• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大豆胞囊線蟲相關(guān)基因GmWRKY-3克隆及功能探究

    2024-12-05 00:00:00劉芳曲碩孫浩姜海鵬趙雪韓英鵬
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年23期
    關(guān)鍵詞:胞囊線蟲抗性

    摘要:大豆是世界四大糧食作物之一,與小麥、水稻和玉米并列。大豆胞囊線蟲(SCN,Heterodera glycines Ichinohe)是全球大豆最有害的病原體之一。利用大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種(SCN 3)、感病品種綏農(nóng)14、抗病品種東農(nóng)L10為材料,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,篩選出差異表達(dá)基因GmWRKY-3。為探究大豆GmWRKY-3基因的生物學(xué)功能及潛在用途,克隆GmWRKY-3基因,對(duì)GmWRKY-3基因的理化性質(zhì)、編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息學(xué)分析;構(gòu)建pCAMBIA1302-GmWRKY-3利用農(nóng)桿菌侵染煙草,并進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;構(gòu)建pCAMBIA3300-GmWRKY-3植物重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌K599后瞬時(shí)侵染大豆毛狀根,初步探究GmWRKY-3基因的功能。結(jié)果表明,GmWRKY-3基因編碼的蛋白分子量約為 24.93 ku,等電點(diǎn)為8.46,分子式為C1 086H1 722N312O343S9,不穩(wěn)定系數(shù)為67.73,屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主,三級(jí)結(jié)構(gòu)由1個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊組成;該基因含有多個(gè)光響應(yīng)元件和多種激素順式作用元件等。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,GmWRKY-3基因主要定位于細(xì)胞核。農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染大豆毛狀根結(jié)果表明,與pCAMBIA3300空載體轉(zhuǎn)基因植株相比,pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因受體植株東農(nóng)50中根部線蟲數(shù)量相對(duì)較少。上述結(jié)果表明,GmWRKY-3基因?qū)CN有一定的抵抗能力。

    關(guān)鍵詞:大豆;大豆胞囊線蟲;GmWRKY-3;亞細(xì)胞定位

    中圖分類號(hào):S435.651" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2024)23-0030-08

    劉" 芳,曲" 碩,孫浩文,等. 大豆胞囊線蟲相關(guān)基因GmWRKY-3克隆及功能探究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2024,52(23):30-38.

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.004

    收稿日期:2023-10-18

    基金項(xiàng)目:黑龍江省重點(diǎn)基金(編號(hào):ZD2022C002);黑龍江省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(編號(hào):JD22A015);國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):U22A20473);國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)崗位體系項(xiàng)目(編號(hào):CARS-04-PS07);東北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研項(xiàng)目(編號(hào):NEAU2023QNLJ-003)。

    作者簡(jiǎn)介:劉" 芳(2000—),女,黑龍江齊齊哈爾人,碩士研究生,主要從事大豆作物遺傳育種,E-mail:18846913802@139.com;共同第一作者:曲" 碩(1994—),男,吉林長(zhǎng)春人,博士研究生,主要從事大豆作物遺傳育種,E-mail:531140417@qq.com。

    通信作者:韓英鵬,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事大豆基因組學(xué)遺傳育種研究,E-mail:hyp234286@aliyun.com;趙" 雪,博士,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事大都基因組學(xué)和分子育種研究,E-mail:xuezhao@neau.edu.cn。

    大豆[Glycine max (Linn.) Merr.]原產(chǎn)于我國(guó),為豆科大豆屬一年生草本植物,是我國(guó)重要的糧食和油料作物[1]。生物脅迫是造成大豆減產(chǎn)的主要因素之一,其中大豆胞囊線蟲(SCN)病是大豆主要的病蟲害之一[2]。大豆胞囊線蟲在世界各地的大豆主產(chǎn)區(qū)均有廣泛分布,在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)于東北地區(qū)[3]。SCN平均每年造成的大豆產(chǎn)量損失為 10%~30%[4-6]。目前主要的防治措施為輪作和施用農(nóng)藥,但農(nóng)藥嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境,因此提高大豆對(duì)SCN的抵抗能力迫在眉睫。

    大豆胞囊線蟲的生命周期為3~4周,分為3個(gè)主要階段,即卵期、幼蟲期和成蟲期,其中幼蟲期又可以分為4個(gè)階段(J1~J4)[7]。卵在胞囊內(nèi)形成,卵蛻皮進(jìn)入J1階段,J1階段蛻皮進(jìn)入蠕蟲狀的J2階段,J2階段是線蟲唯一具有侵害大豆根系能力的階段[8]。SCN通過表皮細(xì)胞侵染大豆根部,使其不能正常生長(zhǎng),進(jìn)而造成大豆減產(chǎn)。合胞體是SCN和大豆宿主之間的生物營(yíng)養(yǎng)界面,它的功能必須保持約3周的時(shí)間,線蟲才能通過J3、J4階段的生長(zhǎng)發(fā)育,形成成年雌性或雄性。雌性SCN的體內(nèi)攜帶幾百個(gè)卵,在根表皮生長(zhǎng),同時(shí)在根維管圓柱體上保持不斷擴(kuò)大的合胞體攝食位點(diǎn)。雄性SCN放棄合胞體,離開根部,遷移給雌性受精。受精的雌性SCN通常會(huì)釋放一些卵,這些卵會(huì)釋放后不久孵化,從而在同一生長(zhǎng)季節(jié)實(shí)現(xiàn)線蟲種群增加和植物損傷。但仍有幾百個(gè)卵通常保留在雌性體內(nèi),隨著雌性線蟲死亡,形成硬化的胞囊。目前大豆對(duì)SCN的主要抗性位點(diǎn)為Rhg1和Rhg4,伴隨著不同生理小種的突變和環(huán)境的變化,發(fā)現(xiàn)更多的抗性位點(diǎn)具有重要意義。

    WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族之一,是調(diào)節(jié)許多植物過程信號(hào)網(wǎng)的組成部分[9]。WRKY在植物中的表達(dá)量非常豐富,與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),其中最主要的作用是調(diào)節(jié)植物的免疫與病原體發(fā)育。目前,距第1次發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子已超過20年。近些年關(guān)于WRKY的研究越來越廣泛,如在耐旱、耐鹽、抗病等方面都有所研究,且在煙草、馬鈴薯、擬南芥、水稻等植物中均已被鑒定和分析[10-13]。WRKY第1次是在甘薯中被鑒定出來的[14]。WRKY功能主要是由其結(jié)構(gòu)域決定的,長(zhǎng)度約為60個(gè)氨基酸殘基,WRKYGQK位于其N末端,其C端還具有鋅指結(jié)構(gòu)。

    WRKY基因在很多植物中都發(fā)揮著重要功能,但相關(guān)研究主要集中在擬南芥和一些其他作物中,而在大豆胞囊線蟲上的研究較為少見。楊雪梅等發(fā)現(xiàn),擬南芥WRKY51轉(zhuǎn)錄因子可以抑制RPW8.1啟動(dòng)子的活性,通過敲除該基因可以調(diào)控RPW8.1啟動(dòng)子的活性,從而影響植物對(duì)白粉病的抗性,說明WRKY51介導(dǎo)基本防御反應(yīng)[15]。Meher等在對(duì)稻瘟病抗性基因進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),OsWRKY蛋白可與2個(gè)稻瘟病抗病基因Pi2和Pi54的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,對(duì)稻瘟病的發(fā)展具有重要意義[16]。劉麗麗等采用VIGS策略,沉默基因SlWRKY80,發(fā)現(xiàn)植株根部對(duì)線蟲的敏感性增強(qiáng),根結(jié)數(shù)量增多,植株病情指數(shù)由感病態(tài)變?yōu)楦吒袘B(tài),說明SlWRKY80可能作為正調(diào)控因子參與番茄對(duì)根結(jié)線蟲的抵抗[17]。Wang等在對(duì)柑橘的研究中發(fā)現(xiàn),CsWRKY33定位于細(xì)胞核,瞬時(shí)過表達(dá)CsWRKY33可顯著增強(qiáng)寄主對(duì)綠霉病的抗性[18]。通過過往的研究發(fā)現(xiàn),WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物抵抗逆境脅迫具有重要意義。

    目前,關(guān)于WRKY基因家族在SCN脅迫下發(fā)揮的功能和機(jī)制還沒有相關(guān)研究報(bào)道。因此對(duì)于抗SCN的研究提供了重要的基因資源。本研究利用大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種(SCN3)、感病品種綏農(nóng)14、抗病品種東農(nóng)L10為材料,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,篩選出差異表達(dá)基因GmWRKY-3,通過克隆GmWRKY-3基因,對(duì)GmWRKY-3基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹生物信息學(xué)分析。構(gòu)建pCAMBIA1302-GmWRKY-3重組質(zhì)粒進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,并構(gòu)建pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌K599,對(duì)大豆毛狀根進(jìn)行瞬時(shí)侵染,初步探究GmWRKY-3基因的功能。

    1" 材料與方法

    1.1" 試驗(yàn)材料

    本研究于2023年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。大豆感病品種綏農(nóng)14、東農(nóng)50和抗病品種東農(nóng)L10均來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽基地(45.76°N,126.93°E)。大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種取自黑龍江省大慶市安達(dá)試驗(yàn)基地。具體鑒定方法參照文獻(xiàn)[19]。

    1.2" 試驗(yàn)方法

    1.2.1" GmWRKY-3基因克隆

    利用TRIzol法提取抗病大豆品種東農(nóng)L10 的mRNA,利用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2" GmWRKY-3基因擴(kuò)增

    在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)中查找GmWRKY-3基因全長(zhǎng)序列,根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)引物(表1)。反應(yīng)體系為20 μL,其中上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板2 μL、KOD ONE 10 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s,58 ℃退火5 s,68 ℃延伸5 s,35個(gè)循環(huán);68 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增程序結(jié)束后,取4 μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

    1.2.3" GmWRKY-3基因亞細(xì)胞定位分析

    根據(jù)GmWRKY-3基因的CDS序列,選取pCAMBIA1302載體的NcoⅠ酶切位點(diǎn)側(cè)翼各15 bp同源序列進(jìn)行引物修飾,利用Primer 5設(shè)計(jì)基因亞細(xì)胞定位引物(表1)。以抗病品種東農(nóng)L10 的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系同“1.2.2”節(jié)。參照南京諾唯贊生物科技股份有限公司的ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒的操作步驟,應(yīng)用同源重組技術(shù),將目的片段與酶切后的pCAMBIA1302載體進(jìn)行in-fusion連接,取GmWRKY-3-sub PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL、pCAMBIA1302載體 3 μL、5×Mix Buffer 4 μL、酶2 μL、ddH2O 10 μL 混勻,30 ℃連接30 min。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中,經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增及測(cè)序,確定已成功將GmWRKY-3連接入pCAMBIA1302載體。參照說明書,將pCAMBIA1302-GmWRKY-3轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中,涂布于含有Kana抗性的LB固體培養(yǎng)基上,挑取的單菌落轉(zhuǎn)移至含有液體LB的2 mL EP管中,之后轉(zhuǎn)移至50 mL液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);室溫收集菌體;使用MES重懸至D600 nm=1.0,室溫黑暗靜置2~3 h;注射至 4 周齡煙草葉片背部,25 ℃ 黑暗培養(yǎng)12 h后,正常培養(yǎng) 2 d。采用注射器在侵染葉片上選取4~6個(gè)葉圓片進(jìn)行制片;隨后在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)綠色熒光信號(hào)。

    1.3" 基因生物信息學(xué)分析

    1.3.1" 理化性質(zhì)及編碼蛋白質(zhì)分析

    利用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)分析GmWRKY-3轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì);使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析GmWRKY-3轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org)分析蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。研究差異表達(dá)基因編碼蛋白的二級(jí)、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)。

