煙草促生細菌的篩選鑒定及促生效果

摘要：為尋找信陽地區(qū)促進煙草生長的有益菌，提高煙草產量，為信陽地區(qū)煙草種植中促生菌的應用奠定基礎，從信陽市7種不同土壤樣品中分離純化出390株細菌，通過微生物-植物平板共培養(yǎng)方法和盆栽復篩試驗，得到1株促生效果顯著的細菌LSyc30，經鑒定為芽孢桿菌屬，將其命名為Bacillus sp.LSyc30。在盆栽試驗中，LSyc30菌株處理的煙草鮮重是空白對照的3倍多，須根數(shù)比空白組多62%，根長是空白的1.5倍，莖長比空白多54%，根系活力提高了24%，促生效果明顯；煙草酶活檢測結果試驗組PPO（多酚氧化酶）和PAL（苯丙氨酸解氨酶）活力顯著高于對照組，試驗組POD（過氧化物酶）、CAT（過氧化氫酶）、SOD（超氧化物歧化酶）活力和MDA（丙二醛）含量與對照組無顯著差異，結果表明促生菌LSyc30對煙草生長無不良影響。LSyc30菌株具有溶磷、解鉀、產鐵載體的功能，無固氮能力。在大田試驗中，細菌組和商用菌劑組的農藝性狀均優(yōu)于對照組，細菌組的各項指標略高于商用菌劑組，其中細菌促生菌的株高、葉長和葉寬都顯著高于對照組，3個處理組葉片數(shù)和莖圍沒有顯著性差異；煙草生理生化指標檢測結果顯示，還原糖含量提高了44.30%、總糖含量提高了50.00%、鉀含量提高了14.67%，促生作用優(yōu)于商用菌劑。綜合結果表明細菌LSyc30可以改善土壤環(huán)境促進煙草對營養(yǎng)物質的吸收，提高產量，是開發(fā)微生物菌劑的優(yōu)良菌株。

關鍵詞：煙草；信陽；細菌；篩選；促生菌

中圖分類號：S182；S572.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0230-08

謝久鳳，張" 森，崔光周，等. 煙草促生細菌的篩選鑒定及促生效果［J］. 江蘇農業(yè)科學，2024，52（23）：230-237.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.031

收稿日期：2023-12-12

基金項目：國家自然科學基金（編號：21908044）；信陽優(yōu)質煙土壤微生態(tài)調控菌劑的開發(fā)和應用項目（編號：30802153）。

作者簡介：謝久鳳（1983—），女，遼寧阜新人，碩士，實驗師，從事微生物研究。E-mail：xiejiufeng@henau.edu.cn。

通信作者：王明道，博士，教授，從事植物與微生物互作研究。E-mail：wmdbio@126.com。

河南省是最早引種烤煙的省份之一，煙草產業(yè)作為河南省的支柱產業(yè)之一，在河南省的種植面積占全國種植面積的10%左右。河南煙區(qū)常年種植烤煙面積為8.67萬hm2，平均煙草產量為1 844.46 kg/hm2，煙草產量最高能達到2 100 kg/hm2，顯著高于全國 1 700 kg/hm2 的平均產量［1］。信陽市地處河南省最南部，是我國南北優(yōu)質煙區(qū)的過渡地帶，與湖北省毗鄰，是亞熱帶向暖溫帶的過渡地帶，光、熱、水資源豐富，是河南省煙草豫南產區(qū)的主要產區(qū)，也是烤煙生產的優(yōu)質產區(qū)［2］。對該地區(qū)調查和查閱文獻資料報道可知，從1990—2015年，信陽地區(qū)煙草產量長期處于中低區(qū)，并且處于不斷下降的趨勢。信陽產區(qū)煙草產量在河南省十大煙草產區(qū)排名倒數(shù)，產量一直低于河南省煙草的平均產量，嚴重影響河南省煙草產業(yè)的發(fā)展［3］。近幾年由于藥物、化肥的使用，煙草產量有所提升，煙草產量最高為2018年的1 941.15 kg/hm2，但仍不及其他產區(qū)。長期大量施用化學藥劑容易使病菌產生抗藥性，引起土壤質地板結硬化，使煙草產量不增反降，2020年信陽市煙草產量僅為1 311.6 kg/hm2；造成的環(huán)境污染和藥劑殘留影響人體健康，嚴重制約著煙草的可持續(xù)發(fā)展［4］。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）是一類可以促進植物生長，促進植物對礦質營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類［5］。促生菌不僅可以提高作物產量，相對于化學藥劑也具有更高的經濟效益，符合綠色環(huán)保的發(fā)展理念［6］。使用微生物菌劑可以改良土壤狀況，維持根際微生物區(qū)系平衡，提高土壤肥力，提升作物產量和品質［7］。有關PGPR的研究與應用主要集中在水稻［8］、小麥［9］、玉米［10］等重要糧食作物上，煙草根際促生菌研究也有報道。鐘釧等從四川省煙草根際土中分離出產IAA和鐵載體能力的放線菌株，通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)對煙草生長有顯著促進作用，促生菌對常見煙草病害有拮抗作用［11］。高丹丹從貴州省煙區(qū)健康煙株根際土壤樣品中分離出耐低溫的優(yōu)良菌株不僅能顯著促進煙草生長，還能提高土壤酸性磷酸酶、蔗糖酶和脲酶的活力［12］。目前PGPR的研究主要在實驗室和溫室中進行，在大田應用中的技術還不夠成熟穩(wěn)定［13］。

