兩種豬傳染性胸膜肺炎疫苗臨床免疫效果評(píng)估

摘" 要：豬傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP）引起的一種接觸性呼吸道傳染病，在多個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家流行，已成為規(guī)?；i場(chǎng)的五大疫病之一，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)隨機(jī)選取武漢某二元母豬場(chǎng)6周齡仔豬1 800頭，分別接種本實(shí)驗(yàn)室制備的傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型滅活苗及進(jìn)口商品化豬傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗。通過分析豬的免疫應(yīng)激水平、抗體水平、肺部病變?cè)u(píng)分及經(jīng)濟(jì)成本，對(duì)疫苗的免疫效果進(jìn)行評(píng)估，為豬場(chǎng)篩選合適的豬傳染性胸膜肺炎疫苗提供參考。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎；胸膜肺炎放線桿菌；滅活疫苗；亞單位疫苗；病變?cè)u(píng)分

中圖分類號(hào)：S852.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）06-0034-08

豬傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一種高度接觸性豬呼吸道傳染病。當(dāng)豬群發(fā)生豬傳染性胸膜肺炎時(shí)，其急性和亞急性病例主要表現(xiàn)為纖維素性出血性胸膜肺炎，慢性病例以纖維素性壞死性肺炎為主要特征[1]。隨著非洲豬瘟傳入中國(guó)與減抗禁抗政策的實(shí)施，豬傳染性胸膜肺炎的防控壓力增加，疫苗免疫防控豬傳染性胸膜肺炎成為首選方法。

APP的樹膠脂毒素（resiniferatoxin，RTX）分別被命名為傳染性胸膜肺炎放線桿菌毒素I （Actinobaillus pleuropneumoniae toxin I，ApxI）、ApxII、ApxIII、ApxIV。毒素的溶血性及細(xì)胞毒性不完全相同，可以作為判斷毒力強(qiáng)弱的依據(jù)。其中ApxI和ApxII具有溶血活性和細(xì)胞毒性作用，ApxI的溶血活性強(qiáng)于ApxII的，ApxIII無溶血活性，只有細(xì)胞毒性作用[2]，目前APP已鑒定的血清型有19個(gè)，仍有一些菌株無法分型。血清型1～12型、15～19型屬于生物Ⅰ型，而血清型13、14型屬于生物Ⅱ型。一般分泌毒素Ⅰ的血清型1、5、9、10和11型比其他血清型菌株毒力強(qiáng)，常見于嚴(yán)重暴發(fā)高死亡率和嚴(yán)重的肺病變的病例；而其他血清型的毒力較弱，死亡率也較低；通常血清型3和6型的毒力被認(rèn)為最低[3]。

血清型的特異性取決于菌體的莢膜多糖和菌體脂多糖[4]，但有些血清型的菌體多糖鏈的結(jié)構(gòu)具有同一性，導(dǎo)致不同血清型之間有交叉反應(yīng)，如血清型1、9和11型之間，血清型3、6和8型之間，血清型4和7型之間均有交叉反應(yīng)[5-6]。

武漢試驗(yàn)場(chǎng)為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）陽(yáng)性二元母豬場(chǎng)，通過對(duì)發(fā)病育肥豬組織剖檢、細(xì)菌分離及鑒定，分離得到一株APP 5型菌株，據(jù)此實(shí)驗(yàn)室自制該菌株的滅活疫苗。通過與進(jìn)口商品化豬傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗臨床對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)合豬的免疫應(yīng)激、抗體檢測(cè)、肺部評(píng)分及經(jīng)濟(jì)成本，對(duì)兩種疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)估，為APP陽(yáng)性豬場(chǎng)篩選合適的疫苗提供參考。

