土壤草銨膦污染誘導(dǎo)赤子愛勝蚓蛋白質(zhì)氧化損傷

摘要：為評(píng)價(jià)施用草銨膦（GLA）可能給土壤生態(tài)環(huán)境帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，將制備的GLA人工污染土壤[0（對(duì)照）、10、20、40、80 mg ·kg-1]于室內(nèi)老化3個(gè)月后置入赤子愛勝蚓，培養(yǎng)30d后研究蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化損傷及其解毒機(jī)制。結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，20、40 mg·kg-1 GLA污染土壤明顯上調(diào)了蚯蚓體內(nèi)NADPH氧化酶和CAT同工酶活性，同時(shí)促進(jìn)了GSH的合成（P＜0.05）。當(dāng)GLA濃度增至80 mg·kg-1時(shí)，SOD、APX、POD同工酶活性明顯升高，而HSP70的合成和蚯蚓的體質(zhì)量受到顯著抑制。免疫印跡顯示，在GLA濃度為10-40 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓體內(nèi)蛋白羰基化產(chǎn)物明顯增加，誘導(dǎo)了潛在的解毒機(jī)制。泛素和20S蛋白酶體的蛋白豐度總體上隨著土壤GLA濃度的增加趨于升高。在CLA濃度為40-80 mg·kg-1時(shí)，20S蛋白酶體、總蛋白酶、EPs同工酶和GSTs酶活性顯著升高（P＜0.05）。研究表明，土壤CLA污染誘導(dǎo)了赤子愛勝蚓蛋白質(zhì)的氧化損傷，泛素-20S蛋白酶體、EPs同工酶、總蛋白酶和GSTs是其重要的解毒機(jī)制。

關(guān)鍵詞：草銨膦（GLA）；赤子愛勝蚓；氧化損傷蛋白；解毒機(jī)制；健康風(fēng)險(xiǎn)

中圖分類號(hào)：X174 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024）07-1468-07 doi：10.11654／jaes.2024-0078

草銨膦（Glufosinate ammonium，GLA）具有殺草譜廣、毒性低、活性高以及環(huán)境相容性好等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于非耕地防除多種一年生和多年生禾本科草和闊葉草。近年來(lái)，因百草枯、草甘膦等高毒性除草劑的禁用，GLA的應(yīng)用面積日益擴(kuò)大。GLA具有較強(qiáng)的水溶性和持效性，施用后易發(fā)生遷移，進(jìn)而污染地表水、地下水和土壤，成為偽持久性污染物，對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在威脅。大量研究發(fā)現(xiàn)，GLA污染水體能夠危害水生動(dòng)物。在水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的地表水、沉積物以及池內(nèi)的魚類、小龍蝦和螃蟹體內(nèi)幾乎都能夠檢測(cè)到GLA的存在，而且GLA還能夠損傷小龍蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)，并降低其抗氧化能力和非特異性免疫能力。低濃度GLA（1.25-5 mg·L-1）能夠激活斑馬魚的Nrf2信號(hào)通路，而高濃度GLA（10-20 mg.L-I）則抑制該通路，導(dǎo)致斑馬魚肝臟組織的氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡。

土壤GLA污染也會(huì)給土壤動(dòng)物帶來(lái)潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。Wang等通過7d和14 d急性毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)土壤GLA污染毒性較低，其LCso超過2 000 mg·kg-1。在果園或農(nóng)場(chǎng)，GLA的使用頻率和濃度遠(yuǎn)超過推薦劑量，相當(dāng)一部分GLA滲入土壤，某些區(qū)域GLA檢出量高達(dá)187 μg·kg-1。據(jù)報(bào)道，蚯蚓短期暴露于低劑量GLA污染土壤后其體質(zhì)量、繭和幼蟲會(huì)明顯減少，其體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和乙酰膽堿酯酶的活性也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，而且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，GLA還會(huì)加劇蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的損傷。