據(jù)了解，迄今為止針對信陽地區(qū)的煙草促生菌的研究還未見報道，在煙草種植中也未使用過任何的促生菌劑。本研究以信陽煙草種植區(qū)土壤樣品為材料進行煙草促生菌的篩選與鑒定，并進行盆栽與大田試驗，找出促進信陽煙草生長的有益菌，為微生物菌肥的開發(fā)提供菌種資源，改善土壤性質，提高信陽煙草產量，解決信陽煙草產量低的實際問題，探究促生菌對煙草的促生機制，為開發(fā)優(yōu)質的煙草促生菌劑和菌肥奠定基礎。

1" 材料與方法

1.1" 煙草促生菌的篩選與鑒定

1.1.1" 試驗材料及儀器設備

（1）培養(yǎng)基：MS、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、微生物-植物共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基200 mL與PDA培養(yǎng)基100 mL混合，補加瓊脂6 g，添加去離子水定容至1 L）、解磷培養(yǎng)基［14］、解鉀培養(yǎng)基［15］、固氮培養(yǎng)基［16］、產鐵載體檢測培養(yǎng)基［17］、細菌基因組提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］。（2）試驗材料：云煙87品種，哈茨木霉菌劑（河南農業(yè)大學煙草學院）。（3）儀器設備：立式高壓蒸汽滅菌鍋（100 L，山東博科消毒設備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（LRH-350F 上海左樂儀器有限公司）、恒溫搖床（TS-280C，上海天呈實驗儀器制造有限公司）、智能人工氣候培養(yǎng)箱（RQH-250，鄭州生元儀器有限公司）、超凈工作臺（SW-CJ-2F，蘇州蘇潔凈化設備有限公司）。

1.1.2" 煙草根際土壤樣品采集

根據(jù)信陽煙草種植特點，選取信陽市羅山縣水稻—煙草輪作的煙草田、信陽平橋區(qū)小麥/玉米—煙草輪作的煙草田、前茬作物為油菜紅薯的煙草田、煙草常年連作煙田、第1次種植煙草的煙田土壤等7塊區(qū)域進行樣品采集。

采用五點取樣法對煙草根際土壤進行采集，取樣時去除表面5 cm的表層土，向下取5～10 cm深的煙草根際土壤（附著于煙草根系1 mm之內的一層土壤），通過篩子快速篩除土壤中植物組織和石子等異物，將土壤樣品裝入無菌袋中，4 ℃低溫保存，用于微生物的分離純化。

1.1.3" 煙草根際土壤微生物的分離及純化

在無菌超凈工作臺中將土壤樣品進行梯度稀釋，吸取10-4、10-5、10-6等3個梯度的稀釋液涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)1～2 d，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落進行劃線純培養(yǎng)獲取純菌株，菌株編號及土壤來源見表1。