1" 材料與方法

1.1 傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型鑒定與滅活苗的制備

1.1.1 病原體的鑒定與分型

對(duì)疑似感染APP的豬進(jìn)行鼻拭子采樣，并收集病變臟器（肺臟、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)），檢測(cè)豬PRRSV、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）、豬流感病毒（swine influenza vinus，SIV）、豬偽狂犬病毒（porcine pseudorabies virus，PRV）、副豬格拉瑟菌（glaesserella parasuis，GPS）、豬鏈球菌（streptococcus suis，SS）、豬多殺性巴氏桿菌（pasteurella multocida，PM）、APP、豬支原體（mycoplasma hyopneumoniae，M. hp）等病原體。

APP分離鑒定方法：點(diǎn)燃酒精棉，并擦拭肺臟表面病健交界處，用無菌手術(shù)剪刀剪下小塊病料于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptose soya agar，TSA）平板[含胎牛血清及1％煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）]上接種并劃線，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h。挑取菌落進(jìn)行細(xì)菌病原體的的檢測(cè)，擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；擴(kuò)增酶為DNA Taq酶，檢測(cè)引物如表1所示。

對(duì)APP陽(yáng)性菌落進(jìn)行分型鑒定，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，" "72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；擴(kuò)增酶為DNA Taq酶。分型引物如表2所示。

1.1.2 APP 5型滅活疫苗的制備

將鑒定后的APP菌落純化擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用甲醛進(jìn)行滅活，滅活前保證菌種滴度達(dá)到107.5 CFU/mL，無菌檢驗(yàn)后加入氫氧化鋁佐劑，制備成傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型滅活疫苗。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)于2021年5～10月在武漢某二元母豬場(chǎng)進(jìn)行。隨機(jī)選取1 800頭6周齡健康仔豬，分為3組，每組600頭，分欄隔離飼養(yǎng)。疫苗免疫組仔豬于42日齡、70日齡分別免疫APP疫苗。

1.3 試驗(yàn)疫苗

本試驗(yàn)所用疫苗分別為實(shí)驗(yàn)室分離菌株制備的傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型滅活疫苗和進(jìn)口商品化豬傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗，以下簡(jiǎn)稱為滅活疫苗和亞單位疫苗。

1.4 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)分為3組：試驗(yàn)一組仔豬接種滅活疫苗；試驗(yàn)二組仔豬接種亞單位疫苗；試驗(yàn)三組為對(duì)照組，該組仔豬注射等量生理鹽水。

1.5 抗體測(cè)定

在仔豬70日齡二次接種疫苗后1個(gè)月對(duì)3個(gè)試驗(yàn)組仔豬隨機(jī)采血樣各15份，并于育肥豬屠宰前對(duì)3個(gè)試驗(yàn)組豬隨機(jī)采血樣各15份，并對(duì)血樣中APP 5型抗體進(jìn)行檢測(cè)。

使用北京萬博百測(cè)生物科技有限公司MEDIAN豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型抗體ELISA試劑盒（貨號(hào)：ES-AP5-01），檢測(cè)血清樣本中的抗體。結(jié)果判定：S/P值≥0.4判為陽(yáng)性；0.3≤S/P值＜0.4判為可疑；S/P值＜0.3判為陰性。

屠宰前采集3種試驗(yàn)豬血清，檢測(cè)APP 5型中和抗體，查看抗體消退情況。APP 5型中和抗體效價(jià)測(cè)定試劑盒由金宇保靈生物藥品有限公司提供（自主研發(fā)試劑盒）。結(jié)果判定：效價(jià)≥1∶256判為陽(yáng)性，效價(jià)≤1∶4判為陰性。

1.6 屠宰豬肺部評(píng)分

屠宰豬肺部評(píng)分作為本試驗(yàn)的一個(gè)重要評(píng)估方法，以各肺葉肉眼所見的病變組織表面積占該肺葉總面積的比例作為打分依據(jù)。據(jù)Humik等研究發(fā)現(xiàn)，肉眼表觀病變觀察結(jié)果與對(duì)實(shí)變組織進(jìn)行稱重計(jì)算所得結(jié)果具有高度相關(guān)性[7]，說明屠宰豬肺部評(píng)分的科學(xué)合理性。