污染物的暴露通常都會(huì)導(dǎo)致動(dòng)植物體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)SOD、CAT等抗氧化酶同工酶的響應(yīng)。當(dāng)ROS的積累超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí)，ROS就會(huì)攻擊蛋白質(zhì)分子中的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，形成氧化損傷蛋白，并進(jìn)一步干擾細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，清除損傷蛋白是緩解生物體內(nèi)氧化損傷的重要解毒機(jī)制。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)草甘膦的毒理學(xué)研究比較充分，而對(duì)土壤GLA污染致毒的研究則剛剛起步，且側(cè)重于急性毒性試驗(yàn)。對(duì)于長(zhǎng)期老化（如3個(gè)月）后的GLA污染土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的研究仍鮮見報(bào)道。老化3個(gè)月后的GLA污染土壤對(duì)蚯蚓是否還會(huì)產(chǎn)生蛋白毒性？若誘導(dǎo)了蚯蚓蛋白的氧化損傷，蚯蚓又是通過何種途徑清除這些氧化損傷蛋白的？目前還缺乏研究證據(jù)。為此，本研究參照非耕地土壤頻繁施用GLA后其殘留顯著增加的區(qū)域特點(diǎn)制備了外源GLA濃度較高的污染土壤，并老化3個(gè)月，以研究赤子愛勝蚓暴露培養(yǎng)于該污染土壤30 d后其蛋白氧化損傷的變化和相關(guān)解毒機(jī)制的響應(yīng)，為評(píng)價(jià)土壤GLA污染對(duì)土壤動(dòng)物的健康風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

主要儀器：精密電子天平（BSA224S，德國(guó)賽多利斯公司），高速冷凍離心機(jī)（5425R，德國(guó)艾本德公司），電泳系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司），轉(zhuǎn)印槽（JY-ZY5，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），酶標(biāo)定量測(cè)定儀（美國(guó)Molecular Devices公司），紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)（上海天能科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)材料

草銨膦購(gòu)自山東圣鵬科技股份有限公司，水劑型，有效成分濃度200 g·L-1，半衰期3-42 d；赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）購(gòu)自合肥蚯蚓養(yǎng)殖中心；試驗(yàn)土壤取自淮南師范學(xué)院泉山校區(qū)無(wú)污染的非耕地表層土壤，pH 8.0，總碳、總氫、總氮的含量分別為0.65%、0.85%和0.06%，有效陽(yáng)離子交換量為47.6 cmol·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量為10.6 mg·kg-1。

1.3 污染土壤的制備與蚯蚓的暴露培養(yǎng)

試驗(yàn)土壤經(jīng)風(fēng)干、研磨、過篩后稱質(zhì)量，每盆2.5kg。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)外源GLA濃度分別為0（T0，對(duì)照）、10（T1）、20（T2）、40（T3）、80 mg·kg-1（T4）5個(gè)試驗(yàn)組，每劑量組3個(gè)平行。根據(jù)各劑量組外源GLA濃度、干土質(zhì)量和GLA有效成分濃度計(jì)算并稱量所需GLA水劑的質(zhì)量，稀釋至300 mL去離子水中，充分混勻后一邊雙手?jǐn)嚢柰寥?，一邊噴灑GLA稀釋液，使之混合均勻。TO組噴灑等量去離子水。各組土壤室內(nèi)老化（室溫22-30℃）3個(gè)月后稱質(zhì)量，補(bǔ)充適量去離子水，確保每盆土壤等質(zhì)量。經(jīng)未污染的試驗(yàn)土壤馴化一周后，挑選有明顯環(huán)帶、大小一致的赤子愛勝蚓置入試驗(yàn)土壤，每盆30條。土壤表面投放50g干牛糞，噴灑等量去離子水，使之濕潤(rùn)。在恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 d（20-21℃，70%相對(duì)濕度，24 h黑暗）。定期稱量各盆土壤，補(bǔ)充相應(yīng)質(zhì)量的去離子水。暴露培養(yǎng)結(jié)束后收集各組蚯蚓，各盆蚯蚓數(shù)量未見變化，清腸24 h后開展后續(xù)試驗(yàn)研究。

