宮頸黏液精液生物檢測法在母豬慢性子宮內(nèi)膜炎診斷中的應(yīng)用研究

摘" 要：為了探究一種可以便捷應(yīng)用于母豬慢性子宮內(nèi)膜炎實驗室診斷方法，試驗采用精液生物檢測法檢測斷奶發(fā)情母豬宮頸黏液，利用計算機(jī)輔助精子分析（computer-aided sperm analysis，CASA）系統(tǒng)客觀評估宮頸黏液孵育后精子活力的差值，差值≥30％的樣本判定為檢測結(jié)果陽性。追蹤164頭有效試驗?zāi)肛i后續(xù)生產(chǎn)結(jié)果，以不發(fā)生返情、順利分娩作為陰性診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)試驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和研究。結(jié)果表明：試驗群體宮頸黏液精液生物檢測陽性率為43.3％。將檢測結(jié)果對應(yīng)母豬生產(chǎn)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，檢測陽性組母豬分娩率極顯著低于陰性組和對照組母豬的，使用宮頸黏液精液生物檢測法評估慢性子宮內(nèi)膜炎具有較高的應(yīng)用價值。說明使用CASA系統(tǒng)開展母豬宮頸黏液精液生物檢測，可以簡單方便地對斷奶母豬子宮炎癥情況進(jìn)行評估。

關(guān)鍵詞：精液生物檢測法；CASA系統(tǒng)；斷奶母豬；慢性子宮內(nèi)膜炎

中圖分類號：S851.34 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）06-0049-06

在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，慢性子宮內(nèi)膜炎是造成母豬繁殖障礙的主要原因之一，主要由急性子宮內(nèi)膜炎轉(zhuǎn)化而成[1-2]。部分患病母豬可見陰戶流出黃色、白色分泌物，或半透明略顯混濁的分泌物，散發(fā)出腐臭味。更多患病母豬主要表現(xiàn)為無明顯的全身癥狀，體溫正?；蚵陨?，食欲正常，發(fā)情不規(guī)律等[3]，這些不典型癥狀經(jīng)常被臨床忽視，進(jìn)而影響?zhàn)B豬生產(chǎn)，導(dǎo)致母豬使用年限縮短，淘汰率大幅升高?；疾∧肛i在配種后易發(fā)生返情、早期流產(chǎn)、屢配不孕等問題，大幅提高了豬場的非生產(chǎn)天數(shù)（non-productive day，NPD）[4]。患病母豬即使分娩也多數(shù)存在乳汁質(zhì)量差以及仔豬腹瀉、生長發(fā)育不良和存活率低等問題，造成生產(chǎn)成本大幅上升[5]。因此，建立簡便快速、有效可靠的實驗室診斷方法十分必要，在養(yǎng)豬生產(chǎn)的臨床診斷方面具有較大應(yīng)用價值。

在種豬精液質(zhì)量評估中，精子活率、精子活力和精子密度等是關(guān)鍵參數(shù)，反映了精子的運(yùn)動表現(xiàn)，因而，評估精子運(yùn)動表現(xiàn)的方法對精液質(zhì)量評估至關(guān)重要。傳統(tǒng)的檢測方法，如顯微鏡觀察、血球計數(shù)板計數(shù)和吉姆薩染色法存在一些缺點，如耗時、對操作人員素質(zhì)要求高，以及結(jié)果易受人為因素影響。計算機(jī)輔助精子分析（computer-aided sperm analysis，CASA）系統(tǒng)結(jié)合了圖像采集設(shè)備硬件和計算機(jī)圖像處理算法軟件，能夠提供詳細(xì)的參數(shù)來描述精子的運(yùn)動狀態(tài)。CASA系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展了約40年，能夠準(zhǔn)確、客觀、快速地評估精液密度、精子活力、運(yùn)動性能等形態(tài)學(xué)指標(biāo)，從而有效反映精子的受精能力。CASA系統(tǒng)具有省時省力、檢測結(jié)果客觀等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于種豬精液質(zhì)量檢測[6]。

本研究使用郭建華[7]報道的方法對斷奶母豬宮頸黏液開展精液生物檢測；通過CASA系統(tǒng)客觀判定處理后樣本的精子活力，并追蹤檢測結(jié)果與生產(chǎn)結(jié)果，分析檢測結(jié)果與豬慢性子宮內(nèi)膜炎的相關(guān)性，以期建立相對簡單可靠的診斷方法。

