菟絲子對(duì)敵百蟲損傷小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的緩解作用

摘要：為探討菟絲子對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敵百蟲下調(diào)小鼠睪丸膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450scc蛋白表達(dá)是否具有緩解作用，本試驗(yàn)將30只8周齡Balb/C雄性小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組，敵百蟲組，菟絲子組，敵百蟲加低、中、高濃度菟絲子組；連續(xù)灌胃10 d后，取睪丸組織，用蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組織化學(xué)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)敵百蟲與菟絲子對(duì)小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)和P450scc表達(dá)與定位的影響。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，敵百蟲組生精細(xì)胞排列混亂，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，睪酮合成相關(guān)酶P450scc的免疫組化陽性表達(dá)減弱（P<0.05），P450scc蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P<0.0001）。菟絲子組比對(duì)照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多；P450scc陽性表達(dá)增強(qiáng)（P<0.0001）；P450scc的蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P<0.0001）。與敵百蟲組相比，敵百蟲加低、中、高濃度菟絲子組睪丸的

組織形態(tài)逐漸趨于對(duì)照組；且P450scc的陽性表達(dá)也逐漸增強(qiáng)（P<0.01，P<0.0001，P<0.0001）；蛋白表達(dá)水平也均被提高（P<0.0001）。說明菟絲子可緩解敵百蟲導(dǎo)致的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的損傷以及睪酮合成相關(guān)酶P450scc表達(dá)的下調(diào)。

關(guān)鍵詞：菟絲子；敵百蟲；P450scc；睪丸間質(zhì)；雄性生殖毒性

水果和蔬菜上有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留被認(rèn)為是導(dǎo)致男性因精子質(zhì)量降低不育的因素之一[1-2]。其中敵百蟲（Trichlorfon，TCF）被廣泛用于防治農(nóng)作物、環(huán)境害蟲及家畜體內(nèi)外寄生蟲，是獸醫(yī)中較為常用的有機(jī)磷農(nóng)藥[3]。先前的研究表明，有機(jī)磷農(nóng)藥損傷雄性生殖可能是損傷了睪丸間質(zhì)細(xì)胞，從而導(dǎo)致睪酮合成

障礙[4-5]。睪酮的合成起始于從膽固醇的側(cè)鏈上切除6個(gè)碳生成孕烯醇酮，該反應(yīng)由細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（Cytochrome P450 Cholesterol Side Chain Lyase，P450scc，又稱 CYP11A1）催化[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，敵百蟲會(huì)顯著抑制P450scc蛋白的表達(dá)[8]，P450scc蛋白表達(dá)下降會(huì)使膽固醇的催化與轉(zhuǎn)運(yùn)減少，進(jìn)而導(dǎo)致睪酮合成減少[9]。

菟絲子（Semen Cuscutae）是一種傳統(tǒng)中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菟絲子總黃酮對(duì)生殖系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是通過影響下丘腦-垂體-性腺軸而發(fā)揮作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)口服含有菟絲子的處方藥可以顯著增加精子數(shù)量和活力[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)睪酮水平低于機(jī)體正常水平時(shí)，菟絲子總黃酮會(huì)促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生睪酮[12]。

本試驗(yàn)通過研究敵百蟲和菟絲子對(duì)雄性小鼠睪丸組織病理學(xué)變化和P450scc蛋白的表達(dá)量的影響，揭示敵百蟲和菟絲子對(duì)雄性生殖性能的作用機(jī)制，為敵百蟲對(duì)人和動(dòng)物所造成的生殖損傷提供新的理論保障。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康8周齡Balb/C雄性小鼠30只，體重為22～27 g，購(gòu)自山西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。

1.2 藥品

菟絲子購(gòu)自北京同仁堂健康藥業(yè)電子商務(wù)有限公司。敵百蟲購(gòu)自南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司。

1.3 主要試劑

蘇木精購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。免疫組化試劑盒與DBA顯色液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。兔多克隆抗CYP11A1抗體與Goat Anti-Rabbit IgG均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。β-actin購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.4 主要儀器

生物組織包埋機(jī)與生物組織包埋機(jī)冷凍臺(tái)（型號(hào)：YD-6 L智能型），浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)。切片機(jī)、攤片機(jī)和烤片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。熒光倒置顯微鏡，德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)。