所有試驗(yàn)豬均飼養(yǎng)到體重120 kg以上，屠宰前隨機(jī)在每組豬中挑選30頭，結(jié)合眼觀和觸摸對(duì)肺部病變進(jìn)行評(píng)分記錄，同時(shí)拍照記錄；通過肺病變?cè)u(píng)分（lung lesion scoring，LLS）系統(tǒng)[禮藍(lán)（上海）動(dòng)物保健有限公司軟件分析系統(tǒng)]和Excel等軟件對(duì)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。傳染性胸膜肺炎評(píng)分方法：根據(jù)各肺葉的體積占整個(gè)肺體積的比例對(duì)各肺葉定義評(píng)分比重：尖葉、心葉和中間葉每個(gè)總分10分，膈葉每個(gè)總分25分，總分100分。主要依據(jù)病變占肺部的范圍/程度，結(jié)合眼觀和觸摸評(píng)分，病變?cè)絿?yán)重分?jǐn)?shù)越高。如表3所示。

1.7 育肥豬全程生產(chǎn)成績(jī)分析

所有試驗(yàn)豬銷售后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)階段全程的育成率、日增重及用藥成本，并進(jìn)行對(duì)比分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1 胸膜肺炎放線桿菌5型鑒定與滅活疫苗制備

2.1.1 病料PCR鑒定結(jié)果

對(duì)22頭疑似感染APP的豬采集樣本，病變組織中病原體的熒光定量檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

細(xì)菌性病原體檢測(cè)結(jié)果：使用表1中鑒定引物，PCR鑒定結(jié)果如圖1所示，其中2份病變肺組織檢測(cè)出APP病原體。

2.1.2 APP分型鑒定結(jié)果

將鑒定為APP的菌落進(jìn)行分型鑒定，分型引物見表2。PCR鑒定結(jié)果如圖2所示，挑取分型鑒定的APP分型結(jié)果為5型。

2.2 抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 APP 5型抗體檢測(cè)結(jié)果

APP疫苗二次免疫接種后4周，對(duì)試驗(yàn)豬隨機(jī)采樣檢測(cè)APP抗體，試驗(yàn)一組試驗(yàn)豬APP疫苗抗體陽(yáng)性率顯著高于試驗(yàn)二組試驗(yàn)豬的；對(duì)照組試驗(yàn)豬存在APP感染，陽(yáng)性率為60％。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

2.2.2 育肥豬屠宰前APP 5型中和抗體檢測(cè)

屠宰前育肥豬183日齡，二次免疫接種疫苗后113 d，對(duì)照組試驗(yàn)豬APP中和抗體陽(yáng)性率80％，通過藥物干預(yù)仍能夠保證育肥豬不表現(xiàn)APP臨床感染癥狀。試驗(yàn)一組試驗(yàn)豬中和抗體持續(xù)時(shí)間沒有試驗(yàn)二組試驗(yàn)豬的時(shí)間長(zhǎng)，結(jié)果如表5所示。

2.3 育肥豬屠宰時(shí)的肺部病理變化評(píng)估

從每組隨機(jī)挑選30頭試驗(yàn)育肥豬進(jìn)行屠宰解剖，結(jié)合眼觀和觸摸，翻動(dòng)檢查肺臟進(jìn)行評(píng)分并記錄。3組育肥豬屠宰肺臟整體病變較嚴(yán)重，肺臟都有不同程度的損傷。結(jié)果表明試驗(yàn)一組的免疫效果優(yōu)于試驗(yàn)二組的，接種APP疫苗的兩個(gè)試驗(yàn)組育肥豬肺臟狀況明顯優(yōu)于對(duì)照組的，如表6所示。

