大黃素甲醚配施氨基寡糖素對煙草病毒病抑制效果研究

摘要：新型植物源殺菌劑大黃素甲醚（Physcion）是一種從中藥植物大黃中提取的天然蒽醌類化合物，對多種植物病原真菌具有活性。為進(jìn)一步提升其應(yīng)用效果，本文將大黃素甲醚與氨基寡糖素配合施用，評估其對煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）的抑制率及室內(nèi)防治效果。結(jié)果表明，在大黃素甲醚濃度為0.08 mg/mL和0.1 mg/mL，與氨基寡糖素配施后，對PVY的抑制作用均優(yōu)于單劑，表現(xiàn)出顯著的增效效果；其中0.1 mg/mL大黃素甲醚與0.5 mg/mL氨基寡糖素配合施用時，PVY的抑制率最高，達(dá)到84.78%；此外，盆栽防治試驗(yàn)也表明，0.1 mg/mL大黃素甲醚與0.5 mg/mL氨基寡糖素的配施效果最佳，防治效果為77.81%。綜合來看，大黃素甲醚配施氨基寡糖素對煙草病毒病的抑制具有顯著的增效效果，為大黃素甲醚的廣泛應(yīng)用提供了條件。

關(guān)鍵詞：大黃素甲醚；氨基寡糖素；煙草病毒?。环佬?/p>

中圖分類號：S435.72 文獻(xiàn)識別碼：A 文獻(xiàn)編號：1005-6114（2024）06-033-03

植物病毒病是僅次于植物真菌病害的第二大類病害，具有種類多、寄主廣、危害大、防治難等特點(diǎn)［1］。農(nóng)作物感染病毒病后會導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重下降，對人類糧食安全構(gòu)成極大的威脅［2］。這些年，由于氣候變暖、種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整使得病毒病的在我國呈現(xiàn)大發(fā)和重發(fā)的態(tài)勢，而病毒病一旦發(fā)生，具有突發(fā)性、暴發(fā)性和重發(fā)性，對糧食生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品供應(yīng)安全產(chǎn)生嚴(yán)重影響［3］。

抗病品種和農(nóng)業(yè)措施是目前生產(chǎn)中防控植物病毒病的重要和有效手段，但由于目前能抵抗病毒病的抗性品種匱乏，抗病品種應(yīng)用不夠廣泛。因此，抗病毒藥劑在植物病毒病防控中發(fā)揮著重要作用［4，5］。當(dāng)前市場上植物病毒病防控藥劑有：鹽酸嗎啉胍、氨基寡糖素、毒氟磷、辛菌胺等少量抗病毒劑產(chǎn)品，登記的抗病毒劑產(chǎn)品在所有農(nóng)藥登記產(chǎn)品中占比低于0.5％［6］，單一施用某一種藥劑防治效果低，防治譜比較窄，因此，開發(fā)高效、廣譜、綠色的植物抗病毒病藥劑在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中具有重要意義。

新型植物源殺菌劑大黃素甲醚是從中藥植物大黃中提取的天然蒽醌類化合物，對小麥白粉病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病和番茄病毒病等多種真菌和病毒病具有高效活性［7］。氨基寡糖素（殼寡糖）是指D-氨基葡萄糖以β-1.4糖苷鍵連接的低聚糖，由幾丁質(zhì)降解得殼聚糖后再降解制得，對多種真菌、細(xì)菌和病毒具有預(yù)防、抑制和滅殺作用［8］。為了提升大黃素甲醚產(chǎn)品的應(yīng)用范圍和防治效果，本研究旨在利用氨基寡糖素增強(qiáng)煙草的抵抗力，同時以大黃素甲醚的殺菌作用，兩者的協(xié)同作用為煙草病毒病的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑98％大黃素甲醚原藥購買自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，90％氨基寡糖素原藥購買自鐘祥一品紅植物免疫科技有限公司。兩種藥劑均采用二甲基亞砜溶解，配制母液濃度為1 000 mg/L，將母液稀釋成試驗(yàn)所需濃度，大黃素甲醚濃度為0.06、0.08和0.1 mg/L，氨基寡糖素濃度為0.125和0.5 mg/L。

供試植物為本氏煙Nicotiana benthamiana。挑選大小、長勢一致、無病無蟲的４～８葉齡幼苗用于試驗(yàn)。帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因的馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所提供。其他試劑和儀器主要有：石英粉（過600目篩）、碳酸鹽緩沖溶液（CBS，pH值9.6）、馬鈴薯Y病毒酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海源桔生物科技有限公司）、酶標(biāo)分析儀（美國伯騰儀器有限公司）、365 nm長波紫外燈（美國SPECTROLINE）、研磨器等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 藥劑處理

試驗(yàn)在溫度25℃，相對濕度50％～60％，光照6 000～7 000 Lx的人工氣候室中進(jìn)行。藥劑用水稀釋后均勻噴施于長勢均勻的煙草植株葉片正面，設(shè)噴施清水為對照（CK），每7 d噴施1次，共噴霧2次。試驗(yàn)設(shè)14個處理（具體見表１），每處理噴施6株，即6個重復(fù)。