1.4 蚯蚓粗酶液的提取和蛋白定量

參照Wang等的方法提取蚯蚓總蛋白。稱取1.0 g新鮮蚯蚓樣品，加入4 mL蛋白提取液[0.25 mol·L-1蔗糖，0.2 mol·L-1 Tris-HCl（pH 7.5），2 mmol·L-1Na2EDTA，0.2%（V/V） Triton X-100，5 mmol·L-1抗壞血酸，1 mmol·L-1苯甲脒，0.04 μg·mL-1亮抑酶肽，0.32μg·L-1抑肽酶，1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟和2 mmol·L-1二硫蘇糖1，冰浴下充分勻漿，離心（4℃，12 000 g）10 min，取上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用Bradford法對(duì)粗酶液進(jìn)行蛋白定量。

1.5 典型抗氧化酶、NADPH氧化酶和內(nèi)肽酶（EPs）同工酶圖譜解析

應(yīng)用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳解析SOD、POD、CAT和抗壞血酸過氧化物酶（APX）同工酶圖譜的變化。SOD、POD、APX和NADPH氧化酶同工酶的分離采用50%（m/V）積層膠和12%（m/V）分離膠；CAT同工酶采用4%（m/V）積層膠和6%（m/V）分離膠。參考Garcia - Limones等以及Verma等的方法對(duì)SOD、POD、APX和CAT同工酶進(jìn)行顯色分析；參照Yeh等的方法對(duì)NADPH氧化酶同工酶進(jìn)行顯色分析。應(yīng)用SDS - PAGE電泳分離EPs同工酶，參考Wang等的方法對(duì)EPs進(jìn)行顯色分析。均采用Tris -甘氨酸緩沖液作為電泳液。

1.6 泛素、20S蛋白酶體、蛋白羰基化產(chǎn)物和HSP70蛋白的免疫印跡

參照Rong等的方法進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡實(shí)驗(yàn)。采用5%（m／V）分離膠和12%（m／V）積層膠對(duì)蚯蚓總蛋白進(jìn)行分離，采用Tris-甘氨酸緩沖液作為電泳液。電泳結(jié)束后，應(yīng)用濕轉(zhuǎn)儀將膠塊中的總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，應(yīng)用8%（m／V）脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，再分別包被于下列抗體：檢測(cè)泛素蛋白的一抗為兔抗—泛素蛋白單克隆IgG抗體（BosterCorp.，稀釋比1：1500），二抗為山羊抗-兔IgG抗體（Stressgen Corp.，稀釋比1：40 000）；檢測(cè)20S蛋白酶體的一抗為小鼠抗-20S蛋白酶體32亞基的單克隆IgG抗體（Enzo Life Sciences，Inc．，稀釋比1：2 500），二抗為山羊抗-小鼠IgG抗體（Stressgen Corp.，稀釋比1：40 000）；檢測(cè)HSP70蛋白的一抗為小鼠抗-HSP70單克隆IgG抗體（Boster Corp.，稀釋比1：1000），二抗為山羊抗-小鼠IgG抗體（Stressgen Corp．，稀釋比1：40 000）；檢測(cè)蛋白羰基化產(chǎn)物的一抗為小鼠抗-DNPH單克隆IgE抗體（Sigma-Aldrich，稀釋比1：1 000），二抗為山羊抗-小鼠IgE抗體（Sigma-Aldrich，稀釋比1：50 000）。為確保蛋白上樣量的一致性，同時(shí)檢測(cè)了β -actin蛋白的豐度，一抗為小鼠抗-β- actin單克隆IgG抗體（Boster Corp.，稀釋比1：1 500），二抗為山羊抗-小鼠IgG抗體（Stressgen Corp．，稀釋比1：40 000）。應(yīng)用ECL發(fā)光試劑盒（Thermo Scientific）對(duì)Blotting進(jìn)行顯色，應(yīng)用多功能熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。

