臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對心肌梗死小鼠心肌損傷的保護(hù)作用

【摘要】目的 探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）來源的外泌體（Exos）對心肌梗死（MI）小鼠心功能、心肌細(xì)胞凋亡蛋白及心肌組織損傷的影響。方法 將UCMSCs培養(yǎng)至第3～9代，分離UCMSCs中的Exos，應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WB）鑒定其表面標(biāo)志物CD63、CD81蛋白，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測miR-152-3p的相對表達(dá)量。取C57BL/6雄性小鼠15只，以隨機(jī)數(shù)字表法分為sham組（5只）、MI組（5只）、MI+UCMSCs-Exos組（5只），采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建MI模型小鼠，其中MI+UCMSCs-Exos組小鼠造模成功后將50 μL Exos均分為4份，注射至小鼠梗死區(qū)域周圍4點(diǎn)，并于術(shù)后第2、5、7、9、12天行尾靜脈注射50 μLExos，sham組與MI組小鼠于同時(shí)間點(diǎn)以等量的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）處理。3組小鼠術(shù)后均觀察14 d。比較術(shù)后14 d 3組小鼠的心功能、血清miR-152-3p表達(dá)、心臟質(zhì)量（HW）/脛骨長度（TL）、心肌組織病理形態(tài)學(xué)及心肌細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）蛋白、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達(dá)水平。結(jié)果 UCMSCs-Exos中的CD63、CD81蛋白表達(dá)量及miR-152-3p的相對表達(dá)量均高于UCMSCs；術(shù)后14 d，與sham組比，MI組與MI+UCMSCs-Exos組小鼠血清miR-152-3p、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）水平均下降，HW/TL水平均升高，與MI組比，MI+UCMSCs-Exos組小鼠血清miR-152-3p、LVEF、LVFS水平均升高，HW/TL水平下降；術(shù)后14 d，與sham組比，MI組與MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞受損、細(xì)胞排列紊亂、心肌纖維增生、細(xì)胞間隙增大、炎癥細(xì)胞浸潤，與MI組比，MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞受損減輕、細(xì)胞排列稍紊亂、心肌纖維增生較少、細(xì)胞間隙的變化較小、炎癥細(xì)胞浸潤較少；術(shù)后14 d，與sham組比，MI組與MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bax蛋白表達(dá)水平升高，與MI組比，MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bax蛋白表達(dá)水平下降（均P<0.05）。結(jié)論 UCMSCs來源的Exos可改善MI小鼠的心功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心臟組織病理改變，且Exos在MI中發(fā)揮保護(hù)作用可能與高表達(dá)miR-152-3p有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】心肌梗死 ; 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 ; 外泌體

【中圖分類號】R541 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.23.0026.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.23.009

心肌梗死（myocardial infarct，MI）是臨床上較嚴(yán)重的一種心肌缺血性疾病，主要是由于心肌細(xì)胞凋亡和心肌重塑對心臟功能造成了不可逆的損傷?，F(xiàn)階段，臨床上主要采取介入手術(shù)和溶栓治療MI，但其對壞死心肌組織的治療效果不甚理想[1]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）是新生兒臍帶組織中具有自我更新能力和多向分化潛能的多功能干細(xì)胞，在研究中被證實(shí)可以有效改善MI模型動物的心功能，且其外泌體（Exos）中的微小RNA（miRNA）可抑制MI后心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷[2]。研究表明，UCMSCs來源的Exos中表達(dá)量較大的miRNA之一為miR-152-3p，其在缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，并提高細(xì)胞存活率[3]?；诖?，本研究旨在探討UCMSCs來源的Exos對MI小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞、主要試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6雄性小鼠[湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（鄂）2024-0013]，雄性小鼠6～8周齡，平均（7.35±0.64）周；體質(zhì)量18～22 g，平均（20.46±1.48）g。飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室中，無特定病原體環(huán)境，溫度20～26 °C，濕度40%～70%，所有小鼠均可自由獲取水和食物，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，無不良反應(yīng)后納入實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)華南理工大學(xué)附屬第六醫(yī)院（佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院）動物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 UCMSCs（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.1.3 主要試劑與儀器 miR-152-3p與U6引物（廣州銳博生物科技公司）。胎牛血清、TRIzol試劑[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；One Step PrimeScript miRNA cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；SYBR GreenPCR試劑（MedChemExpress）；CD63、CD81、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）一抗與羊抗兔免疫球蛋白G[辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記]二抗（Abcam）；放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（上海碧云天生物公司）。分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：NanoDrop 2000]；超聲成像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics，型號：Vevo 2000）；倒置顯微鏡（Olympus，型號：CKX31）。