1" 材料和方法

1.1 試驗動物

本試驗群體來自福建省漳州市某生豬核心育種場的斷奶母豬，該豬場采用周批次化生產(chǎn)，每周斷奶150～160頭母豬，所有母豬飼養(yǎng)在同一棟豬舍內(nèi)，地面采用水泥漏縫地板，豬欄為半開放限位欄，每天定時定量飼喂，自由飲水。在斷奶母豬發(fā)情后，隨機(jī)挑選符合配種標(biāo)準(zhǔn)的母豬進(jìn)行采樣并作為試驗群體，同批次其他參配母豬作為對照群體。試驗分為6個批次進(jìn)行，共對190頭假定健康發(fā)情斷奶待配母豬進(jìn)行采樣，根據(jù)檢測結(jié)果分為檢測陰性組和檢測陽性組。對試驗組和對照組的樣本數(shù)和分娩結(jié)果進(jìn)行追蹤，以發(fā)生返情、流產(chǎn)作為生產(chǎn)陽性組（患病母豬），順利分娩作為生產(chǎn)陰性組（健康母豬）。

1.2 藥品

氯化鈉注射液購自廣州圣戈生物科技有限公司；75％酒精購自福州源泉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

渦旋振蕩器（型號為Vortex-Genie 2）購自美國Scientific Industries公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號為HPX-9162MBE）購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；精子分析系統(tǒng)（型號為CEROS II CASA）和Leja 4腔精子檢測玻片均購自上?？ㄌK生物科技有限公司；載玻片、蓋玻片購自鹽城市飛舟玻璃有限公司；宮頸黏液采樣器為自制，將輸精管海綿頭尾部掏空，注入生理鹽水測量，保證容量≥1 mL，經(jīng)75％酒精浸泡15 min、電熱恒溫培養(yǎng)箱70 ℃烘干30 min后使用。宮頸黏液采樣器如圖1所示。

1.4 試驗內(nèi)容

對所有試驗?zāi)肛i采集宮頸黏液樣本，用宮頸黏液樣本開展精液生物檢測試驗。采樣后正常配種，并追蹤試驗組母豬及對照組母豬后續(xù)返情和分娩情況，記錄試驗數(shù)據(jù)。以本輪配種后順利分娩判定為生產(chǎn)結(jié)果陰性（子宮健康），返情或者流產(chǎn)判定為生產(chǎn)結(jié)果陽性（慢性子宮內(nèi)膜炎），聯(lián)合試驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 試驗方法

母豬出現(xiàn)靜立反應(yīng)后按照標(biāo)準(zhǔn)配種流程操作插入采樣器，等待5 min后緩慢順時針旋轉(zhuǎn)向后拉，退出采樣器。準(zhǔn)備好無菌自封袋和消毒的剪刀，將采樣器海綿頭插入自封袋，在距離海綿頭3～5 cm處剪斷，迅速封好自封袋，記錄母豬耳號。采樣結(jié)束后母豬按照正常流程進(jìn)行深部輸精操作。

在宮頸黏液自封袋中加生理鹽水2 mL，放入燒杯內(nèi)使用渦旋振蕩器震蕩1 min，然后取出宮頸黏液樣本備用。宮頸黏液樣本如圖2所示。

打開CASA系統(tǒng)顯微鏡及配套電腦，預(yù)熱顯微鏡熱臺、普通載玻片、蓋玻片、Leja 4腔精子檢測玻片，準(zhǔn)備好常規(guī)商品精液、移液器、槍頭等。

把樣本編號寫在載玻片左側(cè)，吸取50 μL精液在載玻片兩端分別做2個液滴，另外取20 μL宮頸黏液原液，滴入左側(cè)精液滴，吹打混勻后孵育5 min，右側(cè)精液滴作為對照。

分別吸取左右2個液滴的精液，加入到一次性精子計數(shù)池載玻片相鄰的腔室，使用CASA系統(tǒng)截取3個視野，觀察精子活力及狀態(tài)，將結(jié)果保存并導(dǎo)出。檢測結(jié)果如圖3和圖4所示。

