“陜西主料”煙葉優(yōu)勢菌群鑒定及微生物發(fā)酵煙葉技術(shù)研究

摘 要：以“陜西主料”煙葉為材料，檢測煙葉自帶菌群的種類及數(shù)量，分別使用單一菌和復(fù)配菌對片煙進行發(fā)酵處理，結(jié)合評吸結(jié)果，探究微生物發(fā)酵對卷煙品質(zhì)的改善作用。結(jié)果表明，“陜西主料”煙葉中優(yōu)勢菌類群為細菌，真菌次之，未分離到酵母菌和放線菌；細菌主要為芽孢桿菌。分離得到的5號菌株有較強的淀粉水解能力。微生物發(fā)酵后煙葉的總糖和淀粉含量隨發(fā)酵時間呈現(xiàn)出下降趨勢，總氮和還原糖呈現(xiàn)出先降低后增加的變化趨勢。芽孢桿菌發(fā)酵可改變煙葉中的一些組分，改善各組分不同的比例，對卷煙具有增香提質(zhì)的作用。

關(guān)鍵詞：陜西主料煙葉；微生物發(fā)酵；煙葉；增香提質(zhì)

中圖分類號：S572" 文獻標識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）10-0032-07

收稿日期：2023-11-22 修回日期：2024-01-04

第一作者簡介：高明博（1986-），男，碩士，農(nóng)藝師，主要從事煙葉生產(chǎn)栽培及技術(shù)推廣工作。

通信作者：胡穎梅。

Identification of Dominant Microflora on Tobacco Leaves in

'Shaanxi Main Materials' and Research on Microbial Fermentation "Techniques for Tobacco Leaves

GAO Mingbo1， HU Yingmei1， QIN Mingqian2， YANG Baowei2

（1.Shaanxi Provincial Company of China National Tobacco Company， Xi’an， Shaanxi 710061， China;

2.Zhangjiakou Center for Disease Prevention and Control， Zhangjiakou， Hebei 075000， China;

3.College of Food Science and Engineering， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi 712100， China）

Abstract：" In this study， the type and quantities of the native microflora present on 'Shaanxi main materials' tobacco leaves were investigated. The effects of both single bacterial strains and mixed bacterial cultures on the fermentation of tobacco were evaluated， alongside sensory assessment results， to explore how microbial fermentation can enhance cigarette quality. The results showed that the dominant microbial group was bacteria， followed by fungi， while yeast and actinomycetes were not isolated. Bacillus was the main bacterium. The isolated strain No. 5 had a strong starch hydrolysis ability. After microbial fermentation， the total sugar and starch content of tobacco leaves decreased with fermentation time， while the total nitrogen and reducing sugar decreased initially and then increased. Bacillus fermentation can change some components in tobacco leaves， improve the different proportions of each component， and enhance the flavor and quality of cigarettes.

Key words：Shaanxi main material tobacco; Microbial fermentation; Tobacco; Aroma and quality enhancement

品質(zhì)優(yōu)良的煙葉表面攜帶大量的微生物，在煙葉陳化或發(fā)酵過程，這些微生物會作用于煙葉，能夠改善其色澤和香氣，有效降低刺激性，對提高煙葉的品質(zhì)和經(jīng)濟價值有著重要作用[1]。煙葉發(fā)酵可分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵2種形式[2]。研究表明，人工發(fā)酵能夠在可控條件下轉(zhuǎn)化煙葉中淀粉和果膠等大分子物質(zhì)，提高卷煙香氣量、煙氣濃度和細膩感等吸食品質(zhì)，大大縮短發(fā)酵時間。但是，目前仍存在人工發(fā)酵后煙葉品質(zhì)的改善效果不如自然發(fā)酵好的問題[3]。因此，篩選適于煙葉發(fā)酵的微生物、優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)、改善人工發(fā)酵過程成為煙草行業(yè)的一個研究熱點[4]。