1.7 CSTs酶活性和還原性谷胱甘肽（GSH）產(chǎn)物的測(cè)定

參照Habig等的方法測(cè)定GSTs酶活性。反應(yīng)體系包括90 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.5），0.5mmol·L-1 1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB），1 mmol·L-1GSH和適量粗酶液，以不添加粗酶液的反應(yīng)體系作為對(duì)照。測(cè)定OD340nm在2 min內(nèi)的變化，以每毫克酶蛋白催化1 μmol·min-1CDNB與GSH結(jié)合成共軛產(chǎn)物（ε=9.6 mmol·cm-1）作為一個(gè)GSTs酶活力單位。

參照Souza等的方法測(cè)定GSH產(chǎn)物的含量，對(duì)方法稍加改進(jìn)。稱取0.5 g新鮮蚯蚓，加入2 mL l mmol·L-1 Na2EDTA，勻漿后加入200 μL 50%（V/V） HClO4，離心（4℃，12 000 g）10 min。取250 μL上清液，與2.4 mL50 mmol·L1-PBS（pH 8.0）、150 μL 1%（V／V））O-鄰苯二甲醛和1.2 mL去離子水混勻，避光反應(yīng)10 min，應(yīng)用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值（激發(fā)波長(zhǎng)為343 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm）。以GSH作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蚯蚓體內(nèi)GSH含量，以每克蚯蚓鮮質(zhì)量中含有的GSH量表示（μg·g-1）。

1.8 總蛋白酶和20S蛋白酶體活性的測(cè)定

參照Cajewska等的方法測(cè)定總蛋白酶活性，對(duì)方法稍加改進(jìn)。取適量粗酶液與反應(yīng)液[100 mmol·L-1 PBS（pH 7.0），0.6%（m/V）偶氮酪蛋白，0.1%（m/V）聚氧乙烯月桂醇醚]混勻，在30℃下分別水浴20 min和40 min，加入10%（m/V） TCA終止反應(yīng)，離心（4℃，3 000 g）10 min，取上清液，在366 nm下測(cè)定吸光度值。吸光度值每分鐘增加0.01單位代表一個(gè)酶活力單位（U），結(jié)果以U·mg-1表示。

20S蛋白酶活性的測(cè)定：取適量粗酶液，與反應(yīng)液（50 mmol·L-1 HEPES-NaOH，5 mmol·L-1 MgCl2，10mmol· L-1 KCl，20 mmol· L-1 ATP. 20 μmmol·L-1 SucLLYV-AMC和25 μmmol·L-1 MG-132）混勻，應(yīng)用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光值（激發(fā)波長(zhǎng)為345 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為445 nm），結(jié)果以U·mg-1表示。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncant-test顯著性分析（One-way ANOVA，P＜0.05），應(yīng)用Origin 9制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓體質(zhì)量的變化

暴露培養(yǎng)30d后，各盆蚯蚓未發(fā)生死亡或逃逸現(xiàn)象。蚯蚓清洗干凈并用吸水紙吸干體表水分后稱質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示。分析可知，與對(duì)照組比較，蚯蚓暴露于10 mg·kg-1和20 mg·kg-1外源GLA污染土壤后體質(zhì)量增加，但變化不顯著（P＞0．05）；隨著GLA濃度的升高，蚯蚓體質(zhì)量降低，其中GLA濃度在80mg· kg-1時(shí)其體質(zhì)量顯著下降（P＜0．05）。

2.2 蚯蚓體內(nèi)4種抗氧化酶、NADPH氧化酶和EPs同工酶圖譜的變化

如圖2所示，與對(duì)照組比較，GLA在10-80 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)蚯蚓體內(nèi)CAT、NADPH氧化酶同工酶的帶型光密度（即同工酶活性）呈現(xiàn)降低、升高、再降低的變化趨勢(shì)（圖2b、圖2e），其中GLA濃度為20、40mg·kg-1時(shí)，這兩種酶的活性明顯高于對(duì)照組。而SOD、APX、POD同工酶活性則呈現(xiàn)升高、降低、再升高的變化趨勢(shì)（圖2a、圖2c、圖2d），其中GLA濃度在80 mg·kg-1時(shí)，3種酶活性明顯高于對(duì)照組。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，GLA濃度在10-80 mg·kg-1時(shí)，EPs同工酶活性隨著外源GLA濃度的增加而升高（圖2f）。