2 方法

2.1 菟絲子水提液的制備

稱取菟絲子25 g，用蒸餾水清洗3次，然后用350 mL蒸餾水浸泡菟絲子30 min；之后大火加熱至沸騰后轉(zhuǎn)為小火再加熱30 min，用紗布過濾留上清液；濾渣加150 mL蒸餾水，再次用大火加熱至沸騰后轉(zhuǎn)為小火加熱30 min，過濾留上清液；合并2次上清液濃縮至100 mL（生藥濃度為250 mg·kg-1）[13]。

2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

將30只雄鼠置于塑料籠內(nèi)并保持在標(biāo)準(zhǔn)條件下（光照與黑暗進(jìn)行12h循環(huán)；（25±3）℃；35%～60%相對(duì)濕度），并供給維持飼料和水；適應(yīng)5 d后隨機(jī)的均分為6組，分別為對(duì)照組，敵百蟲組（1/10 LD50，45 mg·kg-1），菟絲子組（1 800 mg·kg-1），菟絲子低（900 mg·kg-1）、中（1 800 mg·kg-1）、高（3 600 mg·kg-1）劑量治療組。給小鼠經(jīng)口連續(xù)灌胃10 d，于每日上午9∶00進(jìn)行。對(duì)照組每日按體重給予等量的生理鹽水，敵百蟲加菟絲子組先給小鼠灌服敵百蟲（1/10 LD50，45 mg·kg-1），1h后灌服相應(yīng)劑量的菟絲子水提液。

10 d后，二氧化碳安樂死小鼠，取小鼠睪丸組織，部分置于Bouin's固定液中，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。部分置于液氮中，用于檢測(cè)P450scc蛋白的表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)P450scc在小鼠睪丸中的表達(dá)和定位。

2.3 睪丸組織病理學(xué)觀察

將睪丸在Bouin's固定液中固定24 h。然后將睪丸脫水透明，浸入石蠟中并制成6μm厚的切片。睪丸石蠟切片用蘇木精-伊紅（HE）染色溶液染色，并在顯微鏡下觀察并分析組織學(xué)變化。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)睪丸組織P450scc表達(dá)

將制備好的6μm睪丸石蠟切片脫蠟，梯度酒精復(fù)水。隨后切片在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（98℃）中浸泡15 min左右。使用免疫組化試劑盒提供的試劑進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，先將切片置于3%H2O2溶液中30 min左右；之后加封閉液，放入烘箱30 min滴加5%牛血清白蛋白稀釋的一抗（P450scc，1∶100）50μL，陰性用PBS代替，4℃孵育14 h；孵育完后滴加鏈霉菌抗生素，烘箱30 min；最后滴加DAB顯色液顯色。

2.5 Western Blot檢測(cè)P450scc蛋白表達(dá)水平

用含有10μL PMSF的RIPA裂解緩沖液在高通量組織研磨儀中研磨小鼠睪丸5 min（RIPA∶PMSF=

100∶1）。在4℃，11 400 r/min下離心10 min，取上清液；用蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）測(cè)定蛋白濃度。加入200μg的蛋白與5×Loading buffer 混勻，用1%SDS調(diào)整濃度，沸水浴10 min變性。通過SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上，在室溫下用TBST配置的5%的脫脂牛奶封閉2h。之后，將NC膜分別在P450scc（1∶500）、β-actin（1∶2 000）的一抗中孵育，在4℃孵育14h后，用TBST洗滌NC膜，然后放入山羊抗兔IgG（1 000∶2）中孵育2 h。最后將NC膜曝光顯色。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有計(jì)算均使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 8.0進(jìn)行。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和t檢驗(yàn)確定多組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，試驗(yàn)數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（n=3）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。

3 結(jié)果

3.1 菟絲子對(duì)敵百蟲致小鼠睪丸組織病理學(xué)變化的影響

如圖1，對(duì)照組小鼠睪丸的組織結(jié)構(gòu)正常，曲精小管中支持細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞均排列有序，結(jié)構(gòu)清晰，管腔內(nèi)充滿精子，間質(zhì)細(xì)胞均勻地分布在基膜外（圖1A）。敵百蟲組生精細(xì)胞排列紊亂、脫落，生精細(xì)胞變性，個(gè)別曲精小管管腔中可見脫落的生精細(xì)胞，管腔內(nèi)成熟精子變少。間質(zhì)細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少（圖1B）。菟絲子組各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊緊密，且間質(zhì)細(xì)胞明顯增多（圖1C）。與敵百蟲組的組織形態(tài)相比，敵百蟲加低（圖1D）、中（圖1E）、高（圖1F）濃度菟絲子組睪丸組織形態(tài)逐漸趨于對(duì)照組。