1.2 研究方法

1.2.1 UCMSCs培養(yǎng) UCMSCs用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于5% CO2、37 °C的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取培養(yǎng)至第3～9代中生長良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Exos分離與鑒定 UCMSCs用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌，隨后在不含Exos的DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，收集條件培養(yǎng)基，離心（1 500 r/min，30 min）后取上清液，使用分離試劑收集上清液中的Exos。分別應(yīng)用RIPA裂解液提取細(xì)胞、Exos總蛋白，以BCA法定量檢測其蛋白濃度。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WB）鑒定Exos表面標(biāo)志物（CD63和CD81），蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入CD63（1∶1 000）和CD81（1∶1 000）一抗，于4 °C下孵育過夜。洗膜后加入羊抗兔免疫球蛋白G（HRP標(biāo)記）二抗（1∶2 000），于37 ℃下孵育1 h，以ECL法顯影。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，應(yīng)用ImageJ軟件計(jì)算目的蛋白的相對灰度值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測Exos中miR-152-3p的表達(dá) 分別提取UCMSCs與Exos總RNA，應(yīng)用分光光度計(jì)測定其濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA模板5 μL，正向引物與反向引物各0.5 μL、SYBR GreenPCR 10μL、加水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 °C預(yù)變性2 min，95 °C變性15 s、60 °C退火30 s、72 °C延伸15 s。應(yīng)用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-152-3p的相對表達(dá)量。進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，取其平均值。

1.2.4 動物分組與造模 選取C57BL/6小鼠15只，以隨機(jī)數(shù)字表法分為sham組（5只）、MI組（5只）、MI+UCMSCs-Exos組（5只）。sham組小鼠僅打開胸腔，不進(jìn)行冠狀動脈結(jié)扎處理，MI組與MI+UCMSCs-Exos組小鼠均進(jìn)行造模處理。小鼠麻醉后，常規(guī)備皮并消毒，在心臟搏動最明顯處，作一長約2.5 cm的切口，鈍性分離皮膚與皮下肌肉層，暴露肋骨，剪斷第三、四根肋骨及肋間肌，打開胸腔，剪開心包膜，在左心耳下方2～3 mm處由右向左穿過心肌，結(jié)扎冠狀動脈，觀察左心室壁變得蒼白，關(guān)閉胸腔并縫合。心電圖檢測出現(xiàn)ST段上抬或T波倒置提示造模成功。MI建模成功后，取1.2.2中已鑒定的50 μL Exos，將其均分為4份，注射至MI+UCMSCs-Exos組小鼠梗死區(qū)域周圍4點(diǎn)處，sham組與MI組小鼠注射等量PBS。于術(shù)后第2、5、7、9、12天時(shí)，MI+UCMSCs-Exos組小鼠行尾靜脈注射50 μL Exos治療，sham組與MI組小鼠注射等量的PBS。術(shù)后14 d，對3組小鼠實(shí)施安樂死，分離其心臟組織。

