰道和尿道上皮細(xì)胞成熟，增加尿道平滑肌α腎上腺素能受體的敏感性，使尿道平滑肌收縮，從而增強大鼠排尿控制能力，可使尿液的不自主排泄減少，改善排尿功能[7]。

在本次研究中，為了更全面分析補腎活血方的作用，各組大鼠結(jié)束實驗后稱重，結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量和膀胱稱重均高于生理鹽水組和補腎活血方組，且補腎活血方組的體質(zhì)量高于生理鹽水組，這提示采取補腎活血方治療能夠促進切割卵巢大鼠的體質(zhì)量恢復(fù)。分析其原因為，補腎活血方中含有的沒藥、歸尾等中藥成分能活血養(yǎng)血，對切割卵巢的大鼠切口抗炎和促進血液循環(huán)，并增強體質(zhì)和免疫功能，從而促進身體恢復(fù)，進而促進體質(zhì)量恢復(fù)[8]。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，其序列元件處于高度保守狀態(tài)，空間二級結(jié)構(gòu)比較特殊，亞細(xì)胞定位明確，還有細(xì)胞或者組織表達特異性，說明在細(xì)胞總轉(zhuǎn)錄物種，這些所占比例較高。lncRNA雖然缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，但其生物學(xué)功能比較重要，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后OAB患者中，lncRNA00667表達上升后，可增強細(xì)胞間興奮傳遞功能，并且OAB患者膀胱逼尿肌lncRNA00667表達和功能明顯增加[9]。本次研究顯示，采用補腎活血方治療后，其血漿和膀胱平滑肌中的lncRNA00667水平均升高，說明補腎活血方能夠使OAB大鼠血漿中的lncRNA00667水平升高，從而達到對OAB進行抑制的效果。分析其原因為，方中杜仲、熟地黃、山茱萸、補骨脂及菟絲子等合用，能夠利用抗氧化應(yīng)激功效，將自由基清除，抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞免疫功能增強，對激素平衡進行調(diào)節(jié)，并且還能增強下丘腦 - 垂體 - 性腺軸功能，升高lncRNA00667水平，使雌激素水平增加，改善內(nèi)分泌，使肌肉收縮力下降，對逼尿肌收縮進行抑制，從而達到治療目的[10]。

綜上，采用補腎活血方對絕經(jīng)后OAB大鼠模型進行干預(yù)，可提高lncRNA00667表達水平，改善大鼠排尿活動，促進體質(zhì)量的恢復(fù)，從而獲得較好的效果。但是方中是何種成分在治療中起到主導(dǎo)作用，未來還需進一步探索。

參考文獻

FIRAT E， AYBEK Z， AKGüN ?， et al. Exploring biomarkers in the overactive bladder： Alterations in miRNA levels of a panel of genes in patients with OAB[J]. Neurourol Urodyn， 2019， 38（6）： 1571-1578.

劉志宇， 曹安， 蔣林樹， 等. 長鏈非編碼RNA（lncRNA）生物學(xué)功能及其調(diào)控機制[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2018， 26（8）： 1419-1430.

黎瑩， 陳士嶺. miRNA和lncRNA在早發(fā)性卵巢功能不全中的研究進展[J]. 實用婦產(chǎn)科雜志， 2017， 33（12）： 902-905.

陳水蘭， 趙色玲， 陳清香. 針?biāo)幉⒂弥委熃^經(jīng)后膀胱過度活動癥療效及對尿液神經(jīng)生長因子水平的影響[J]. 上海針灸雜志， 2019， 38（10）： 1150-1153.

陶帥， 姜宏， 周海燕. 基于Akt/mTOR信號通路探討補腎活血方對去卵巢大鼠軟骨細(xì)胞自噬的影響[J]. 中國骨傷， 2024， 37（2）： 196-206.

李佳欣， 陳思琦， 葛鵬玲. 山茱萸藥理學(xué)研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2022， 24（4）： 63-66.

任慧杰， 安立文， 郭玉巖， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及肝腎同源理論探討肉蓯蓉 - 巴戟天干預(yù)遲發(fā)性性腺功能減退癥作用機制[J]. 臨床醫(yī)學(xué)進展， 2022， 12（8）： 7449-7461.

王怡青， 黃宏麗， 夏艷秋， 等. 補腎活血方對腎虛血瘀型早發(fā)性卵巢功能不全患者免疫平衡的調(diào)節(jié)作用[J]. 天津中醫(yī)藥， 2024， 41（5）： 559-564.

QU H C， ZHANG W， LIU Y L， et al. Association between polymorphism of β3-adrenoceptor gene and overactive bladder： A meta-analysis [J]. Genet Mol Res， 2015， 14（1）： 2495-2501.

凌小艷， 韓平， 崔曉華. 疏肝補腎活血湯聯(lián)合刮痧對女性更年期綜合征患者內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志， 2021， 48（12）： 151-154.