    1.3.2" 啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

    利用PlantCARE分析GmWRKY-3轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件。

    1.3.3" 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

    利用MEGA 10.0軟件對(duì)基因編碼蛋白進(jìn)行比對(duì),采用鄰接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析基因在不同物種中的分布情況和親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。

    1.4" pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組質(zhì)粒連接及測(cè)序

    根據(jù)GmWRKY-3基因的CDS序列、pCAMBIA3300載體的XbaⅠ酶切位點(diǎn)側(cè)翼各15 bp同源序列進(jìn)行引物修飾,利用Primer 5對(duì)GmWRKY-3基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì),結(jié)果見表1。PCR擴(kuò)增、目的片段與載體的連接、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定過程參照“1.2.2”“1.2.3”節(jié)。

    1.5" pCAMBIA3300-GmWRKY-3農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染

    提取測(cè)序正確的大腸桿菌pCAMBIA3300-GmWRKY-3的質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌K599中。初步鑒定過程參照“1.2.3”節(jié)。選取籽粒大小均勻、完整、無病斑的感病品種綏農(nóng)14與東農(nóng)50,播種至蛭石中。蘸取上述發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上,置于28" ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),將菌落輕輕刮下,使用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基重懸菌體,直至D600 nm=0.8,得到菌液侵染液。選取3~4 d苗齡的幼苗,使用1 mL注射器,在幼苗子葉節(jié)點(diǎn)或近端下胚軸處注射菌液,重復(fù)2~3次,進(jìn)行菌液接種,并在傷口下端約1 cm處剪斷,放回蛭石中培養(yǎng)2~3周,取適量根部組織利用Bar試紙條進(jìn)行轉(zhuǎn)基因根系鑒定。將在Bar試紙條水平上檢測(cè)為轉(zhuǎn)基因陽性的植株,保留陽性根部組織,移栽至接種大豆胞囊線蟲卵懸液的病土中,繼續(xù)培養(yǎng)2~3周。

    1.6" 陽性根表型鑒定

    以感病品種東農(nóng)50為受體試驗(yàn)材料,將含有pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組載體與pCAMBIA3300空載體的K599農(nóng)桿菌菌液接種于根系生長(zhǎng)點(diǎn),接種15 d后,進(jìn)行側(cè)根取樣,采用Bar試紙條進(jìn)行鑒定,根據(jù)Bar試紙條驗(yàn)證結(jié)果,選取轉(zhuǎn)基因陽性根接種HG type 0(3號(hào)生理小種)。接種SCN 15 d后,采用酸性品紅染色法分別對(duì)2個(gè)試驗(yàn)組合(接種pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組載體和pCAMBIA3300空載體農(nóng)桿菌菌液)發(fā)生突變和未發(fā)生突變的大豆根部進(jìn)行染色,在體式顯微鏡下觀察線蟲侵染情況,每株取3個(gè)側(cè)根作為生物學(xué)重復(fù)。

    2" 結(jié)果與分析

    2.1" GmWRKY-3基因克隆

    以抗病品種東農(nóng)L10大豆根部的cDNA為模板進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增后,將擴(kuò)增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),克隆載體測(cè)序結(jié)果(圖1)表明,目的片段大小為663 bp,該序列長(zhǎng)度與GmWRKY-3 CDS序列相符。

    2.2" 基因序列生物信息學(xué)分析

    2.2.1" GmWRKY-3基因理化性質(zhì)及編碼蛋白質(zhì)分析

    使用Phytozome在線網(wǎng)站查找GmWRKY-3的基因信息,該基因的CDS序列長(zhǎng)度為663 bp,編碼220個(gè)氨基酸。利用ExPASy在線工具對(duì)GmWRKY-3編碼蛋白的基本理化特性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,該

    蛋白分子量約為24.93 ku,等電點(diǎn)為8.46,分子式為C1 086H1 722N312O343S9,脂肪指數(shù)為51.37,不穩(wěn)定系數(shù)為67.73,表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)中絲氨酸個(gè)數(shù)最多,占總氨基酸數(shù)量的10.0%,其次為谷氨酸、蘇氨酸,占比均在8.0%以上,最少的是蛋氨酸,占比為1.4%。通過SOPMA網(wǎng)站對(duì)GmWRKY-3編碼的氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果(圖2)顯示,不同結(jié)構(gòu)類型的占比分別為無規(guī)則卷曲48.64%、α-螺旋32.27%、延伸鏈15.91%、β-轉(zhuǎn)角3.18%。使用SWISS-MODEL對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模,預(yù)測(cè)該蛋白的結(jié)構(gòu)域主要由1個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊組成。

    2.2.2" 啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

    使用PlantCARE啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析GmWRKY-3基因的順式作用元件,結(jié)果(表2)表明,上游區(qū)域含有MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),G-box、TCT-motif光響應(yīng)元件,MBS參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn),ABRE、Myb等脅迫相關(guān)激素的響應(yīng)元件。MYB轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)是最多作用元件。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè),GmWRKY-3基因的表達(dá)可能受到光、脅迫、激素等多種信號(hào)的調(diào)控,從而影響植物抵抗生物脅迫的能力。

    2.2.3" 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

    為了解GmWRKY-3的進(jìn)化關(guān)系,從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出與GmWRKY-3基因編碼蛋白同源性較高的多種植物的WRKY蛋白序列,包括向日葵(sunflower)、傘形葡萄(umbrella grape)、角荬菜(endive)、菜豆(pea bean)、三葉草(whitetip clover)、日本蓮花(Japanese lotus)、白蕨(white fern)、龍眼雙果(longan double fruit)、本氏煙草(ben tobacco)等,同時(shí)利用MEGA 10.0軟件構(gòu)建與大豆同源度較高的物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果(圖3)表明,大豆的GmWRKY-3基因與同物種大豆WRKY40轉(zhuǎn)錄因子(XP 025983959.1)親緣關(guān)系最近,不同物種之間與野生大豆(RZC15262.1)、赤豆(XP 017429633.1 )、洋紫荊(KAI4337249.1)、木豆(XP 020206663.1、KYP34952.1)等聚為同一分支,親緣關(guān)系較近,同源性較高。