1.1.4" 微生物-煙草共培養(yǎng)篩選促生菌

1.1.4.1" 無菌煙草苗培養(yǎng)" 將云煙87種子用0.1%氯化汞浸泡殺菌5 min，用無菌蒸餾水沖洗3遍，再用有效氯為2.5%的次氯酸鈉溶液浸泡 15 min，最后用無菌水沖洗3遍，獲得無菌的煙草種子。用鑷子和牙簽將無菌煙草種子點種在MS培養(yǎng)基中，并用封口膜封口。將種子培養(yǎng)皿在4 ℃暗環(huán)境中放置24 h后，再置于人工氣候培養(yǎng)箱中，以 28 ℃、光照度1 500～2 000 lx、濕度60%、光照12 h的條件培養(yǎng)14 d，獲得株高2～3 cm的無菌煙草苗。

1.1.4.2" 細菌菌液制備" 將分離純化的菌株進行活化培養(yǎng)，細菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中 37 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，獲得菌液備用。

1.1.4.3" 煙草平板生測試驗" 將培養(yǎng)好的無菌煙草苗轉接到微生物-植物共培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)（28 ℃、光照度1 500～2 000 lx、濕度60%、光照 12 h 的條件培養(yǎng)）7 d后，在距離煙草根系中間部位1 mm處接種細菌菌液10 μL，以不加菌液的煙草平板作空白對照，再置于人工氣候培養(yǎng)箱中，以28 ℃、光照度1 500～2 000 lx、濕度60%、光照12 h的條件培養(yǎng)至14 d，統(tǒng)計不同菌株對煙草鮮重、根分支數(shù)、株高和根長的影響，篩選能促進煙草生長的微生物菌株。

1.1.5" 煙草促生菌盆栽試驗

1.1.5.1" 促生菌發(fā)酵液制備" 將共培養(yǎng)中對煙苗有促生作用的細菌接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，檢測活菌量達到1×108 CFU/mL，備用。

1.1.5.2" 促生盆栽試驗煙苗制備" 盆栽培養(yǎng)基質主要為營養(yǎng)土和蛭石，使用前將營養(yǎng)基質在121 ℃高壓蒸汽滅菌90 min。將營養(yǎng)土、蛭石、水按照質量比為1 ∶1 ∶2的比例混合均勻裝入7 cm×7 cm×7 cm 的方形塑料盆中，移種培養(yǎng)好的無菌煙草苗（株高2～3 cm），放置于溫度28 ℃、濕度60%、光照時間12 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待煙草苗長至4～6張真葉，選取生長一致的健康煙草苗進行接菌處理。

1.1.5.3" 促生盆栽試驗接菌處理" 按照每盆2 mL接種量添加菌液，每個處理20盆，以只添加等量培養(yǎng)基的處理為空白對照，商用菌劑哈茨木霉為陽性對照。接種菌液后繼續(xù)培養(yǎng)，待煙草生長至第20天時，將煙草根系進行清洗，去除培養(yǎng)基質，統(tǒng)計煙草的鮮重、根重、株高和根長指標，分析菌株對煙草的促生效果。

1.1.6" 促生菌株的鑒定

1.1.6.1" 細菌的形態(tài)學觀察" 將對煙草生長有促生作用的細菌在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上劃線分離單菌落，觀察菌株形態(tài)，挑取少量菌體進行革蘭氏染色，顯微觀察細菌形態(tài)。

1.1.6.2" 細菌基因序列分析" 細菌基因組提取試劑盒提取細菌的基因組，對細菌的16S核糖體基因進行PCR，對PCR擴增序列進行測序，通過NCBI進行數(shù)據(jù)比對，并利用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定細菌促生菌株的種屬。

1.2" 促生菌促生機制研究

1.2.1" 促生菌對煙草根系活力的影響

1.2.1.1" 氯化三苯基四氮唑（TTC）標準曲線的制作" TTC是一種脂溶性光敏感復合物，常用作氧化還原指標劑。它可以與活細胞內的脫氫酶反應，生成紅色的三苯基甲臜（TTF），從而用于檢測細胞的活力或計數(shù)。首先配制0.06、0.07、0.09、0.12、0.15 g/L TTC不同濃度的溶液，各取1 mL上述不同濃度TTC溶液加入等量的連二亞硫酸鈉（Na2S2O4），使得TTC完全反應。振蕩混合混勻，用乙酸乙酯定容至10 mL（多大體系），以乙酸乙酯作為空白對照，檢測485 nm下不同濃度TTC溶液的吸光度，記錄各值。橫坐標為不同TTC的濃度，縱坐標為其吸光度，繪制出TTC濃度標準曲線（圖1）。TTC還原量=TTC濃度（g/L）× TTC溶液添加量（1 mL）。

