QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚中地西泮及孔雀石綠的殘留量

【摘要】目的：采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定淡水魚中地西泮和孔雀石綠的殘留量。方法：采用QuEChERS前處理技術(shù)，利用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法對目標(biāo)物進(jìn)行測定。結(jié)果：孔雀石綠和地西泮在0.1～2.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率在95.1%～106.7%，檢測限為0.1μg/kg，定量限為0.5μg/kg。結(jié)論：本法靈敏度高，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可同時測定淡水魚中孔雀石綠和地西泮的殘留量。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；淡水魚；地西泮；孔雀石綠

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.003

【基金項(xiàng)目】遼寧省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2022JH2/101300076）：食品安全非靶向篩查及溯源識別關(guān)鍵技術(shù)研究。

Determination of Diazepam and Malachite Green Residues in Freshwater Fish by QuEChERS-HPLC-MS/MS

CHEN Yuwei， ZHOU Ziren， ZHAO Lei， GAO Guanghui*

（Liaoning Inspection Examination and Certification Centre， Shenyang 110036， China）

Abstract： Objective： To determine the residues of diazepam and malachite green in freshwater fish simultaneously by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Methods： The QuEChERS pretreatment technology was used， and the target compounds were determined by HPLC-MS/MS. Results： Malachite green and diazepam showed good linearity in the range of 0.1～2.0 ng/mL， with recoveries ranging from 95.1% to 106.7%， a detection limit of 0.1μg/kg， and a quantification limit of 0.5μg/kg. Conclusion： This method is sensitive， easy to operate， and the results are accurate and reliable. It can be used for the simultaneous determination of malachite green and diazepam residues in freshwater fish.

Keywords： HPLC-MS/MS； freshwater fish； diazepam； malachite green

地西泮（Diazepam，C16H13ClN2O）又名安定[1]，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用，屬于苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑，是獸醫(yī)臨床上用來使動物恢復(fù)平靜，減輕或消除動物狂躁不安的藥物[2-4]。如果人們長期食用地西泮殘留超標(biāo)的水產(chǎn)品，會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到嚴(yán)重干擾。很多國家將地西泮列為在水產(chǎn)動物捕撈以及運(yùn)輸過程中禁止使用的藥物。GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，地西泮僅允許治療使用，但進(jìn)入市場前不得檢出。

孔雀石綠屬于人工合成的三苯甲烷類堿性工業(yè)染料，在水中主要代謝為脂溶性的隱色孔雀石綠?？兹甘G進(jìn)入人類或動物機(jī)體后，通過生物轉(zhuǎn)化還原代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠，其毒性要比孔雀石綠還強(qiáng)，具有高殘留、高毒和致癌、致畸、致突變危害，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[5]?！吨腥A人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號》已將孔雀石綠列為禁用物質(zhì)，規(guī)定在淡水魚中不得qJpPdbiOj3jfmX6T2UYGJQ==檢出。

地西泮的檢測依據(jù)SN/T 3235—2012《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》，孔雀石綠的檢測依據(jù)GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》。本文采用QuEChERS+高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）同時測定地西泮和孔雀石綠，不僅滿足了方法的準(zhǔn)確性，還極大地提高了基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的工作效率。

1材料與方法

1.1儀器、試劑及樣品來源

串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛公司），對照品地西泮、孔雀石綠草酸鹽（純度為98.0%）、隱色孔雀石綠（純度為94.0%）、內(nèi)標(biāo)氘代孔雀石綠（純度為99.4%）和氘代隱色孔雀石綠（純度為98.5%）均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

乙腈、甲酸（Sigma公司）均為色譜純；水為Millipore超純水；其他試劑均為分析純。

本研究采用的樣品為從市場中通過多階段分層隨機(jī)購買的鯽魚、鯉魚、黑魚、草魚等淡水魚，包括活體淡水魚。

1.2溶液制備

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取地西泮、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、d5-孔雀石綠和d5-隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品適量，用乙腈稀釋制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為1.0 ng/mL）。

1.2.2樣品溶液的制備

將魚去頭、鱗、刺后搗碎，稱取已搗碎的樣品5.00 g，置于50 mL離心管中，加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液（500μg/L），精密加入25 mL乙腈，10，000 r/min勻漿提取30 s，加中性氧化鋁3 g，渦旋2 min，3500 r/min離心10 min，取上清液3 mL，加正己烷1 mL，渦旋2 min，3500 r/min離心10 min，棄去正己烷層，取乙腈層用0.2μm濾膜濾過后，作為供試品溶液。

1.3檢測方法

1.3.1色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters C18 column（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2μL，梯度洗脫程序見表1。

離子源：電噴霧正負(fù)離子模式（ESI+），掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；毛細(xì)管壓力：3500 V（Postive Ion），2500 V（Negative Ion）；鞘氣流速：50Arb；輔助氣流速：10Arb；吹掃氣流速：0Arb；離子傳輸管溫度：325℃；脫溶劑溫度：350℃。

1.3.2測定方法

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液各2μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1儀器條件優(yōu)化

首先將0.5μg/mL待測化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以流動注射的方式在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定分子離子，然后對其子離子進(jìn)行全掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，得到孔雀石綠、隱色孔雀石綠和地西泮的最佳質(zhì)譜條件?？兹甘G、隱色孔雀石綠及其內(nèi)標(biāo)、地西泮檢測參數(shù)見表2，色譜圖見圖1至圖6。

2.2方法的線性范圍及檢出限

將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“1.3”的方法進(jìn)行檢測，以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，地西泮、孔雀石綠及其代謝物在0.1～2 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，能夠滿足樣品的定量分析需求。檢出限（以3倍信噪比S/N=3計(jì)）及定量限（以10倍信噪比S/N=10計(jì)）結(jié)果見表3。

2.3回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

以空白基質(zhì)為樣品，在0.5、1、5μg/kg這3個水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測定6個樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。

2.4樣品測定結(jié)果

選取淡水魚中地西泮陽性樣品，進(jìn)行自建方法和國標(biāo)方法比對，精確度符合要求。

2.5結(jié)果分析

本研究建立了一種同時檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠和地西泮殘留量的檢測方法，其線性范圍、檢出限、定量限和加標(biāo)回收率等指標(biāo)均滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的要求。將陽性樣品測定的結(jié)果同標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，相對偏差≤15%，滿足GB/T 27404—2008的精密度要求。同時，本研究所建立的前處理方法也能大大節(jié)約前處理時間。原來采用抽檢細(xì)則指定的方法每天只能提取20批樣品，而采用本研究所建立的前處理方法每天可以處理50批樣品，這極大地提高了檢驗(yàn)人員的工作效率。

3結(jié)束語

通過QuEChERS/HPLC-MS/MS法測定淡水魚中的孔雀石綠和地西泮殘留量。根據(jù)孔雀石綠和地西泮的性質(zhì)，對樣品采用乙腈提取，用中性氧化鋁凈化后，又用正己烷去除脂溶性雜質(zhì)。該方法易于操作，簡便快速。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法的回收率、精密度和準(zhǔn)確度能夠滿足水產(chǎn)品中獸藥殘留分析的要求。

【參考文獻(xiàn)】

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【作者簡介】

陳玉威，女，1978年出生，高級工程師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

通信作者：高廣慧，女，1976年出生，主任藥師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

（編輯：李鈺雙）