    2.3" pCAMBIA1302-GmWRKY-3載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

    將重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-GmWRKY-3連接轉(zhuǎn)化至DH5α后,在具有Kana抗性的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng),使用引物GmWRKY-3-1302-F和 GmWRKY-3-1302-R(表1)對(duì)陽性單菌落進(jìn)行特異性擴(kuò)增,對(duì)獲得含有目的條帶的陽性菌液(圖4)進(jìn)行測(cè)序,并保存至-80 ℃冰箱中。

    將含有重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-GmWRKY-3的農(nóng)桿菌K599菌液注射入本氏煙草中。結(jié)果顯示,在瞬時(shí)表達(dá)pCAMBIA1302-GmWRKY-3融合蛋白的煙草葉片細(xì)胞中,細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均能檢測(cè)到熒光信號(hào),但主要定位于細(xì)胞核;而單獨(dú)表達(dá)

    pCAMBIA1302的對(duì)照細(xì)胞,熒光信號(hào)分布于整個(gè)細(xì)胞(圖5)。可見GmWRKY-3蛋白屬于核定位蛋白。

    2.4" pCAMBIA3300-GmWRKY-3載體構(gòu)建

    將重組質(zhì)粒pCAMBIA3300-GmWRKY-3連接轉(zhuǎn)化至DH5α后,在具有Kana抗性的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng),使用引物GmWRKY-3-3300-F和 GmWRKY-3-3300-R(表1)對(duì)陽性單菌落進(jìn)行特異性擴(kuò)增,對(duì)獲得的目的條帶正確的菌液(圖6)進(jìn)行測(cè)序,并保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

    2.5" GmWRKY-3基因抗病性驗(yàn)證

    分別選取轉(zhuǎn)入pCAMBIA3300-GmWRKY-3基因與pCAMBIA3300空載體的植株,利用Bar試紙條在蛋白水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果(圖7)表明,pCAMBIA3300-GmWRKY-3基因與pCAMBIA3300空載體均成功轉(zhuǎn)入植株。由圖8可知,與對(duì)照相比,pCAMBIA3300-GmWRKY-3轉(zhuǎn)基因植株在莖、葉水平上無明顯差別,但對(duì)照組毛狀根明顯少于pCAMBIA3300-GmWRKY-3轉(zhuǎn)基因植株。接種SCN 15 d后,對(duì)大豆根部進(jìn)行酸性品紅染色,并在20×體式顯微鏡下觀察線蟲侵染情況。圖9-a~圖9-c 為pCAMBIA3300-GmWRKY-3轉(zhuǎn)基因陽性植株根中大豆胞囊線蟲侵染情況,平均每個(gè)側(cè)根有 1~5頭大豆胞囊線蟲,根部線蟲數(shù)量平均值為 4.30個(gè)/cm;圖9-d為pCAMBIA3300空載體對(duì)照植株根部線蟲侵染情況,根部線蟲數(shù)量平均值為6.30個(gè)/cm,可見轉(zhuǎn)基因陽性植株根部線蟲數(shù)量明顯少于對(duì)照植株,初步證實(shí),GmWRKY-3基因?qū)Υ蠖拱揖€蟲病有一定的抵抗能力。

    3" 討論

    大豆最早在我國(guó)被發(fā)現(xiàn),隨后傳入其他國(guó)家,

    我國(guó)大豆胞囊線蟲主要分布于東北地區(qū)和黃淮海地區(qū)。大豆胞囊線蟲于1954年在美國(guó)北卡羅來納州第1次被發(fā)現(xiàn),是一種土傳性病害,在土壤中沒有寄主存在時(shí),在某些儲(chǔ)存條件下可以存活9年[20]。由于鑒別的寄主不同,大豆胞囊線蟲被分為16個(gè)生理小種, 我國(guó)主要有11個(gè)生理小種,其中關(guān)于3號(hào)生理小種的研究最為廣泛,4號(hào)生理小種的侵染能力最強(qiáng)[21]。

    目前,選育并種植抗大豆胞囊線蟲病大豆品種是防治SCN最經(jīng)濟(jì)有效的措施,而篩選抗源是抗性品種選育的基礎(chǔ)。Concibido等使用遺傳標(biāo)記,分析了3種分離大豆F2代種群,并將結(jié)果與之前涉及PI 209332的研究結(jié)果進(jìn)行了比較,總結(jié)了有關(guān)SCN相互作用的廣泛遺傳數(shù)據(jù),為SCN研究人員和大豆育種者提供了資源[22]。有研究表明,在不同的大豆產(chǎn)區(qū),SCN也可以在PI 88788、PI 437654、Peking上繁殖,嚴(yán)重影響產(chǎn)量及其他農(nóng)藝性狀。因此迫切需要從不同抗性來源培育穩(wěn)定的抗性品種。近年來,關(guān)于大豆胞囊線蟲抗性基因的篩選取得了重大進(jìn)展,Rhg1(18號(hào)染色體)和Rhg4(8號(hào)染色體)為主要的抗性位點(diǎn)。來自PI 88788的Rhg1位點(diǎn)是商業(yè)品種中可用的抗性的主要來源,可以最大限度地減少侵染SCN的產(chǎn)量損失。Rhg1包含3個(gè)主要的基因,其中1個(gè)為t-SNARE,是大豆Rhg1基因抵抗胞囊線蟲的關(guān)鍵決斷因素[23]。為抵御細(xì)菌、真菌和線蟲等病原體的入侵,許多植物利用囊泡運(yùn)輸來應(yīng)對(duì)免疫反應(yīng),t-SNARE編碼的蛋白是囊泡運(yùn)輸?shù)闹饕鞍字唬?4]。來自Peking的Rhg4位點(diǎn)主要抵抗3號(hào)生理小種和14號(hào)生理小種。目前大多數(shù)抗性品種的抗性均來源于PI88788、Peking和PI437654基因型背景,主要抵抗3號(hào)生理小種[22,25],因此,挖掘新的抗性基因至關(guān)重要。