1.2.1.2" 根系活力的檢測" 稱取盆栽處理后培養(yǎng)20 d的煙草根尖樣品0.5 g，放入小燒杯中，加入0.4% TTC溶液和磷酸緩沖液（pH值為7.0）各 5 mL，將根充分浸沒在溶液內，在37 ℃下暗保溫 1～2 h，此后立即加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反應。（與此同時做一空白試驗，先加硫酸，再加根樣品，37 ℃下暗保溫后不加硫酸，其溶液濃度、操作步驟同上）。把根取出，用濾紙吸干水分，放入研缽中，加乙酸乙酯3～4 mL，充分研磨，以提出TTF。把紅色提取液移入刻度試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌2～3次，皆移入刻度試管，最后加乙酸乙酯定容至10 mL，檢測D485 nm，以空白試驗作參比，根據(jù)標準曲線，計算消耗的TTC濃度，得到TTC的還原量。從而計算TTC還原強度，TTC還原強度表示根系酶活力：

TTC還原強度=TTC還原量（g）÷根系重（g）÷反應時間（h）。

1.2.2" 促生菌株對煙草煙葉POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性和MDA含量的影響

促生盆栽試驗20 d時，取各組煙草葉片進行過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和丙二醛（MDA）含量的檢測，POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性和MDA含量的檢測方法按照江蘇科銘生物技術有限公司的酶活力檢測試劑盒，通過分光光度計檢測對應吸光度，計算相應酶活力進行分析。

1.2.3" 促生菌解磷、解鉀、固氮、產鐵載體功能分析

將促生菌接種至解磷培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、固氮培養(yǎng)基和產鐵載體檢測培養(yǎng)基中，如菌株具備該功能，在對應培養(yǎng)皿中生長就會出現(xiàn)透明圈，根據(jù)是否產生透明圈以及透明圈的大小判斷菌株是否具備這些功能。

1.3" 煙草促生菌大田試驗效果研究

促生菌篩選地域是信陽市，因此在信陽市進行大田試驗更符合生態(tài)學原理。2022年4月選取信陽市平橋區(qū)煙草種植區(qū)正常小麥/玉米—煙草輪作地塊，檢測促生菌株在大田種植過程中的實際效果。

1.3.1" 菌劑的制備

將篩選得到的效果顯著的促生菌進行發(fā)酵，添加量參照商用菌劑的1 kg/667 m2，細菌發(fā)酵液1 L/667 m2。

1.3.2" 煙苗菌劑添加

在4月初煙苗移栽時，將菌劑稀釋100倍，煙苗在菌劑中浸根30 min后移栽，然后進行灌根處理；在6月初煙草進入旺長期，將菌劑稀釋1 000倍，對煙草進行灌根處理。試驗組為篩選的促生菌株，商用菌劑為陽性對照，以添加等量的自然水為空白組。

1.3.3" 煙草農藝性狀的統(tǒng)計

煙草移栽后，分別在第90天時統(tǒng)計煙草的株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬、葉片數(shù)，分析不同菌劑處理對煙草生長農藝指標的影響。

1.3.4" 煙葉理化指標檢測

將不同處理的煙葉烘烤后進行隨機抽樣，每個處理抽取6個煙葉樣本，混合粉碎，作為該處理煙草的樣本。在中國煙草總公司鄭州煙草研究院進行理化指標的檢測，對照國家煙草品質標準分析不同處理煙草的品質。數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 20.0軟件進行分析。

2" 結果與分析

2.1" 促生菌的篩選和鑒定

2.1.1" 微生物-煙草共培養(yǎng)篩選細菌促生菌

對信陽地區(qū)7種不同類型的土壤樣品進行細菌分離純化，按照微生物-煙草共培養(yǎng)的方法篩選煙草細菌促生菌。每個菌株進行3個平行試驗，觀察煙草的生長情況，培養(yǎng)14 d后，對菌株處理的煙草鮮重、須根數(shù)、根長、莖長進行統(tǒng)計，分析菌株的促生效果。煙草平板結果見表2，可以得出樣品2中LSys37和樣品6中LSyc30、LSyc52這3株細菌促生效果良好。3株細菌的鮮重都顯著高于空白組，其中細菌LSyc30的鮮重顯著高于另2株細菌，是空白組的3倍多；須根數(shù)只有細菌LSyc30與空白組有顯著性差異，比空白組多62%；3株細菌的根長都顯著高于空白組，且3株細菌之間沒有顯著差異，細菌LSyc30根長是空白組的1.5倍；莖長只有細菌LSyc30顯著高于空白組54%，綜合所有結果得出細菌LSyc30促生效果最顯著。