2.3 泛素和20S蛋白酶體豐度的變化

免疫印跡結(jié)果分析表明，與對(duì)照組比較，蚯蚓體內(nèi)泛素、20S蛋白酶體的蛋白豐度總體上隨著土壤GLA濃度的增加而升高，其中CLA濃度在20-80 mg·kg-1時(shí)，20S蛋白酶體的蛋白豐度明顯升高（圖3）。

2.4 蛋白羰基化產(chǎn)物和HSP70蛋白豐度的變化

由圖4可見，蚯蚓體內(nèi)蛋白羰基化產(chǎn)物隨著土壤GLA濃度的遞增而減少。與對(duì)照組比較，10-40 mg·kg-1GLA明顯誘導(dǎo)了蚯蚓體內(nèi)蛋白羰基化產(chǎn)物的產(chǎn)生（圖4a）；而蚯蚓體內(nèi)HSP70蛋白的豐度則隨著土壤GLA濃度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其中在80 mg·kg-1時(shí)，HSP70的合成水平明顯降低（圖4b）。

2.5 GSTs酶活性和GSH產(chǎn)物的變化

如圖5所示，與對(duì)照組比較，蚯蚓體內(nèi)GSTs酶活性隨著土壤中GLA濃度的增加而升高，其中在40mg·kg-1和80 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓GSTs酶活性顯著升高（P＜O．05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蚯蚓暴露于10-80 mg·kg-1GLA污染土壤后其體內(nèi)GSH產(chǎn)物隨GLA濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中在20 mg·kg-1和40mg·kg-1時(shí)，GSH產(chǎn)物顯著增加（P＜0．05）（圖5b）。

2.6 蚯蚓體內(nèi)總蛋白酶和20S蛋白酶體活性的變化

如圖6所示，隨著GLA濃度的增加（10-80 mg·kg-1），蚯蚓體內(nèi)總蛋白酶和20S蛋白酶體活性升高，而且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。當(dāng)外源GLA濃度增至40 mg·kg-1時(shí)，總蛋白酶活性和20S蛋白酶體活性達(dá)到峰值，高于此劑量時(shí)，這兩種酶活性降低，但仍顯著高于對(duì)照組。

3 討論

GLA具有易降解、毒性低、環(huán)境相容性好等優(yōu)點(diǎn)，其半衰期常因土壤類型和土壤理化性質(zhì)的不同而產(chǎn)生差異，一般為3-42 d。GLA具有較強(qiáng)的水溶性和持效性，在實(shí)際應(yīng)用中其施用的濃度和頻次常超過推薦的劑量和次數(shù)。因此，濫用GLA很可能導(dǎo)致其母本化合物或代謝產(chǎn)物在土壤中蓄積，從而對(duì)土壤動(dòng)物（如蚯蚓）產(chǎn)生毒性，其潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)值得進(jìn)一步關(guān)注。

GLA的有效成分磷酸化后能夠結(jié)合谷氨酰胺合成酶的活性中心，阻礙氨與谷氨酸合成谷氨酰胺，導(dǎo)致植物體內(nèi)氨的過度積累，進(jìn)而抑制光合作用，導(dǎo)致植物體死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CLA還能夠破壞植物體的光呼吸和光反應(yīng)，通過光還原分子氧產(chǎn)生ROS。因此，GLA主要通過介導(dǎo)氨和ROS的積累殺死雜草。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10-40 mg·kg-1土壤GLA明顯提高了赤子愛勝蚓體內(nèi)NADPH氧化酶同工酶活性（圖2e）。NADPH氧化酶是細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-·）的一條酶促生成途徑。O-2·在SOD酶作用下歧化成H2O2，后者若未能被APX、CAT、POD等抗氧化酶及時(shí)清除，則會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成OH·，從而對(duì)生命體產(chǎn)生更大的危害。因此，誘導(dǎo)ROS的進(jìn)發(fā)很可能是土壤GLA污染對(duì)蚯蚓致毒的一種潛在機(jī)制。