    同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),線蟲的取食位點(diǎn)還受信號(hào)激素的影響,Kammerhofer等于2015年發(fā)現(xiàn),擬南芥中的茉莉酸(JA)對(duì)甜菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii)取食起著防御作用,乙烯則對(duì)線蟲取食起著積極作用,水楊酸(SA)抑制合胞體的形成[26];Nahar等于2011年在對(duì)水稻的研究中發(fā)現(xiàn),外源施加乙烯利和茉莉酸甲酯(MeJA)后,線蟲在抵消根系防御途徑方面效果較差,從而增強(qiáng)植物對(duì)線蟲的抵抗能力[27]。胡巖峰等于2018年研究發(fā)現(xiàn)了茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)對(duì)SCN的防御效應(yīng)和作用機(jī)制[28]。SCN是植物病原體中最具挑戰(zhàn)性的病原體之一,主要原因在于胞囊在土壤中存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年,它的卵在胞囊內(nèi)孵化,可免受破壞性環(huán)境的影響,包括免受迄今為止已知的最具侵略性(不可接受的侵略性)殺蟲劑的侵害[29]。一旦SCN在農(nóng)田中建立,就很難根除。遠(yuǎn)離大豆輪作5~7年是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,在下一個(gè)種植季節(jié)仍然會(huì)有未孵化的SCN卵孵化,并且在有利于發(fā)病的環(huán)境范圍內(nèi)廣泛傳播。SCN侵?jǐn)_的地理范圍延伸到美國(guó)中部和加拿大的主要大豆產(chǎn)區(qū)以及巴西和阿根廷,現(xiàn)在在我國(guó)也很常見[30]。

    WRKY蛋白可以根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指基序的類型分為Ⅰ~Ⅲ組。WRKY也可以根據(jù)其基因內(nèi)含子類型分為2組,即R型或V型。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合順式作用元件激活下游基因,涉及生理變化以及對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物先天免疫系統(tǒng)許多方面的核心組成部分,包括MTI或PTI、ETI、基礎(chǔ)防御和全身性抵抗。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與種子發(fā)育、種子休眠和發(fā)芽、開花、衰老、代謝途徑以及毛狀體形態(tài)發(fā)生和植物生長(zhǎng)。它們主要通過與特定基因啟動(dòng)子中存在的保守W-box元件結(jié)合來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外,WRKY轉(zhuǎn)錄因子,尤其是Ⅲ組,可參與對(duì)食草動(dòng)物、病原體和線蟲的反應(yīng)?,F(xiàn)在有許多例子證明,WRKY基因的過表達(dá)或敲除對(duì)植物防御能力有影響,Grunewald等已初步探索了AtWRKY23在擬南芥中對(duì)線蟲的抵抗能力,為后續(xù)從WRKY轉(zhuǎn)錄因子中挖掘大豆胞囊線蟲抗性基因提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)[31]。

    4" 結(jié)論

    本研究成功克隆了大豆GmWRKY-3基因,該基因的CDS序列長(zhǎng)度為663 bp,共編碼220個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,GmWRKY-3基因編碼的蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主,三級(jí)結(jié)構(gòu)由1個(gè)α-螺旋和5個(gè) β-折疊組成。由啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果可知,該基因含有多個(gè)光響應(yīng)元件和多種激素順式作用元件等。為了進(jìn)一步研究其功能,本研究構(gòu)建pCAMBIA1302-GmWRKY-3重組質(zhì)粒,并進(jìn)行亞細(xì)胞定位,在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),GmWRKY-3基因主要在細(xì)胞核中行使功能。本研究構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCAMBIA3300-GmWRKY-3,利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染大豆毛狀根,結(jié)果表明,pCAMBIA3300-GmWRKY-3轉(zhuǎn)基因陽性植株根中線蟲數(shù)量平均值為4.30個(gè)/cm;pCAMBIA3300空載體對(duì)照植株根部線蟲數(shù)量平均值為6.30個(gè)/cm,說明轉(zhuǎn)基因陽性植株根部雌蟲平均數(shù)明顯少于對(duì)照植株,初步證實(shí)GmWRKY-3對(duì)大豆胞囊線蟲有一定的抵抗能力。結(jié)果可為進(jìn)一步探究在SCN脅迫下,GmWRKY2-3增強(qiáng)大豆抵抗能力的相關(guān)研究提供重要的理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]曲" 碩,劉" 芳,宋庚晨,等. 大豆抗胞囊線蟲鋅指蛋白基因GmC_2H_2-2like克隆與初步功能分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào),2024,39(3):195-207.

    [2]Kang H,Ko H,Kim D,et al. Occurrence of the white soybean cyst nematode,Heterodera sojae,and the soybean cyst nematode,H. glycines,in Korea[J]. Plant Disease,2021,105(1):31-33.

    [3]孟凡立,于瑾瑤,李春杰,等. 東北地區(qū)大豆胞囊線蟲病發(fā)生和防控技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,53(1):87-94.

    [4]Bradley C A,Allen T W,Sisson A J,et al. Soybean yield loss estimates due to diseases in the United States and Ontario,Canada,from 2015 to 2019[J]. Plant Health Progress,2021,22(4):483-495.

    [5]Peng D L,Jiang R,Peng H,et al. Soybean cyst nematodes:a destructive threat to soybean production in China[J]. Phytopathology Research,2021,3(1):1-16.

    [6]Arjoune Y,Sugunaraj N,Peri S,et al. Soybean cyst nematode detection and management:a review[J]. Plant Methods,2022,18(1):110.