本研究對“陜西主料”煙草攜帶的微生物菌群種類和數(shù)量進行檢測，篩選鑒定優(yōu)勢菌株。采用單一和復(fù)配菌作為菌種對“陜西主料”片煙進行發(fā)酵處理，以期改善陜西主料煙香氣物質(zhì)及組成結(jié)構(gòu)，提高陜西烤煙工業(yè)適配性，拓展烤煙應(yīng)用范圍，為陜西烤煙發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 煙葉 陜西主料片煙SXZL和成品片煙（陜西商洛C3FTY99、陜西商洛C3FTY87、SXZL、SXTW）由咸陽煙葉復(fù)烤有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 菌株 5號芽孢菌SXYY從陜西主料煙葉上分離得到；短小芽孢桿菌A（%Bacillus pumilus %van35）、解淀粉芽孢桿菌B（%Bacillus amyloliquefaciens%）和高地芽孢桿菌C（%Bacillus altitudinis%）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基等均購自北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司。

1.1.4 儀器和設(shè)備 超凈工作臺（SW-CJ-1CU；蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司），高壓滅菌鍋（ES-315；日本Tomy公司），百分之一天平（XS204；梅特勒），恒溫搖床（上海智成分析儀器制造有限公司），濁度儀（法國梅里埃），超純水處理器（美國Millipor公司），－80 ℃低溫冰箱（日本Sanyo公司），移液器、高速離心機（德國Eppendorf公司），Mycycler PCR 儀、DNA電泳、凝膠成像系統(tǒng) （美國Bio-Rad公司），恒溫水浴儀（寧波賽福實驗儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 微生物分離、計數(shù)和保藏 樣品處理：將10 g煙葉加入90 mL無菌水，150 r/min震蕩15 min，得到10-1梯度稀釋液。10倍系列稀釋后分別得到10-2和10-3梯度稀釋液，備用。

細菌分離：吸取100 μL不同濃度的稀釋液，滴加至LB培養(yǎng)基，涂布均勻后在28 ℃培養(yǎng)。每個梯度設(shè)2個重復(fù)，使用無菌水作為對照。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選菌落數(shù)適宜的培養(yǎng)基進行計數(shù)，得到煙葉攜帶的細菌種類及數(shù)量。

真菌分離：吸取100 μL不同濃度的稀釋液，滴加至PDA和孟加拉紅培養(yǎng)基，涂布均勻后在28 ℃培養(yǎng)。每個梯度設(shè)2個重復(fù)，使用無菌水作為對照。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選菌落數(shù)適宜的培養(yǎng)基進行計數(shù)，得到煙葉攜帶的真菌種類及數(shù)量。

放線菌分離：吸取100 μL不同濃度的稀釋液，滴加至高氏一號培養(yǎng)基，涂布均勻后在28 ℃培養(yǎng)。每個梯度設(shè)2個重復(fù)，使用無菌水作為對照。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選菌落數(shù)適宜的培養(yǎng)基進行計數(shù)，得到煙葉攜帶的放線菌種類及數(shù)量。細菌采用甘油/LB肉湯、真菌使用甘油/生理鹽水保存于-80 ℃冰箱，備用。

乳酸菌分離：吸取100 μL不同濃度的稀釋液，滴加至MRS培養(yǎng)基，涂布均勻后在28 ℃培養(yǎng)。每個梯度設(shè)2個重復(fù)，使用無菌水作為對照。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選菌落數(shù)適宜的培養(yǎng)基進行計數(shù)，得到煙葉攜帶的乳酸菌種類及數(shù)量。

細菌采用甘油/LB肉湯、真菌使用甘油/生理鹽水保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.2.2 細菌的鑒定 本研究只對分離得到的細菌進行鑒定。采用煮沸結(jié)合離心法提取總DNA，以其為模板；使用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增[5]。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至測序公司測序。測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行同源基因搜索（BLAST Search），將搜索所得序列與已知序列進行比對，使用MEGA6.0、采用Neighbor-Joining法進行1 000 次Bootstrap檢驗后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定“陜西主料”煙葉上細菌的種屬。

擴增用正向引物-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物-R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT -3’。擴增條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 擴增片段為1 500 bp。