2.4 保育-育肥階段生產(chǎn)數(shù)據(jù)分析

屠宰前對(duì)育肥豬全程的育成率、日增重及用藥成本進(jìn)行分析，試驗(yàn)一組保育-育肥全程針對(duì)細(xì)菌性保健加藥2次；試驗(yàn)二組和對(duì)照組保育-育肥全程針對(duì)細(xì)菌性保健各加藥3次。試驗(yàn)一組育肥豬全程日增重、上市平均體重及單頭豬藥費(fèi)都優(yōu)于試驗(yàn)二組及對(duì)照組育肥豬的。試驗(yàn)二組育肥豬全程育成率及藥費(fèi)優(yōu)于對(duì)照組的，但全程日增重及上市平均體重略低于對(duì)照組的，如表7所示。

3" 討論

本研究挑選的豬場(chǎng)是PRRSV陽(yáng)性場(chǎng)，3組試驗(yàn)豬在屠宰前其肺部均有肺萎陷及肺水腫的病毒感染癥狀，因病毒參與豬抵抗力下降導(dǎo)致細(xì)菌的感染率增加[8]。3組試驗(yàn)豬從保育至育肥出欄，全程都借助抗生素進(jìn)行保健。當(dāng)豬群發(fā)生豬傳染性胸膜肺炎時(shí)，使用抗生素雖然可以降低該病的暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但不能清除帶菌豬體內(nèi)的細(xì)菌。由APP引起的慢性肺炎持續(xù)感染，導(dǎo)致化膿性粘連病變很可能會(huì)持續(xù)幾個(gè)月，一直到育肥豬屠宰時(shí)才被發(fā)現(xiàn)[9]。出欄時(shí)發(fā)現(xiàn)部分試驗(yàn)豬肺臟表現(xiàn)藥物修復(fù)過程中留下的瘢痕[10]，此豬群如果持續(xù)飼養(yǎng)可能有再次感染和暴發(fā)APP的風(fēng)險(xiǎn)。

本試驗(yàn)所選取的兩種APP疫苗——滅活疫苗和亞單位疫苗。試驗(yàn)一組使用實(shí)驗(yàn)室制備APP 5型滅活疫苗，育肥豬全程育成率比對(duì)照組的提高2.6％，上市增重2.9 kg，單頭豬藥費(fèi)節(jié)約了1.5元。試驗(yàn)二組使用進(jìn)口商品化亞單位疫苗，對(duì)APP 5型能起到部分免疫保護(hù)，但不能完全抵抗APP的攻擊。試驗(yàn)二組育肥豬屠宰前中和抗體效價(jià)較高，但生長(zhǎng)速度及平均上市體重與對(duì)照組的相近；屠宰前胸膜肺炎比例（16％）比對(duì)照組的（30％）顯著低，但比試驗(yàn)一組的（13.3％）占比高，提示試驗(yàn)二組豬群育肥后期可能感染了APP。對(duì)照組試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種滅活疫苗再搭配抗生素在PCP的防控中效果較好[11]。

試驗(yàn)一組使用本實(shí)驗(yàn)室制備的APP滅活疫苗，該疫苗具備特異性，從試驗(yàn)結(jié)果可知其免疫效果明顯優(yōu)于商品化亞單位疫苗的，也證明用當(dāng)?shù)胤蛛x到的APP菌株制備而成的滅活苗，對(duì)當(dāng)?shù)亓餍兄甑姆揽匾糜谑惺鄣纳唐芬呙绲腫12]。當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)回歸薄利時(shí)代，豬肺臟病變的嚴(yán)重程度與其對(duì)經(jīng)濟(jì)效益的影響成正比，肺炎病變可導(dǎo)致豬的生長(zhǎng)速度降低2％～25％[13]。為達(dá)到降本增效的目的，分離豬場(chǎng)內(nèi)APP流行菌株并將其制成APP滅活疫苗，對(duì)預(yù)防APP感染是一種很好的防控思路。

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