試驗組精子活力低于50％或與對照組精子活力差值大于30％判定為檢測結(jié)果陽性，反之為檢測結(jié)果陰性。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

參與試驗?zāi)肛i共190頭，考慮到人員差異、操作失誤、污染等干擾因素，去除精子活力差異大于65％的異常數(shù)據(jù)，獲得有效數(shù)據(jù)164條（頭）。采用EXCEL Vol.2019軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用R V4.3.2軟件進(jìn)行卡方檢驗。

2" 結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果統(tǒng)計

從宮頸黏液精液孵育試驗檢測結(jié)果來看，陽性組母豬比例達(dá)43.30％，說明在斷奶母豬群中慢性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率較高，宮內(nèi)環(huán)境處于亞健康或發(fā)病階段，可能會影響配種結(jié)果，見表1。

2.2 生產(chǎn)結(jié)果統(tǒng)計

跟蹤同批次全部母豬生產(chǎn)結(jié)果，將試驗?zāi)肛i以外的參配母豬作為對照組，統(tǒng)計各組母豬的分娩率。陰性組母豬的分娩率為77.42％，對照組母豬的分娩率為87.20％，與對照組母豬差異不顯著（P＞0.05）。陽性組母豬的分娩率為59.15％，與陰性組母豬和對照組母豬的均存在極顯著的差異（P＜0.01）。見表2。

2.3 不同分組分娩成績統(tǒng)計

進(jìn)一步統(tǒng)計分娩成績，發(fā)現(xiàn)兩組試驗?zāi)肛i的窩均產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)與對照組母豬的差異不顯著（P＞0.05）。見表3。

3" 討論

3.1 檢測結(jié)果

分析試驗檢測結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，斷奶發(fā)情母豬檢測陽性率達(dá)43.30％。從病理學(xué)角度講，慢性子宮內(nèi)膜炎是一種由各種原因引起的局部慢性炎癥性疾病，其病理特征是子宮內(nèi)膜間質(zhì)漿細(xì)胞浸潤[8]，主要的病因是微生物感染[9]。陽性率高說明母豬分娩管理存在問題，需要從規(guī)范接產(chǎn)操作、及時處理產(chǎn)程長現(xiàn)象、減少掏產(chǎn)、嚴(yán)格執(zhí)行產(chǎn)后消炎等措施入手減少發(fā)病源頭[10]。

3.2 生產(chǎn)結(jié)果

生產(chǎn)結(jié)果表明，與陰性組母豬相比，陽性組母豬分娩率更低（P＜0.01），說明陽性組母豬雖然沒有表現(xiàn)出子宮內(nèi)膜炎的典型癥狀，但由于子宮內(nèi)環(huán)境較差，直接配種會影響配種分娩率。同時發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果為陽性的母豬配種后有部分母豬（42/71）可正常分娩，可能因為慢性子宮內(nèi)膜炎炎癥較輕微，對子宮的傷害較小，所以母豬可以正常受孕分娩。陽性組母豬的分娩率較低，說明需要對陽性母豬及時干預(yù)（停配、治療、淘汰），防止直接配種造成的精液浪費(fèi)和NPD增加，還有可能因為配種進(jìn)一步加重炎癥。

陰性組母豬的分娩率低于對照組母豬的，但差異不顯著（P＞0.05），檢測結(jié)果為陰性母豬配種后有部分母豬返情（21/93），存在假陰性現(xiàn)象。試驗結(jié)果說明在待配母豬發(fā)病程度、樣本采集質(zhì)量、試驗條件、操作方法等方面還需要完善，以進(jìn)一步提高檢測準(zhǔn)確性[11]。與陽性組母豬相比，陰性組母豬的分娩率更高，提示可以將宮頸黏液精液生物檢測法做為一項配種前常規(guī)檢測，以區(qū)分發(fā)情母豬子宮健康與否，進(jìn)而分類管理。

3.3 分娩成績

母豬分娩成績表明陽性組、陰性組和對照組之間差異不顯著（P＞0.05），但陽性組母豬的窩均產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)的離散度較高，提示陽性組母豬的宮內(nèi)環(huán)境較差，影響了胚胎著床，造成分娩成績出現(xiàn)較大的波動。