    [7]Niblack T L,Lambert K N,Tylka G L. A model plant pathogen from the Kingdom Animalia:Heterodera glycines,the soybean cyst nematode[J]. Annual Review of Phytopathology,2006,44:283-303.

    [8]Niblack T L. Soybean cyst nematode management reconsidered[J]. Plant Disease,2005,89(10):1020-1026.

    [9]Rushton P J,Somssich I E,Ringler P,et al. WRKY transcription factors[J]. Trends in Plant Science,2010,15(5):247-258.

    [10]賈振宇. 煙草轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY65在干旱和低氮脅迫中的功能研究[D]. 鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2022.

    [11]Zhang C,Wang D D,Yang C H,et al. Genome-wide identification of the potato WRKY transcription factor family[J]. PLoS One,2017,12(7):e0181573.

    [12]王藝橋,趙新杰,牛芳芳,等. 擬南芥中WRKY31轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性與互作蛋白分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2018,34(5):101-109.

    [13]郭亦非,李" 培,鄒怡婷,等. 水稻OsWRKY78轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)與功能研究[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2019,40(2):18-24.

    [14]郝青婷,高" 偉,閆虎斌,等. 綠豆WRKY基因家族的全基因組鑒定及生物信息學(xué)分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2023,51(5):59-71,81.

    [15]楊雪梅,趙志學(xué),曹小龍,等. 擬南芥WRKY51參與調(diào)控RPW8.1介導(dǎo)的基礎(chǔ)防御反應(yīng)[C]//彭友良,宋寶安. 植物病理科技創(chuàng)新與綠色防控:中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2021年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 貴陽:中國(guó)植物病理學(xué)會(huì),2021:463.

    [16]Meher J,Sarkar A,Sarma B K. Binding of stress-responsive OsWRKY proteins through WRKYGQK heptapeptide residue with the promoter region of two rice blast disease resistance genes Pi2 and Pi54 is important for development of blast resistance[J]. 3 Biotech,2023,13(9):294.

    [17]劉麗麗,羅明銀,陳銀霞,等. SlWRKYs在番茄抗根結(jié)線蟲病過程中初步功能分析與驗(yàn)證[J/OL]. 分子植物育種,2023:1-11(2023-03-07)[2024-09-01]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20230307.1349.002.html.

    [18]Wang W J,Li T,Chen Q,et al. Transcriptional regulatory mechanism of a variant transcription factor CsWRKY23 in Citrus fruit resistance to Penicillium digitatum[J]. Food Chemistry,2023,413:135573.

    [19]Riggs R D,Schmitt D P.Complete characterization of the race scheme for Heterodera glycines[J]. Journal of Nematology,1988,20(3):392-395.

    [20]Tylka G L,Marett C C.Distribution of the soybean cyst nematode,Heterodera glycines,in the United States and Canada:1954 to 2014[J]. Plant Health Progress,2014,15(2):85-87.

    [21]練" 云,王金社,李海朝,等. 黃淮大豆主產(chǎn)區(qū)大豆胞囊線蟲生理小種分布調(diào)查[J]. 作物學(xué)報(bào),2016,42(10):1479-1486.

    [22]Concibido V C,Lange D A,Denny R L,et al. Genome mapping of soybean cyst nematode resistance genes in ‘Peking’,PI 90763,and PI 88788 using DNA markers[J]. Crop Science,1997,37(1):258-264.

    [23]Dong J,Zielinski R E,Hudson M E.T-SNAREs bind the Rhg1 α-SNAP and mediate soybean cyst nematode resistance[J]. Plant Journal,2020,104(2):318-331.

    [24]Jones J D,Dangl J L.The plant immune system[J]. Nature,2006,444(7117):323-329.

    [25]Concibido V C,Diers B W,Arelli P R.A decade of QTL mapping for cyst nematode resistance in soybean[J]. Crop Science,2004,44(4):1121-1131.

    [26]Kammerhofer N,Radakovic Z,Regis J M A,et al. Role of stress-related hormones in plant defence during early infection of the cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis[J]. New Phytologist,2015,207(3):778-789.

    [27]Nahar K,Kyndt T,de Vleesschauwer D,et al. The jasmonate pathway is a key player in systemically induced defense against root knot nematodes in rice[J]. Plant Physiology,2011,157(1):305-316.

    [28]胡巖峰,華" 萃,陳" 雙. 植物防御激素茉莉酸和水楊酸對(duì)大豆胞囊線蟲的誘導(dǎo)抗性研究[R]. 長(zhǎng)春:中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)技術(shù)中心,2018-07-26.

    [29]Winter Shawn M J,Rajcan I,Shelp B J. Soybean cyst nematode:challenges and opportunities[J]. Canadian Journal of Plant Science,2006,86:25-32.

    [30]Tylka G L,Marett C C. Known distribution of the soybean cyst nematode,Heterodera glycines,in the United States and Canada,1954 to 2017[J]. Plant Health Progress,2017,18:167-168.

    [31]Grunewald W,Karimi M,Wieczorek K,et al. A role for AtWRKY23 in feeding site establishment of plant-parasitic nematodes[J]. Plant Physiology,2008,148(1):358-368.