2.1.2" 細菌促生菌的盆栽驗證

對篩選得到的最優(yōu)的3株細菌促生菌LSys37、LSyc30和LSyc52進行盆栽驗證，每個菌株處理20盆，以商用菌劑哈茨木霉作為陽性對照。由圖2可知，所有煙苗都正常生長，3株細菌處理的煙苗沒有病害或者生長減緩等不良現(xiàn)象，可以確定3株細菌處理不會影響煙草的正常生長，對煙草無害。與空白對照比較，3株細菌促生菌處理的煙草長勢旺盛，表明3株細菌都可以促進煙草的生長。

在加菌處理后20 d將盆栽煙草根部進行清洗，統(tǒng)計煙草的鮮重、根重、根長和莖長生長指標，結果見表3。在處理后20 d，LSyc30、LSys37和LSyc52 3株菌株處理的煙草鮮重、根重和根長都優(yōu)于空白對照，莖長只有LSyc30菌株優(yōu)于空白對照；LSyc52和LSys37各項指標與空白對照沒有顯著性差異，LSyc30菌株處理的煙草鮮重和根重顯著優(yōu)于空白對照，分別是空白對照的2.47、5.43倍，并且各項指標也都優(yōu)于其他2株細菌。3株細菌中只有LSyc30的各項指標與商用菌劑無顯著性差異（圖3），且鮮重、根重和莖長數(shù)值略高于商用菌劑。

2.1.3" 細菌促生菌LSyc30的菌種鑒定

由圖3可知，通過牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察，菌株生長呈圓形，乳白色，表面光滑具有光澤，有時中間會出現(xiàn)褶皺，如白色蠟滴，挑取黏稠； 染色后顯微鏡觀察呈桿狀（圖3-A），革蘭氏染色確定菌株為革蘭氏陽性菌。通過菌落細菌通用引物對該菌的16S DNA進行PCR測序，得到該菌株序列，通過NCBI比對和MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定細菌促生菌LSyc30是芽孢桿菌屬，將其命名為Bacillus sp.LSyc30；并將其保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為：CGMCC NO：25678。

2.2" 促生菌促生機制研究

2.2.1" 促生菌對煙草生長和防御抗性相關酶活力的影響

2.2.1.1" 促生菌對煙草根系活力的影響

由圖4可知，細菌促生菌LSyc30菌株處理煙草根系活力高于空白對照24%，結果表明促生菌的處理提高了煙草的根系活力，能促進煙草更好地吸收營養(yǎng)和生長。

2.2.1.2" 促生菌對煙草酶活性的影響

盆栽試驗 30 d 時取煙草葉片進行酶活性檢測，由表4可知，試驗組的POD、CAT、SOD活性和MDA含量與對照組相比沒有顯著性差異，試驗組的PPO和PAL活性顯著高于對照組。

2.2.2" 細菌促生菌LSyc30促生機制解析

為探究促生菌促進煙草生長的機制， 本試驗通過平板透明

圈法定性檢測菌株的溶磷、解鉀、固氮、產鐵載體能力。由表5可知，細菌促生菌LSyc30菌株檢測出具有溶磷、解鉀、產鐵載體的能力，無固氮能力。

2.3" 促生菌促生效果研究

2.3.1" 促生菌處理煙草大田情況

為探究本試驗篩選菌株在煙草實際種植中的促生效果，在信陽市羅山縣設置試驗田對篩選得到的促生菌進行田間試驗，選取商用菌劑哈茨木霉作為陽性對照。

由圖5可知，使用促生菌的煙草明顯比空白對照的煙草生長旺盛。在煙草生長的前期，細菌促生菌LSyc30和商用菌劑長勢一致，都比空白對照的長勢齊整、旺盛；在煙草成熟期，細菌促生菌LSyc30處理的煙草生長植株長勢齊整，比商用菌劑和空白對照生長旺盛。