1.2.3 細菌菌液濃度確定 將保存在-80 ℃的菌株劃線接種到LB瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～20 h后，取1～2個單菌落，接種至100 mL LB肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)18～20 h；將得到的菌液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，加入無菌去離子水重懸；使用濁度儀調(diào)整菌液OD-600值在0.48～0.52，備用。

1.2.4 淀粉水解試驗 向LB瓊脂培養(yǎng)基中補加0.5%（g/V）的可溶性淀粉，點接種純化后的細菌，28 ℃培養(yǎng)48 h后，向培養(yǎng)基上滴加100 μL碘液染色，觀察菌落周圍是否有透明圈。用透明圈的相對大小表示淀粉水解能力的大小。

1.2.5 芽孢菌劑厭氧條件陜西主料煙發(fā)酵試驗 由于沒有對研究中分離得到的細菌進行安全性評價，因此沒有使用分離株進行煙葉發(fā)酵研究。本研究使用目前報道的對煙葉增香、品質(zhì)改善效果較好的短小芽孢桿菌（%Bacillus pumilus %van35）、解淀粉芽孢桿菌（%Bacillus %amyloliquefaciens）和高地芽孢桿菌（%Bacillus %altitudinis）作為菌劑，分別采用單一菌種和復(fù)配菌劑對“陜西主料”片煙進行發(fā)酵，試驗設(shè)計具體信息見表1。復(fù)配菌劑由OD值（濃度約為：×108 CFU/mL）相同的單一菌劑按1∶1（v∶v）配制而成。將菌劑和煙葉按照1∶4（mL∶g）的比例無菌條件下進行霧化接種。將接種后的片煙裝入無菌的鋁箔袋，抽真空后封口，室溫下自然發(fā)酵，分別在0 d、7 d、15 d、45 d取樣。取樣后一部分煙葉在40 ℃烘干，用于化學(xué)指標測定；另一部分在80 ℃烘干，用于評吸試驗。

1.2.6 片煙化學(xué)成分測定 將處理后的樣品送至送陜西太陽景檢測有限公司，分別測定未發(fā)酵和不同發(fā)酵時期片煙中總糖、還原糖、總氮和淀粉含量?？偺呛恳罁?jù)《YC/T 159-2002》、采用連續(xù)流動法進

行測定[6]，還原糖含量采用 3，5-二硝基水楊酸比色法[7]測定，淀粉含量采用GB 5009.9第一法酶解法[8]測定，總氮含量采用靛酚藍分光光度法[9]測定。

1.2.7 評吸試驗

（1）煙支卷制 將煙絲置于38 ℃下干燥去濕，調(diào)節(jié)煙絲含水率至12%左右，然后采用相同規(guī)格的卷煙紙和濾棒進行手工卷制。評吸前置于相對濕度為60%、溫度為22℃下平衡48 h，方可進行感官評吸。

（2）評吸方法 由陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心7人組成評吸小組進行綜合評價，按照GB5606.4-2005[10]評吸質(zhì)量指標和評分標準對發(fā)酵前、后的煙葉進行評吸，按照香氣質(zhì)、香氣量、濃度、勁頭、雜氣、刺激性和余味等指標進行感官評價，確定較好的發(fā)酵菌劑和相應(yīng)的發(fā)酵時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物分離結(jié)果

“陜西主料”煙葉中優(yōu)勢菌主要為細菌，其次為真菌，未分離到酵母菌和放線菌。將菌落特征高度相似的菌株分為一類，選取不同種類的非乳酸菌類細菌和霉菌，對其進一步的純化、保藏。3次分離檢測結(jié)果表明陜西主料煙葉上微生物類群及組成比例為非乳酸菌類細菌：乳酸菌：真菌（PDA培養(yǎng)基分離）：真菌（孟加拉紅培養(yǎng)基分離）=74.2∶28.4∶21.3∶2.1（表2）。共分離得到4株產(chǎn)芽孢細菌，5株真菌。