1.2.5 WB法檢測心肌細(xì)胞凋亡蛋白 取各組小鼠適量心臟組織，應(yīng)用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法定量檢測蛋白濃度。應(yīng)用WB法檢測心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平，取每組小鼠25 μg蛋白樣品，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h。加入Bcl-2（1∶2 000）和Bax（1∶1 000）一抗后孵育，經(jīng)洗膜、二抗孵育、顯影處理后，應(yīng)用ImageJ軟件計(jì)算目的蛋白的相對灰度值。

1.2.6 蘇木精 - 伊紅（HE）染色 將各組小鼠心臟組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后進(jìn)行切片，厚度5 μm，切片脫蠟至水化，行常規(guī)HE染色，經(jīng)脫水、透明、中性樹脂封片處理，在顯微鏡下觀察心臟組織的形態(tài)變化。

1.3 觀察指標(biāo) ⑴UCMSCs分泌的Exos的鑒定及其miR-152-3p的表達(dá)量。應(yīng)用WB法檢測CD63、CD81蛋白表達(dá)量；應(yīng)用RT-PCR法檢測miR-152-3p的相對表達(dá)量。⑵心功能。術(shù)后14 d，抽取小鼠腹主動脈血1 mL，離心（2 000 r/min，20 min），取上層血清，應(yīng)用RT-PCR法檢測血清中miR-152-3p的相對表達(dá)量；應(yīng)用經(jīng)胸超聲心動圖測定小鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）；分離心臟組織后，測定心臟質(zhì)量（HW），測量小鼠脛骨長度（TL），并計(jì)算HW/TL。⑶HE染色。術(shù)后14 d，比較3組小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)。⑷凋亡蛋白表達(dá)。術(shù)后14 d，應(yīng)用WB法測定3組小鼠心肌細(xì)胞凋亡Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料經(jīng)S-W檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以（ x ±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCMSCs來源的Exos的鑒定及其miR-152-3p的表達(dá)量 UCMSCs-Exos中CD63、CD81蛋白的表達(dá)量分別為（3.46±0.37）、（2.98±0.31），miR-152-3p的相對表達(dá)量為（6.72±0.78），均高于UCMSCs的（1.00±0.09）、（1.00±0.09）、（1.00±0.09），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.190、10.620、12.840，均P<0.05），見圖1。

2.2 3組小鼠心功能比較 術(shù)后14 d，與sham組比，MI組與MI+UCMSCs-Exos組小鼠血清miR-152-3p、LVEF、LVFS水平均下降，MI+UCMSCs-Exos 組高于MI組；HW/TL水平均升高，MI+UCMSCs-Exos 組低于MI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表1。

2.3 3組小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)比較 術(shù)后14 d，與sham組比，MI組與MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞受損、細(xì)胞排列紊亂、心肌纖維增生、細(xì)胞間隙增大、炎癥細(xì)胞浸潤；與MI組比，MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞受損減輕、細(xì)胞排列稍紊亂、心肌纖維增生較少、細(xì)胞間隙的變化相對較小、炎癥細(xì)胞浸潤較少，見圖2。

2.4 3組小鼠心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平比較 術(shù)后14 d，與sham組比，MI組與MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降， MI+UCMSCs-Exos 組高于MI組，Bax蛋白表達(dá)水平升高， MI+UCMSCs-Exos 組低于MI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表2、圖3。

3 討論

MI是臨床上常見的心血管疾病，由MI引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)、心功能受損，影響患者生命安全，且近年來，其發(fā)病率呈升高趨勢，加重社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。藥物治療、介入手術(shù)等傳統(tǒng)治療方法可有效降低MI患者的死亡率，但因心室重構(gòu)無法逆轉(zhuǎn)，部分患者治療后仍會引起心力衰竭，因此，仍需探索新的治療方法以提高M(jìn)I的治療效果。