2.3.2" 促生菌處理對煙草生長性狀的影響

在大田試驗第90天，對煙草生長的農藝性狀進行統(tǒng)計，如表6結果顯示促生菌在煙草生長過程中有顯著促進作用。細菌促生菌LSyc30和商用菌劑組各項指

標均優(yōu)于空白組，細菌促生菌LSyc30各項指標略高于商用菌劑組。試驗組的株高顯著高于對照組 25%，與商用菌劑相比提高了18%，商用菌劑組與對照組相比沒有顯著性差異；試驗組的葉長顯著高于對照組15%，高于商用菌劑組8%；試驗組和商用菌劑組的葉寬與對照組相比都有顯著性差異，3個處理組葉片數(shù)和莖圍沒有顯著性差異。

2.3.3" 促生菌處理對煙葉理化指標的影響

煙葉理化指標檢測結果見表7，與空白對照比較，細菌促生菌LSyc30顯著提高了煙葉還原糖含量（提高了44.30%）、總糖含量（提高了50.00%）和鉀含量（提高了14.67%），和商用菌劑的煙草理化指標結果相近。

3" 結論與討論

3.1" 結論

本試驗從信陽市煙植土壤中共篩選出390株細菌，通過微生物-植物共培養(yǎng)方法篩選得到最優(yōu)的3株細菌促生菌LSyc30、LSyc52和LSys37進行盆栽驗證，結果顯示試驗組煙草都正常生長，無生長緩慢或病害現(xiàn)象，表明所篩選菌株對煙草生長無抑制作用。盆栽試驗中細菌LSyc30處理組的鮮重和根重顯著高于空白組，生長指標也優(yōu)于另外2個試驗組，細菌LSyc30組煙草各項指標與商用菌劑無顯著差別，且整體數(shù)值略高于商用菌劑，說明細菌LSyc30更具研究價值。對細菌LSyc30進行菌種鑒定，確定為芽孢桿菌屬，將其命名為Bacillus sp.LSyc30。盆栽試驗中促生菌可提高煙草根系活力，顯著提高煙PPO和PAL活力，試驗組POD、CAT、SOD活力和MDA含量與對照組無顯著差異。為進一步確定細菌LSyc30的促生效果和穩(wěn)定性，在信陽市進行了大田應用，細菌促生菌LSyc30和商用菌劑組各項指標均優(yōu)于空白組，細菌促生菌LSyc30各項指標（除根長外）略高于商用菌劑組，促生菌處理下煙草的株高顯著高于空白組和商用菌劑組，葉長和葉寬顯著高于空白組，3個處理組葉片數(shù)和莖圍沒有顯著性差異。煙葉理化指標檢測結果表明細菌促生菌LSyc30和商用菌劑的煙草理化指標結果相近，與對照相比顯著提高了煙葉還原糖含量（提高44.30%）、總糖含量（提高50.00%）和鉀含量（提高14.67%）。LSyc30菌株具有溶磷、解鉀、產鐵載體的功能，可以改善土壤環(huán)境，促進植物對營養(yǎng)物質的吸收。綜合結果顯示，無論是盆栽試驗還是大田應用促生菌對煙草的促生作用都優(yōu)于商用菌劑，表明促生菌LSyc30極具開發(fā)應用價值。

3.2" 討論

常見的促生菌篩選方法是通過溶磷、解鉀、固氮、產鐵載體篩選或者針對病害菌篩選拮抗菌尋找有益菌株，吳翔等從四川省5個煙草主栽區(qū)根際土壤樣品中通過檢測菌株產IAA、鐵載體和HCN的能力分離出923株微生物，再通過種子萌發(fā)試驗從中篩選促生菌，最后結果顯示有5株細菌能提高煙草種子發(fā)芽率［18］。但這種篩選方法存在一個弊端，那就是得到的菌株本身可能對植物有害，還需通過盆栽試驗進行驗證，此方法篩菌工作量大，效率低，實際應用效果欠佳。