2.2 細菌鑒定結(jié)果

芽孢桿菌多產(chǎn)生淀粉酶，煙葉中的淀粉被適量水解后可以減輕不愉快的焦糊味。因此，本試驗只針對芽孢桿菌進行研究。以NCBI登陸號為BD224045.1的沙門氏菌作為外參菌，以登錄號為MN960344的芽孢桿菌作為內(nèi)參菌，構(gòu)建的分子進化樹（圖1）。分離到的4株細菌均可鑒定為芽孢桿菌。

2.3 芽孢桿菌淀粉水解試驗

培養(yǎng)、染色結(jié)束后，如菌落周圍出現(xiàn)透明圈則表明可產(chǎn)生淀粉酶，透明圈越大表明淀粉酶產(chǎn)生能力越強。

結(jié)果表明分離得到的4株芽孢菌中有1株可產(chǎn)生淀粉酶，且其產(chǎn)生能力和解淀粉芽孢桿菌商品株相當(dāng)（圖2）。其余菌株或不產(chǎn)生淀粉酶，或產(chǎn)生能力較低。

2.4 芽孢菌發(fā)酵陜西主料煙葉

分別采用短小芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和高地芽孢桿菌的單一菌劑和復(fù)配菌劑對成品片煙固態(tài)發(fā)酵后，發(fā)酵煙葉總糖、總氮、還原糖和淀粉含量變化如圖3～6所示。

結(jié)果表明，分別使用單一菌種或復(fù)合菌劑發(fā)酵煙葉后，與未發(fā)酵樣品相比，其中的總糖和淀粉含量總體上呈下降趨勢，且隨著發(fā)酵時間延長含量越低；總氮和還原糖發(fā)酵早期呈現(xiàn)出下降趨勢，隨著發(fā)酵進行含量又逐步上升，未呈現(xiàn)出比較規(guī)律的變化趨勢。

2.5 發(fā)酵煙葉評吸結(jié)果

評吸專家在同一條件下分別對發(fā)酵前、后煙葉樣品的感官評吸結(jié)果表明，與未發(fā)酵煙葉相比，微生物發(fā)酵后煙葉香氣量平均增加3.4%，最高增加5%；刺激性平均降低7%，雜氣平均減弱4%，勁頭足平均下降6.9%，煙氣膨松，甜感有所提升，煙葉的吸食品質(zhì)得到有效改善。隨著發(fā)酵時間的延長，品質(zhì)改善越明顯，有較獨特的產(chǎn)品風(fēng)格，工業(yè)可用性較強。

3 討論

陜西煙葉具有出葉片率高、安全性高、氯含量低、燃燒性優(yōu)等特點，但與云南、貴州和津巴布韋煙葉相比，存在工業(yè)適配性不高，煙葉中香氣量與香氣質(zhì)不足，青雜氣和土雜氣較重等問題[11]，嚴重制約著陜西煙葉的銷售和推廣。烤煙中淀粉、蛋白質(zhì)、水溶性糖和其他含氮化合物含量越高，燃燒時產(chǎn)生的刺激性越大，煙葉的燃燒性就越低。以此同時，這些物質(zhì)也是煙氣中有害物質(zhì)的前體[12]。因此，適當(dāng)降低和轉(zhuǎn)化煙葉中的一些組分對提高成品煙吸食品質(zhì)十分重要，但目前通過微生物發(fā)酵來實現(xiàn)此目標的研究仍然較少。

本研究中，我們對陜西主料煙葉自帶微生物的種群進行了定量分析，結(jié)果顯示主要類群為細菌和霉菌。這與趙銘欽[13]對河南烤煙的煙葉優(yōu)勢微生物分離篩選研究結(jié)果比較相似。表明這些微生物可能是煙葉中的常居菌，它們的存在對煙葉烤制后自然陳化過程中品質(zhì)進一步改善和提高發(fā)揮著重要作用。以煙葉陳化期間品質(zhì)變化為基礎(chǔ)，探求微生物的生命活動動態(tài)變化以及微生物之間的協(xié)同關(guān)系[14，15]對煙葉品質(zhì)改良的影響，可為煙葉品質(zhì)提升提供更深層次的理論依據(jù)。