Exos是一類由細(xì)胞分泌到胞外的微小囊泡，直徑在30～50 nm之間，其內(nèi)含有多種活性成分，如蛋白質(zhì)、miRNA，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、基因表達(dá)等多種生物學(xué)過程，目前在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等多種疾病的治療中受到廣泛關(guān)注[5]。Exos可由多種不同細(xì)胞分泌而來，其來源不同，在MI中發(fā)揮心臟保護(hù)的作用機(jī)制不同，其中充質(zhì)干細(xì)胞來源的Exos可通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)影響心肌細(xì)胞增殖，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷[6]。miRNA是Exos中的關(guān)鍵組分，可通過旁分泌作用調(diào)節(jié)相鄰靶細(xì)胞，其中miR-152-3p是由前體miR-152產(chǎn)生的成熟miRNA，可抑制缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，縮小心肌梗死區(qū)域，有助于促進(jìn)心肌組織修復(fù)[7]。CD63、CD81是UCMSCs分泌的Exos的特異性表面標(biāo)志物，其表達(dá)水平較高表明UCMSCs分泌的Exos含量較高。本研究結(jié)果顯示，UCMSCs-Exos組CD63、CD81蛋白表達(dá)量及miR-152-3p的相對表達(dá)量均高于UCMSCs組，這提示從UCMSCs中成功分離出Exos，且UCMSCs分泌的Exos中的miR-152-3p呈高表達(dá)。

LVEF可反映左心室收縮功能，LVFS可反映左心室收縮過程的運(yùn)動速率，兩者水平下降表明左心室收縮功能減弱；HW/TL是反映心臟肥大程度的重要指標(biāo)，其比值越大表明心臟肥大越嚴(yán)重。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后14 d，與MI組比，MI+UCMSCs-Exos組小鼠血清miR-152-3p、LVEF、LVFS水平均升高，HW/TL水平下降，這提示UCMSCs分泌的Exos可發(fā)揮治療作用，改善MI小鼠心功能。分析其原因?yàn)?，UCMSCs分泌的Exos能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)新生血管，有助于抑制心肌纖維化；同時(shí)，Exos高表達(dá)miR-152-3p，可抑制促凋亡基因的表達(dá)，并激活抗凋亡基因，阻斷凋亡信號的傳導(dǎo)，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡，有助于改善心功能[8]。本研究中，術(shù)后14 d，與MI組比，MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞受損減輕、細(xì)胞排列稍紊亂、心肌纖維增生較少、細(xì)胞間隙的變化相對較小、炎癥細(xì)胞浸潤較少，這提示MI小鼠經(jīng)UCMSCs分泌的Exos治療后，可減輕炎癥反應(yīng)，抑制心肌纖維化進(jìn)程，有效減輕心肌細(xì)胞損傷。分析其原因?yàn)?，UCMSCs分泌的Exos與纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其在心肌細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)，可抑制心肌纖維化蛋白的表達(dá)，進(jìn)而延緩心肌纖維化進(jìn)程，減輕心肌細(xì)胞損傷；同時(shí)，Exos中可提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕氧化損傷，并抑制白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等多種促炎因子的表達(dá)，進(jìn)一步減輕心肌細(xì)胞損傷[9]。本研究中，術(shù)后14 d，與MI組比，MI+UCMSCs-Exos組小鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bax蛋白表達(dá)水平下降，這提示UCMSCs分泌的Exos可抑制MI小鼠心肌細(xì)胞凋亡。分析其原因可能為，UCMSCs分泌的Exos可調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖，還可抑制硫氧還蛋白結(jié)合蛋白的活性，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕氧化損傷，從而降低促凋亡蛋白Bax的活性，有助于抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[10]。

綜上，UCMSCs來源的Exos可在MI小鼠中發(fā)揮保護(hù)作用，可抑制心肌細(xì)胞凋亡，并減輕心臟組織病理改變，且Exos高表達(dá)miR-152-3p，能夠參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，有助于改善其心功能。但本研究仍存在一定局限性，未明確Exos對心肌損傷的作用機(jī)制，以及與miR-152-3p的關(guān)系，后續(xù)有待進(jìn)一步研究。

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