川崎病Sema4D/IL6軸介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的研究

【摘要】目的探討信號素4D（Sema4D）/白細(xì)胞介素6（IL6）軸在川崎?。↘D）中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用。方法選取55例急性期KD患兒作為KD組，30例健康兒童作為HC組，ELISA法檢測兩組外周血Sema4D和IL6濃度，流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞表面Sema4D表達(dá)；Sema4D體外刺激內(nèi)皮細(xì)胞并檢測IL6表達(dá)；用內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理中性粒細(xì)胞后檢測Sema4D脫落情況。

結(jié)果與健康兒童比較，急性期KD患兒外周血Sema4D和IL6明顯升高，而Sema4Dhigh中性粒細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與未刺激組比較，Sema4D刺激組的內(nèi)皮細(xì)胞IL6表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與未刺激組相比，Sema4D處理組的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基顯著增加中性粒細(xì)胞Sema4D的脫落（Plt;0.01）。

結(jié)論川崎病冠脈病變過程中可能存在由Sema4D/IL6軸介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞互作方式。

【關(guān)鍵詞】信號素4D；白細(xì)胞介素；川崎??；中性粒細(xì)胞；冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

中圖分類號：R737.11文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2024.11.004

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of semaphorin 4D （Sema4D）/interleukin6 （IL6） axis in interaction between neutrophils and human coronary artery endothelial cells （HCAECs） in Kawasaki disease （KD）.

MethodsA total of 55 patients with acute KD were selected as KD group， and 30 healthy children were selected as HC group. The concentrations of Sema4D and IL6 in peripheral blood of the two groups were detected by ELISA， and the expressions of Sema4D on the surface of neutrophils were detected by flow cytometry; Sema4D was used to stimulate endothelial cells in vitro and the expressions of IL6 were detected; after treating neutrophils with endothelial cellconditioned medium， the shedding of Sema4D was detected.

ResultsCompared with healthy children， Sema4D and IL6 in peripheral blood in the acute phase of KD significantly increased， while the Sema4Dhigh neutrophils significantly decreased， and difference was statistically significant "（Plt;0.05）. Compared with unstimulated group， the expressions of IL6 in endothelial cells stimulated by Sema4D significantly increased， and difference was statistically significant（Plt;0.05）. Compared with unstimulated group， Sema4Dtreated group's endothelial cellconditioned medium significantly increased the shedding of Sema4D in neutrophils （Plt;0.01）.

ConclusionThere may be a Sema4D/IL6 axis mediated interaction between neutrophils and endothelial cells during the process of coronary artery disease in KD.

【Keywords】semaphorin 4D （Sema4D）; interleukin; Kawasaki disease （KD）; neutrophil; coronary artery endothelial cell

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種以冠脈病變（coronary artery lesion，CAL）為特征的兒童急性血管炎癥性疾?。?2］，其發(fā)病機(jī)制不明。信號素4D（Sema4D）是一種免疫信號蛋白，參與多種炎癥性疾病［34］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)KD中過度激活的中性粒細(xì)胞表面Sema4D脫落，導(dǎo)致外周血Sema4D升高，進(jìn)而刺激人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary artery endothelial cell，HCAEC）表達(dá)分泌白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL6）［5］。研究顯示中性粒細(xì)胞和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用在川崎病冠脈病變（KDCAL）過程中起重要作用［6］，但兩種細(xì)胞在KD條件下的相互作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討KD條件下Sema4D/IL6軸介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用機(jī)制。

1資料與方法

1.1臨床資料

本研究納入2023年1月至12月西安市兒童醫(yī)院收治的55例急性期KD患兒和30例健康兒童（為HC組）。KD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國心臟協(xié)會2017年《川崎病的診斷、治療和長期管理》［7］。30例健康兒童的排除標(biāo)準(zhǔn)為：①發(fā)熱者；②合并有其他系統(tǒng)急慢性疾病者；③臨床資料不全者。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：XYLS2022258）。55例KD患兒和30例健康兒童的性別和平均月齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