為了加快烤煙的陳化速度，加快其中淀粉、蛋白質(zhì)和其他多糖的水解和轉(zhuǎn)化速度，使煙葉中的一些組分在微生物的作用下達到一個比較合適的含量和比例，提高成品香煙的吸食品質(zhì)，本研究分別采用了3株對淀粉、纖維素和果膠水解能力較強的芽孢菌，分別采用單一菌株和復(fù)合菌劑對4種陜西主料煙葉進行發(fā)酵，以期提高其適配性和吸食品質(zhì)。從發(fā)酵總體趨勢分析來看，微生物發(fā)酵后總糖和淀粉含量均呈現(xiàn)出隨發(fā)酵時間延長而下降的趨勢，總氮和還原糖含量總體變化不明顯。單一菌株和復(fù)配菌株發(fā)酵后可使煙葉中的淀粉、總糖和還原性糖含量有不同程度的降低，但復(fù)配菌株對它們的降解能力并不是單一菌株降解作用的累加，這可能是由于不同組合微生物的生命活動產(chǎn)生的水解酶及其水解作用影響了這些大分子物質(zhì)的含量。微生物在代謝過程中會利用淀粉等大分子物質(zhì)作為碳源以維持生命活動[16]，從而降低了淀粉的含量。然而，由于微生物的持續(xù)作用，可能導(dǎo)致發(fā)酵后期代謝產(chǎn)生的還原糖含量升高。一般情況下，總氮含量在發(fā)酵后會下降，而本研究中其含量基本無變化或有些許升高，可能是由于煙葉本身的酶系可以降解煙葉中的含氮化合物，使其再發(fā)酵初期含量下降，但后期可能因為微生物菌體數(shù)量增加，導(dǎo)致總氮含量有所升高。前期的研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵煙葉的過程會發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，代謝產(chǎn)生的氨基酸和糖類還可能進一步反應(yīng)，生成的新物質(zhì)可以改善煙葉的色澤，提高外觀品質(zhì)[17]。

目前，提高陜西煙葉工業(yè)適配性的關(guān)注點主要是改善和提高烤煙內(nèi)在化學(xué)品質(zhì)，增加煙葉香氣物質(zhì)種類和含量，這也是煙葉提質(zhì)增效的關(guān)鍵技術(shù)。其中，常用的增香劑有美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、糖類物質(zhì)和酶制劑等[18]，主要對烤后煙葉進行處理。樊文舉[19]研究了噴施一定量酶溶液對烤制后煙葉的理化指標影響，發(fā)現(xiàn)不同酶處理對烤后煙葉的色澤、表面形態(tài)和熱解特性產(chǎn)生了一定的影響。孫偉峰[20]利用酶法和外加香料法對下部煙葉進行增香提質(zhì)，提升了品質(zhì)較差的下部煙葉的利用率。本研究采用發(fā)酵的方法，在不添加增香劑條件下對煙葉進行微生物發(fā)酵處理后，對陜西主料煙葉的增香提質(zhì)作用產(chǎn)生了顯著的效果，同時還響應(yīng)了國家煙草專賣局提出的“減害降焦”戰(zhàn)略目標[21，22]，為陜西煙葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐與借鑒。

4 結(jié)論

“陜西主料”煙葉中優(yōu)勢菌類群主要為細菌，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定均為芽孢桿菌，其中優(yōu)勢分離菌株5號菌具有有較強的淀粉水解能力。通過單一菌株和復(fù)配菌株對成品煙發(fā)酵處理后，有效改善了煙葉淀粉、總糖、還原糖、總氮的含量和比例。經(jīng)過微生物發(fā)酵技術(shù)改進的“陜西主料”煙葉吸食品質(zhì)優(yōu)良，有效提升了煙葉品質(zhì)，形成了陜西煙葉產(chǎn)品的特有風(fēng)格，為提高“陜西主料”煙葉的工業(yè)適配性和經(jīng)濟價值提供了理論和技術(shù)支持。

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