    猜你喜歡
    胞囊線蟲抗性
    夏季蔬菜換茬期線蟲防治要注意
    一個(gè)控制超強(qiáng)電離輻射抗性開關(guān)基因的研究進(jìn)展
    抗大豆胞囊線蟲SCN3-11位點(diǎn)的KASP標(biāo)記開發(fā)和利用
    地黃花對(duì)秀麗線蟲壽命的影響
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:04
    甲基對(duì)硫磷抗性菌的篩選及特性研究
    朝鮮孢囊線蟲——浙江省孢囊線蟲新記錄種
    線蟲共生菌Xenorhabdus budapestensis SN19次生代謝產(chǎn)物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定
    甜玉米常見病害的抗性鑒定及防治
    用于黃瓜白粉病抗性鑒定的InDel標(biāo)記
    大豆連作對(duì)大豆胞囊線蟲胞囊相關(guān)細(xì)菌群落的影響
    大豆科技(2014年5期)2014-03-23 02:46:18
    欧美黄色淫秽网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| avwww免费| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 曰老女人黄片| 手机成人av网站| 亚洲专区字幕在线| 精品国产国语对白av| 久久精品国产综合久久久| 色播在线永久视频| 亚洲国产欧美网| 国产99久久九九免费精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品少妇久久久久久888优播| 在线观看免费高清a一片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 成人免费观看视频高清| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久久久国产精品人妻一区二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 在线av久久热| 搡老乐熟女国产| 亚洲国产av影院在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产亚洲一区二区精品| 婷婷成人精品国产| 国产在线一区二区三区精| 国产真人三级小视频在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 99热网站在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线观看免费高清a一片| 久久国产精品影院| 99久久精品国产亚洲精品| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产av一区二区精品久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 桃花免费在线播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久人妻熟女aⅴ| 交换朋友夫妻互换小说| 人妻一区二区av| h视频一区二区三区| 国产成人欧美| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 一本综合久久免费| 欧美激情久久久久久爽电影 | 高清黄色对白视频在线免费看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一级片'在线观看视频| 两个人看的免费小视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲欧美激情在线| 看免费av毛片| 国产在视频线精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 成人影院久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲综合色网址| av国产精品久久久久影院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲熟女毛片儿| 午夜两性在线视频| 丝袜脚勾引网站| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 大片免费播放器 马上看| 9色porny在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 中文欧美无线码| 两个人免费观看高清视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 黄频高清免费视频| 日本wwww免费看| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品一区二区三区av网在线观看 | 日韩中文字幕视频在线看片| 免费不卡黄色视频| 丝袜人妻中文字幕| 18在线观看网站| 日韩制服骚丝袜av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 日日夜夜操网爽| 蜜桃国产av成人99| 一二三四社区在线视频社区8| 制服诱惑二区| av天堂久久9| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩电影二区| 国产xxxxx性猛交| 高潮久久久久久久久久久不卡| 99热网站在线观看| 亚洲久久久国产精品| 国产精品二区激情视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人系列免费观看| 在线观看人妻少妇| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲男人天堂网一区| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美激情极品国产一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 国产成人免费观看mmmm| 9色porny在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人精品在线电影| 国产免费现黄频在线看| 国产精品一区二区在线观看99| 他把我摸到了高潮在线观看 | 亚洲久久久国产精品| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲国产欧美在线一区| 色播在线永久视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 搡老熟女国产l中国老女人| 1024视频免费在线观看| 久久久欧美国产精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 手机成人av网站| 脱女人内裤的视频| 麻豆av在线久日| www.999成人在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一本久久精品| 国产深夜福利视频在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一级片免费观看大全| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久久久久精品精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 无遮挡黄片免费观看| 国产免费现黄频在线看| 免费观看a级毛片全部| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 黄色视频,在线免费观看| 三级毛片av免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产欧美日韩精品亚洲av| e午夜精品久久久久久久| 久久久久网色| 国产三级黄色录像| 国产精品 欧美亚洲| 美女视频免费永久观看网站| 69av精品久久久久久 | 老司机靠b影院| 天天添夜夜摸| 成人影院久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久免费观看电影| 国产精品一区二区在线不卡| 精品国产国语对白av| 欧美精品亚洲一区二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 新久久久久国产一级毛片| 色老头精品视频在线观看| 国产成人av激情在线播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 成年人午夜在线观看视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 18禁观看日本| av有码第一页| 99热国产这里只有精品6| 久久久久久久精品精品| 国产精品久久久久久精品古装| 考比视频在线观看| 亚洲精华国产精华精| 老司机福利观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 嫩草影视91久久| videosex国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲国产欧美网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 叶爱在线成人免费视频播放| 中国国产av一级| 动漫黄色视频在线观看| 午夜免费观看性视频| 久久久欧美国产精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 咕卡用的链子| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 午夜成年电影在线免费观看| tocl精华| 欧美精品一区二区大全| 电影成人av| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产成人欧美在线观看 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美成人午夜精品| 他把我摸到了高潮在线观看 | 美女主播在线视频| 国精品久久久久久国模美| 亚洲国产成人一精品久久久| 黄色视频不卡| 免费观看a级毛片全部| 一级毛片精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品 国内视频| 男男h啪啪无遮挡| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产麻豆69| 99热全是精品| 色94色欧美一区二区| 美女主播在线视频| 少妇人妻久久综合中文| 午夜成年电影在线免费观看| 国产男女内射视频| 国产激情久久老熟女| 国产成人免费观看mmmm| 成人手机av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品免费久久久久久久清纯 | 夜夜夜夜夜久久久久| av电影中文网址| 精品国产一区二区三区四区第35| 美女大奶头黄色视频| 亚洲综合色网址| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产又色又爽无遮挡免| 久久性视频一级片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 成人手机av| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品av久久久久免费| 午夜免费鲁丝| 美女中出高潮动态图| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一区二区三区激情视频| 精品福利永久在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 淫妇啪啪啪对白视频 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久久精品区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 大码成人一级视频| 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品久久久久成人av| 国产高清videossex| 极品人妻少妇av视频| 极品人妻少妇av视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 人妻久久中文字幕网| bbb黄色大片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 91字幕亚洲| a在线观看视频网站| 一本久久精品| 国产在线免费精品| 天堂8中文在线网| 青春草视频在线免费观看| 99久久国产精品久久久| 国产成人欧美| 制服诱惑二区| 999久久久精品免费观看国产| av网站免费在线观看视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品 欧美亚洲| tube8黄色片| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲熟女毛片儿| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产av国产精品国产| 美女午夜性视频免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 