1.2儀器與試劑

HCAEC（美國SCIENCELL公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；NovoCyte D1040流式細(xì)胞儀（美國ACEA）；血細(xì)胞分析儀（日本Sysmex XN350）；ABI 7500分析儀（美國ABI）；FITC抗人Sema4D抗體，Pacific blueTM抗人CD15抗體，PE抗人Siglec8抗體（美國Biolegend）；重組人源Sema4D（美國Ramp;D）；外周血中性粒細(xì)胞分離試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Sema4D和IL6等ELISA試劑盒（中國Abbkine）；RNeasy mini試劑盒（德國Qiagen）；PrimeScript RT Mix（中國大連Takara）。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集

采集治療前KD患兒及對照兒童空腹靜脈血8 mL，其中2 mL于促凝管離心分離血清，2 mL于EDTAK2抗凝管進(jìn)行血常規(guī)檢查和流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry， FCM），4 mL于肝素抗凝管用于中性粒細(xì)胞分離。

1.3.2HCAEC培養(yǎng)與處理

在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)HCAEC，細(xì)胞融合到70%～80%時(shí)接種到6孔板中。當(dāng)90%融合時(shí)，用含1500 ng/mL重組Sema4D的RPMI1640培養(yǎng)基孵育24小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液待測。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.3.3ELISA檢測

檢測1.3.1收集的血清及1.3.2收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的Sema4D和IL6的濃度。操作按試劑盒說明書進(jìn)行，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測OD值。

1.3.4中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)

采用血細(xì)胞分析儀進(jìn)行外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測1.3.1收集的外周血中性粒細(xì)胞表面Sema4D的表達(dá)。

1.3.5中性粒細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和刺激

使用外周血中性粒細(xì)胞分離試劑盒分離10例健康兒童的中性粒細(xì)胞，經(jīng)瑞氏染色驗(yàn)證細(xì)胞純度gt;95%。分離的中性粒細(xì)胞以1×106/孔的密度接種到24孔板上，用1.3.2收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液孵育2小時(shí)。收集各孔中性粒細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞表面Sema4D。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR

提取HCAEC總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。PCR擴(kuò)增檢測IL6的mRNA表達(dá)。IL6引物：F 5’CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT3’，R 5’CCAGTGCCTCTTTGCTGCTTT3’；GAPDH引物：F 5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3’，R 5’TGGTGAAGACGCCAGTGGA3’。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。KD組和HC組之間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；Sema4D或人血清處理HCAEC與否對白細(xì)胞介素產(chǎn)生的影響采用配對t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1研究對象實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較

KD組較HC組外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，高表達(dá)Sema4D的中性粒細(xì)胞（Sema4Dhigh/CD15+/Siglec8-中性粒細(xì)胞）絕對值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而百分比明顯降低（Plt;0.001）。KD組較HC組血清sSema4D和IL6濃度水平增高（Plt;0.001）。見表1。

2.2Sema4D誘導(dǎo)KDHCAEC對白細(xì)胞介素的影響

用KD患者血清孵育HCAEC 6 h后加入Sema4D刺激24 h，與未加Sema4D刺激相比，上清液IL6含量［（175.70±7.64） pg/mL vs （101.30±6.11） pg/mL，t=14.190，Plt;0.001］和細(xì)胞中IL6 mRNA相對表達(dá)量［（2.03±0.15）vs （0.08±0.07），t=8.171，Plt;0.001］均顯著升高。而在健康對照血清孵育HCAEC的條件下，加入Sema4D刺激與否對IL6分泌［（93.00±2.65）pg/mL vs （89.67±7.23） pg/mL，t=1.250，P=0.338］和mRNA相對表達(dá)量［（0.99±0.09）vs （0.98±0.02），t=1.142，P=0.900］無影響。

2.3KDHCAEC上清液對中性粒細(xì)胞Sema4D脫落的影響

流式細(xì)胞分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HC組相比， KDHCAEC的上清液可使Sema4Dhigh中性粒細(xì)胞百分比由（89.93±5.65）%顯著降低至（57.75±6.32）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.013，Plt;0.001）。