1.2.2 摩擦接種

病毒接種試驗(yàn)在第2次噴施藥劑后2 h進(jìn)行，首先在煙草未完全展開幼葉下方的3片展開葉正面均勻撒少許石英粉，采用摩擦接種的方式每葉接種50μL含PVY的病毒汁液，每處理接種6株，即６個重復(fù)，接種后將植株放于人工氣候室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，5 d后在長波紫外光下觀察接種煙草發(fā)病情況，取每株發(fā)病的幼葉，用錫箔紙包裹并寫好編號，于液氮速凍后保存于-80℃冰箱中待用。

1.2.3 ELISA檢測病毒含量，計(jì)算病毒抑制率

樣品采集，在接種病毒后5 d取樣，選擇已經(jīng)發(fā)病的葉片取樣，按每0.1 g（葉片重量）∶加入1 mL（碳酸鹽緩沖溶液）的比例進(jìn)行研磨，研磨液吸進(jìn)離心管中，5 000 rpm離心2 min，取上清液于干凈的離心管內(nèi)，按照馬鈴薯Y病毒酶聯(lián)免疫分析試劑盒的操作步驟測定樣品中馬鈴薯Y病毒含量，以450 nm波長處的OD值表示。參照馬志強(qiáng)等的方法［9］，按照病毒抑制率公式各處理對病毒的抑制率。

病毒抑制率（%）＝（對照組OD450-處理組OD450）／對照組OD450×100

1.2.4 植株癥狀記錄和防效計(jì)算

病毒接種10 d后觀察植株癥狀，并記錄每株上部5或6張葉片的發(fā)病程度，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，計(jì)算防效。具體方法參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則第73部分：殺菌劑防治煙草病毒病》（NYT 1464.73—2018）進(jìn)行級標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級：無花葉病斑；

1級：病斑面積占整片葉面積的5％以下；

3級：病斑面積占整片葉面積的5～15％；

5級：病斑面積占整片葉面積的15～25％；

7級：病斑面積占整片葉面積的25～50％；

9級：病斑面積占整片葉面積的50％以上。

病情指數(shù)和病指防效計(jì)算公式：

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2019軟件統(tǒng)計(jì)，采用DPS9.01數(shù)據(jù)分析軟件中Duncans新復(fù)極差法對病毒抑制率進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒濃度及病毒抑制率

藥劑處理組煙草葉片中病毒的濃度均顯著低于對照，其中病毒濃度最低的為大黃素甲醚0.1 mg/L配施氨基寡糖素0.5 mg/L組合，其次為大黃素甲醚0.08 mg/L配施氨基寡糖素組合處理。單獨(dú)施用兩種藥劑均對PVY具有一定的抑制效果，大黃素甲醚處理優(yōu)于氨基寡糖素處理。大黃素甲醚與氨基寡糖素配施均能較好地抑制PVY，其中大黃素甲醚0.1 mg/L配施氨基寡糖素0.5 mg/L處理對病毒抑制率最高，為84.78％。大黃素甲醚配施氨基寡糖素具有較明顯的增效作用，對病毒的抑制作用比大黃素甲醚單用增加53.85％（表2）。

2.2 對PVY病毒盆栽防效

根據(jù)表3不同組煙草植株的病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果，施藥處理組病情指數(shù)均有所下降，說明所有藥劑處理均能抑制煙草馬鈴薯Y病毒病情指數(shù)。對照處理的煙草葉片發(fā)病最嚴(yán)重，病情指數(shù)89.26。大黃素甲醚0.1 mg/L和0.06 mg/L處理組病指防效分別為36.15%和49.39%，氨基寡糖素0.5mg/L和0.125mg/L處理組病指防效為27.34%和35.97%；而不同濃度的大黃素甲醚和氨基寡糖素配施時，植株的病毒病癥狀顯著減輕，對PVY的病指防效顯著提升：大黃素甲醚0.1 mg/L 配施氨基寡糖素不同處理組合防效較好，各處理均在70％以上，表現(xiàn)出協(xié)同增效作用，其中大黃素甲醚0.1 mg/L配施氨基寡糖素0.5 mg/L處理防效最高，為77.81％，協(xié)同增效作用最顯著。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素甲醚和氨基寡糖素對煙草馬鈴薯Y病毒都具有一定的抑制效果，兩種藥劑單獨(dú)施用對病毒的防效在27.34%～49.39%之間，這與兩種藥劑在番茄和煙草病毒病上田間研究結(jié)果相似［10，11］；當(dāng)大黃素甲醚和氨基寡糖素配合施用時，對煙草PVY病毒具有協(xié)同增效作用；0.1 mg/L大黃素甲醚配施0.5 mg/L氨基寡糖素抗馬鈴薯Y病毒效果最好，防治效果達(dá)到77.81%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兩個單劑的防治效果。這可能與大黃素甲醚自身具有一定的殺菌活性，抑制了病毒在煙草內(nèi)的復(fù)制［8］，而氨基寡糖素可能是通過誘導(dǎo)煙草表皮產(chǎn)生一些抗病信號分子，提高植物自身的免疫力，進(jìn)而增強(qiáng)了對病毒的抵抗能力［12］，因此兩者配合施用具有增效作用，具體原因還有待進(jìn)一步研究。此外，本試驗(yàn)僅進(jìn)行了室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，還需要大田試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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