本試驗建立了微生物-植物平板共培養(yǎng)生物檢測方法，針對具體的作物與菌株進行共培養(yǎng)篩選，可以直接觀察微生物對植物生長的影響，篩選效率高，結果更準確。本試驗從土壤樣品中篩選出390株細菌，通過共培養(yǎng)生物檢測方法篩選出3株促生效果好的細菌，再通過盆栽試驗復篩出1株促生效果最佳的細菌，結果證明，通過這種方法得到的菌株，在盆栽試驗和大田應用中，促生結果與平板共培養(yǎng)生物檢測方法結果一致。該菌株從油菜-水稻茬口后種植的煙草根際土中分離得到，經鑒定屬于芽孢桿菌屬，菌株所在原生態(tài)環(huán)境種植的煙草生長較好，篩選出該菌株也顯著促進了煙草的生長，可以確定LSyc30菌株是一株非常好的煙草促生細菌。此方法效率高，結果直觀明了，可操作性強，可為篩選植物共生目的菌株提供參考借鑒。

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，植物根系吸收運輸水分和養(yǎng)料都需要消耗能量，這些能量由根部細胞的呼吸作用提供，呼吸作用越強，說明根系的吸收作用越強，根系活力水平直接影響地上部的營養(yǎng)狀況及產量水平［19］。盆栽試驗中LSyc30試驗組根系活力比對照組提高了24%，說明這株促生菌能提高煙草根系活力，促進煙草對營養(yǎng)物質和水分的吸收。

PPO能夠促進植物傷口愈合，增加煙草對病原體的抗性［20］。促生菌LSyc30可顯著提高煙草PPO活力，增強煙草對病原體的抗性。

PAL是煙草新陳代謝過程連接初級代謝的第1步，是苯丙氨酸代謝的關鍵酶和限速酶，涉及植物木質化、色素形成、根瘤形成等過程，參與植保素的合成；PAL是煙草防止病原物侵染，促進其生長發(fā)育非常重要的一種酶［20］。結果顯示在處理30 d時顯著促進PAL酶活的表達，酶活力提高64.6%，刺激煙草的生長和代謝。

在大田試驗中促生菌LSyc30試驗組煙草農藝性狀株高、葉長和葉寬顯著優(yōu)于空白組，煙葉理化指標也優(yōu)于空白組，結合細菌促生菌對煙草促生效果和相關酶活力的影響，細菌促生菌在煙草生長后期顯著促進煙草生長，提高煙葉的鉀含量，煙草作為喜鉀植物，煙葉鉀含量的提升表明細菌可能具有解鉀能力從而促進煙草生長。與對照相比促生菌促進了煙草生長，提高了煙葉的產量，對煙葉品質無明顯影響。由此推測細菌促生菌促進煙草生長的促生作用主要是因為LSyc30菌株具有溶磷、解鉀、產鐵載體的功能，可以改善土壤環(huán)境，增強植物對營養(yǎng)物質吸收的能力，促進煙草的生長。已有研究報道在煙草種植中接種微生物菌劑可以促進煙草生長，提高煙草產量，改善土壤生態(tài)環(huán)境和煙葉品質［21］。劉春菊等從山東濰坊煙區(qū)根際土壤中篩選出10株溶磷效果較好的細菌，選用溶磷、抑菌、促生效果最好的一株菌，經鑒定為新洋蔥伯克霍爾德氏菌，進行溫室和田間煙草種植試驗，結果顯示這株菌能促進煙草對磷的吸收，改善煙草農藝性狀和煙葉品質，提高煙草產量，本試驗也得出類似結論［22］。通過平板共培養(yǎng)生測試驗和盆栽復篩試驗從信陽市煙植根際土壤中篩選出1株促生效果較好的細菌，應用到田間試驗可以促進煙草生長，減少化肥的使用，改善土壤環(huán)境，提高煙草產量和品質，有推廣應用價值，為微生物菌劑生產提供優(yōu)質菌種資源。

植物-微生物-土壤之間關系網(wǎng)絡非常復雜，促生菌在土壤中穩(wěn)定存在和發(fā)揮作用會受到土壤環(huán)境、土壤中微生物群落動態(tài)變化、植物根系分泌物等多種因素影響［23-24］，本試驗在信陽地區(qū)大田驗證篩選菌株可以促進煙草生長，但在其他地域，微生物是否可以穩(wěn)定存在和發(fā)揮作用還需要進行實地檢驗。在植物-微生物-土壤的復雜網(wǎng)絡中，可能還存在其他促生機制，例如促生菌可以拮抗病原菌［25］，改變土壤微生物群落結構，增加土壤微生物豐富度，提高其他促生菌的含量從而促進植物生長，或者通過復雜的植物-微生物-土壤調控影響機制促進植物生長［26］，這些都值得更加深入的研究。

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