3討論

KD是一種兒童全身性血管炎，冠脈炎癥是發(fā)生CAL的重要原因。目前KD發(fā)病機(jī)制仍不明確，但大量證據(jù)表明血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥在KDCAL的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［8］。內(nèi)皮細(xì)胞炎癥主要是由血管壁微環(huán)境中大量促炎因素導(dǎo)致，這些促炎因素主要來自血液循環(huán)的中性粒細(xì)胞［9］。中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用是導(dǎo)致KD血管炎的重要因素，但二者之間的相互作用機(jī)制研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)KD條件下，中性粒細(xì)胞表面的Sema4D脫落導(dǎo)致血清Sema4D升高；Sema4D能夠進(jìn)一步加重HCAEC的炎癥改變，促使HCAEC產(chǎn)生IL6。本研究結(jié)果表明KD微環(huán)境下可能存在由Sema4D/IL6反饋環(huán)路介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互炎癥放大作用，這可能是KD血管炎的潛在病理機(jī)制之一。

KD急性期表現(xiàn)為外周血中性粒細(xì)胞升高并且過度激活［10］。病理研究顯示KD急性期冠脈病變處中性粒細(xì)胞是出現(xiàn)浸潤最早的免疫細(xì)胞［11］，提示中性粒細(xì)胞是KD血管炎癥早期的始動(dòng)因素。這些在KD早期升高且活化的中性粒細(xì)胞自發(fā)凋亡減弱而促炎能力增強(qiáng)［12］。過度活化的中性粒細(xì)胞浸潤血管壁并釋放多種促炎物質(zhì)，可通過直接或間接的方式作用于血管壁從而導(dǎo)致CAL［13］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)KD患兒中性粒細(xì)胞表面Sema4D表達(dá)減少，說明KD條件下中性粒細(xì)胞活化后Sema4D脫落增加，導(dǎo)致外周循環(huán)Sema4D水平升高；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Sema4D通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合促進(jìn)HCAEC分泌白細(xì)胞介素，證明Sema4D能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥［5］。近年來相關(guān)研究表明Sema4D在多種免疫炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］，且外周血Sema4D濃度與炎癥程度相關(guān)。本研究團(tuán)隊(duì)前期也發(fā)現(xiàn)循環(huán)中Sema4D水平與CRP和KD冠脈病變程度呈正相關(guān)［2］，楊群智等［14］也發(fā)現(xiàn) Sema4D與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情活動(dòng)有關(guān)，這提示Sema4D可作為炎癥標(biāo)志物預(yù)測KDCAL的風(fēng)險(xiǎn)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)是KD冠脈損傷的另一重要特征［15］。通過KD血清刺激內(nèi)皮細(xì)胞體外造模發(fā)現(xiàn)，在KD微環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡增強(qiáng)等諸多功能失調(diào)的表型變化［16］。本研究發(fā)現(xiàn)與健康兒童血清處理組相比，KD血清刺激的HCAEC高表達(dá)IL6，說明KD條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎性改變。LI等［17］研究發(fā)現(xiàn)KD血清IL6水平升高，這與本研究結(jié)果一致。KD條件下IL6的來源還未明確，本研究發(fā)現(xiàn)Sema4D可刺激KDHCAEC高表達(dá)并分泌IL6，說明血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是IL6的來源之一，IL6與KD之間的確切關(guān)系還需要更深入的研究。本研究發(fā)現(xiàn)KDHCAEC上清液含IL6可促使中性粒細(xì)胞活化脫落Sema4D，而采用健康對照血清孵育的HCAEC上清液則無此能力，這表明HCAEC與中性粒細(xì)胞之間存在Sema4D/IL6介導(dǎo)的相互作用。

綜上所述，中性粒細(xì)胞來源的Sema4D促進(jìn)KDHCAEC分泌IL6，HCAEC產(chǎn)生的IL6又可反饋?zhàn)饔糜谥行粤＜?xì)胞?；谶@些結(jié)果，我們認(rèn)為Sema4D/IL6軸在KD血管炎及CAL的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，針對Sema4D的靶向治療可能是KD急性期的潛在靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2024-08-23修回日期：2024-09-29）

（編輯：潘明志）

基金項(xiàng)目：陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202311840077，S202311840070）；西安醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（121523077，121523070）

第一作者簡介：王雪蓉，女，在讀本科生。Email：15091650020@163.com

▲通信作者：黃君華。Email：huangjunhua1985@163.com

［本文引用格式］王雪蓉，張笑，唐欣妮，等.川崎病Sema4D/IL6軸介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的研究［J］.右江醫(yī)學(xué)，2024，52（11）：979982.