3.2 菟絲子對(duì)敵百蟲致小鼠睪丸組織P450scc陽性表達(dá)的影響

如圖2，免疫組織化學(xué)結(jié)果表明P450scc主要在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。與對(duì)照組相比，P450scc表達(dá)水平在敵百蟲組顯著降低（P<0.01），在菟絲子組明顯上升（P<0.05）。與敵百蟲組相比，敵百蟲加低濃度菟絲子組的表達(dá)明顯升高（P<0.01），中、高濃度菟絲子組的表達(dá)極顯著升高（P<0.0001）。

3.3 菟絲子對(duì)敵百蟲致小鼠睪丸組織P450scc蛋白表達(dá)的影響

如圖3，通過WB檢測(cè)P450scc的蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，敵百蟲組蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.0001），菟絲子組蛋白的表達(dá)顯著上升（P<0.0001）。與敵百蟲組相比，敵百蟲加低、中、高濃度菟絲子組蛋白的表達(dá)顯著升高（P<0.0001）。

4 討論

不孕不育癥影響了全球約15%的育齡夫婦，其中約半數(shù)是由男性因素造成的[14]。精子濃度和活力低被認(rèn)為是男性不育的主要原因之一[15]，而有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)引起精子濃度及質(zhì)量下降[16]，因此有機(jī)磷農(nóng)藥引起的生殖毒性一直受到研究人員的密切關(guān)注。睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要功能為合成睪酮，睪酮具有維持生精的作用。男性生殖的健康與正常的精子發(fā)生與睪酮等類固醇激素密切相關(guān)[17-18]。為了進(jìn)一步研究菟絲子緩解敵百蟲暴露小鼠生殖損傷的機(jī)制，本研究重點(diǎn)關(guān)注了睪酮生成相關(guān)酶P450scc，P450scc的表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致膽固醇的催化和轉(zhuǎn)運(yùn)減少，從而使類固醇激素合成受阻。

有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠暴露于敵百蟲后可使睪丸組織的生精細(xì)胞數(shù)量減少曲精小管受損[19]，在本研究中45 mg·kg-1（1/10 LD50）敵百蟲也會(huì)引起生精細(xì)胞變性和排列混亂。先前的研究表明，敵百蟲暴露后，膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450scc的mRNA及蛋白表達(dá)降低[3]，從而導(dǎo)致睪酮合成障礙，這與本研究結(jié)果一致，提示45 mg·kg-1（1/10 LD50）敵百蟲對(duì)睪酮合成途徑中的酶有一定的抑制作用。

菟絲子可以促進(jìn)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)1 800 mg·kg-1菟絲子會(huì)使間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，還可以提高P450scc蛋白的表達(dá)。由此可推測(cè)，菟絲子對(duì)正常小鼠的生殖也有促進(jìn)作用，可能是通過提升P450scc對(duì)膽固醇的催化作用而使睪酮含量升高。

本研究觀察到使用菟絲子（1 800 mg·kg-1、3 600 mg·kg-1）對(duì)敵百蟲（45 mg·kg-1）導(dǎo)致的睪丸結(jié)構(gòu)損傷有明顯的緩解作用，生精細(xì)胞排列趨于緊密，表明菟絲子可以改善敵百蟲引起的睪丸組織結(jié)構(gòu)的病理損傷。暴露于45 mg·kg-1敵百蟲的小鼠睪丸P450scc蛋白表達(dá)水平在補(bǔ)充菟絲子后顯著升高，3 600 mg·kg-1菟絲子緩解作用最為明顯。據(jù)此推測(cè)，敵百蟲通過損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞，抑制膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450scc蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致睪酮合成障礙，使精子密度降低；補(bǔ)充1 800 mg·kg-1和3 600 mg·kg-1的菟絲子可以有效緩解敵百蟲對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷和對(duì)P450scc蛋白表達(dá)下降的影響。

綜上，敵百蟲破壞了小鼠睪丸的正常組織結(jié)構(gòu)，下調(diào)了類固醇合成相關(guān)酶P450scc的表達(dá)水平；菟絲子能夠使睪丸間質(zhì)細(xì)胞增多，上調(diào)P450scc表達(dá)水平；菟絲子可以緩解敵百蟲引起的睪丸病理變化，并上調(diào)P450scc表達(dá)水平，其中，3 600 mg·kg-1的作用較好。這提示菟絲子和敵百蟲可能均是通過影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞和P450scc而對(duì)睪酮合成產(chǎn)生影響。

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