3.4 慢性子宮內(nèi)膜炎檢測方法

牛、羊、豬發(fā)生慢性子宮內(nèi)膜炎多數(shù)情況下是由急性子宮內(nèi)膜炎轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的，由于臨床癥狀表現(xiàn)較為輕微，往往未采取及時有效的診治[12-15]。由于其致病因素較多，病因不明確，目前對于慢性子宮內(nèi)膜炎的定義還較為模糊[16]。現(xiàn)階段多采用綜合參考病史調(diào)查、臨床體征檢查以及結(jié)合實驗室診斷才能進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

目前對于家畜子宮內(nèi)膜炎的實驗室診斷技術(shù)種類繁多，包括子宮活組織檢查、細(xì)胞學(xué)檢查、子宮分泌物細(xì)菌分離培養(yǎng)、B超檢查、尿液化學(xué)檢查、宮頸黏液理化檢查和精液生物檢查等方法[17-22]，但目前相關(guān)實驗室診斷技術(shù)仍缺乏規(guī)范統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，上述的幾種方法都未能在養(yǎng)豬生產(chǎn)中得到廣泛推廣應(yīng)用。

宮頸黏液作為最接近母豬子宮內(nèi)環(huán)境的樣本，其理化性質(zhì)的變化具有代表性和指示性，其性質(zhì)類似于人類婦科白帶檢查[23-24]。一旦給患有慢性子宮內(nèi)膜炎的待配母豬輸精，子宮內(nèi)膜免疫系統(tǒng)會對微生物的感染進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)[25]，產(chǎn)生的白細(xì)胞和膿性物質(zhì)會殺滅和黏附精子。同時，精子具有向濁性，遇到和精子不同的物質(zhì)就會凝聚成團(tuán)，炎癥物質(zhì)會加劇精子凝聚，導(dǎo)致精子死亡和活力下降，進(jìn)而影響受孕。宮頸黏液精液生物檢測法就是根據(jù)這一特性進(jìn)行的，精液和宮頸黏液混合孵育后的精子活力可以提示宮頸黏液中的炎癥物質(zhì)數(shù)量[7]。在試驗中可以明顯看到獲得的宮頸液渾濁度有非常明顯的差異，提示斷奶母豬宮內(nèi)環(huán)境差異較大，試驗結(jié)果也證明這一猜測。

使用CASA系統(tǒng)對精子活力進(jìn)行分析，試驗結(jié)果客觀，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，分析數(shù)據(jù)迅速，并可以通過圖像輸出清晰直觀地顯示精子的運(yùn)動軌跡，檢測精子運(yùn)動狀態(tài)的多種參數(shù)，可以對精子樣本提供一個客觀定量分析，省時省力，早期多用于生殖中心評估男性精子質(zhì)量[26]。現(xiàn)已普遍用于公豬站種豬精液生產(chǎn)中的質(zhì)量檢測環(huán)節(jié)，高配版本甚至可以提供頂體完整性檢測，在精液質(zhì)量檢測分析方面提供更加科學(xué)的依據(jù)[6，27]。

4" 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，使用宮頸黏液精液生物檢測法的試驗結(jié)果，結(jié)合試驗?zāi)肛i配種后生產(chǎn)結(jié)果的統(tǒng)計分析，母豬陽性率為43.30％，陰性組母豬的分娩率更高。宮頸黏液作為最接近母豬子宮內(nèi)環(huán)境的樣本，其理化性質(zhì)的變化具有代表性和指示性，使用CASA系統(tǒng)對宮頸黏液精液生物檢測法檢測母豬慢性子宮內(nèi)膜炎，對檢測陽性母豬做及時治療或淘汰處理，可有效減少母豬的NPD，節(jié)省生產(chǎn)成本。同時該方法具有容易采集樣本、試驗步驟簡單以及對試驗條件要求不高等優(yōu)點，即便使用普通顯微鏡+血細(xì)胞計數(shù)板也可以開展檢測，在豬場生產(chǎn)中具有良好的推廣應(yīng)用價值。

本研究可為養(yǎng)豬生產(chǎn)中對于母豬慢性子宮內(nèi)膜炎的實驗室診斷方法研究和標(biāo)準(zhǔn)建立提供一定的技術(shù)參考。

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