极品人妻少妇av视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产成人精品久久二区二区91| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品av久久久久免费| 亚洲性夜色夜夜综合| 伊人亚洲综合成人网| 欧美精品一区二区大全| 女警被强在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 成人手机av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产淫语在线视频| 久久香蕉激情| 韩国高清视频一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 精品福利观看| 欧美精品一区二区大全| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 成人影院久久| 国产91精品成人一区二区三区 | 老司机亚洲免费影院| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品国内亚洲2022精品成人 | 免费在线观看影片大全网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av超薄肉色丝袜交足视频| 免费日韩欧美在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 丝袜美足系列| 天天添夜夜摸| 一本久久精品| 女性生殖器流出的白浆| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲国产欧美网| 麻豆乱淫一区二区| av免费在线观看网站| 不卡av一区二区三区| 美国免费a级毛片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 三上悠亚av全集在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日本wwww免费看| 一二三四在线观看免费中文在| 女性生殖器流出的白浆| kizo精华| 在线观看免费午夜福利视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲人成77777在线视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久亚洲精品不卡| 亚洲欧洲日产国产| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久亚洲精品不卡| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美中文综合在线视频| 精品人妻在线不人妻| www.精华液| 欧美97在线视频| av网站在线播放免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产亚洲精品一区二区www | 午夜精品国产一区二区电影| 99国产综合亚洲精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲中文字幕日韩| 十八禁网站网址无遮挡| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费在线观看黄色视频的| 精品一区二区三区四区五区乱码| 成人国语在线视频| 一本大道久久a久久精品| 岛国在线观看网站| 黄色 视频免费看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 操出白浆在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲综合色网址| 久久久久久久国产电影| 亚洲av国产av综合av卡| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产成人精品无人区| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 高清欧美精品videossex| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久久精品人妻al黑| 色播在线永久视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 男人爽女人下面视频在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美日韩亚洲高清精品| 免费不卡黄色视频| 亚洲国产看品久久| 伦理电影免费视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 91老司机精品| www.av在线官网国产| 丝袜美足系列| 亚洲国产日韩一区二区| 少妇的丰满在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 视频区欧美日本亚洲| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 黄片大片在线免费观看| 精品少妇久久久久久888优播| 国产一级毛片在线| 天天影视国产精品| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 老鸭窝网址在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 99国产精品一区二区蜜桃av | 波多野结衣一区麻豆| 国产精品1区2区在线观看. | 啦啦啦 在线观看视频| 中文字幕高清在线视频| 国产免费福利视频在线观看| a级毛片黄视频| 国产黄色免费在线视频| 国产高清视频在线播放一区 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | svipshipincom国产片| a级片在线免费高清观看视频| 99热国产这里只有精品6| 狂野欧美激情性xxxx| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 脱女人内裤的视频| 另类亚洲欧美激情| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品国产av蜜桃| 丝袜人妻中文字幕| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品一区二区在线观看99| 免费在线观看日本一区| 国产免费av片在线观看野外av| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精品国产区一区二| a级毛片在线看网站| 五月天丁香电影| 满18在线观看网站| 久久久精品区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日韩电影二区| 黄色a级毛片大全视频| 国产成人精品在线电影| 下体分泌物呈黄色| 成年人黄色毛片网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 成年女人毛片免费观看观看9 | 秋霞在线观看毛片| 最黄视频免费看| 丝袜喷水一区| 久久影院123| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 91国产中文字幕| 一本综合久久免费| 少妇被粗大的猛进出69影院| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 性色av一级| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产精品国产av在线观看| a在线观看视频网站| 精品久久久精品久久久| 亚洲av美国av| 国产精品欧美亚洲77777| 老汉色∧v一级毛片| 久久久久国内视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 国产男女内射视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 日本vs欧美在线观看视频| 91字幕亚洲| 国产成人av教育| 欧美97在线视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 老司机影院毛片| 色老头精品视频在线观看| 中文欧美无线码| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产一区二区激情短视频 | 欧美精品一区二区免费开放| 男女午夜视频在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品.久久久| 成年人午夜在线观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 91成年电影在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 后天国语完整版免费观看| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美大码av| 午夜福利免费观看在线| 手机成人av网站| 一级,二级,三级黄色视频| 久久国产精品影院| 男女边摸边吃奶| 手机成人av网站| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲avbb在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 三级毛片av免费| 亚洲精品国产区一区二| 麻豆av在线久日| a 毛片基地| 成年美女黄网站色视频大全免费| 午夜91福利影院| 色94色欧美一区二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 成年人免费黄色播放视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国产在线免费精品| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲av电影在线进入| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 午夜福利在线观看吧| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品偷伦视频观看了| av超薄肉色丝袜交足视频| 天天操日日干夜夜撸| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久热这里只有精品99| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 色婷婷av一区二区三区视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品久久久久成人av| 亚洲中文av在线| 国产99久久九九免费精品| 国产精品九九99| 91九色精品人成在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 国产在视频线精品| 久久中文字幕一级| 老司机亚洲免费影院| 免费观看av网站的网址| 亚洲欧美一区二区三区久久| 在线永久观看黄色视频| 欧美国产精品一级二级三级| 美女午夜性视频免费| 日本wwww免费看| 在线观看www视频免费| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 正在播放国产对白刺激| 国产主播在线观看一区二区| 桃花免费在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 十分钟在线观看高清视频www| 乱人伦中国视频| 国产成人av教育| 成人av一区二区三区在线看 | 色视频在线一区二区三区| 大陆偷拍与自拍| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品久久蜜臀av无| 亚洲国产日韩一区二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 操美女的视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 麻豆av在线久日| av在线app专区| 青青草视频在线视频观看| 国产成人精品无人区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| av天堂久久9| 亚洲欧美精品自产自拍| 91字幕亚洲| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 91成年电影在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 大码成人一级视频| 视频区欧美日本亚洲| 天堂俺去俺来也www色官网| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产欧美亚洲国产| 色婷婷久久久亚洲欧美| 热99re8久久精品国产| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久久网色| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲精品一二三| 国产精品久久久久成人av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产av一区二区精品久久| 国产在视频线精品| 亚洲人成电影免费在线|