由圖2可見，蚯蚓體內(nèi)SOD、CAT、APX和POD 4種抗氧化酶同工酶活性在40 mg·kg-1和80 mg·kg-1土壤GLA脅迫下明顯升高（圖2a-圖2d），藉此清除部分ROS，減輕GLA污染對(duì)蚯蚓的氧化脅迫。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過抗氧化酶的清除能力時(shí)，ROS就會(huì)攻擊蛋白質(zhì)分子中的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，產(chǎn)生羰基化等氧化損傷蛋白。這些羰基化蛋白經(jīng)過2，4-二硝基苯肼衍生化后能夠被特異性抗體識(shí)別和結(jié)合，借助免疫印跡技術(shù)就能夠檢測(cè)出這些蛋白產(chǎn)物豐度的變化。免疫印跡結(jié)果顯示，赤子愛勝蚓暴露于10-40 mg·kg-1GLA污染土壤30 d后其蛋白羰基化產(chǎn)物明顯高于對(duì)照組（圖4），證明該劑量范圍的GLA污染土壤誘導(dǎo)了蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化損傷。羰基化蛋白豐度隨著GLA濃度的遞增而降低，這可能與高劑量GLA抑制了蚯蚓體內(nèi)總蛋白的合成，降低了可溶性蛋白含量和氧化損傷蛋白的產(chǎn)生有關(guān)。

為了防御污染物的氧化損傷，動(dòng)植物體不僅會(huì)啟動(dòng)抗氧化酶系統(tǒng)，還會(huì)啟動(dòng)對(duì)氧化損傷蛋白的修復(fù)和降解機(jī)制。熱休克蛋白HSP70參與校正被錯(cuò)誤折疊的蛋白異構(gòu)體和修復(fù)氧化損傷蛋白。當(dāng)損傷蛋白失去功能時(shí)，HSP70還能夠促進(jìn)26S蛋白酶體解離出20S核心蛋白，參與變性蛋白的降解。當(dāng)外源GLA增至40 mg·kg-1和80 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓體內(nèi)HSP70的蛋白豐度下降并明顯低于對(duì)照組（圖4b）。據(jù)此推測(cè)，蚯蚓體內(nèi)HSP70蛋白的合成受高濃度GLA的抑制而失去修復(fù)氧化損傷蛋白的能力，進(jìn)而加速了變性蛋白的累積。

泛素-26S蛋白酶體（UPP）是動(dòng)物體內(nèi)選擇性降解氧化損傷蛋白的主要機(jī)制。26S蛋白酶體通常由一個(gè)20S核心蛋白酶體和兩個(gè)19S調(diào)節(jié)亞基組成，其中20S核心蛋白發(fā)揮決定作用。本研究結(jié)果顯示，泛素和20S蛋白酶體的蛋白豐度（圖3）以及20S蛋白酶體活性（圖6b）總體上隨著土壤GLA濃度的增加而升高，提示UPP參與了蚯蚓體內(nèi)氧化損傷蛋白的降解，是蚯蚓體內(nèi)消減GLA誘導(dǎo)的蛋白毒性的重要途徑。除UPP途徑外，EPs和氨基肽酶等蛋白酶在多種生物體內(nèi)降解氧化損傷蛋白過程中也發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解過程通常是由20S蛋白酶體啟動(dòng)，再由蛋白酶承擔(dān)后續(xù)的降解過程。在本試驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，20-80 mg·kg-1 CLA污染土壤明顯提高了蚯蚓體內(nèi)EPs同工酶（圖2f）和總蛋白酶活性（圖6a），提示總蛋白酶和EPs同工酶也是清除蚯蚓體內(nèi)氧化損傷蛋白的重要解毒機(jī)制。

GSTs起源于一種古老的GSH結(jié)合蛋白，是一個(gè)具有多功能的蛋白質(zhì)超家族，參與生物體內(nèi)的解毒、拮抗生物與非生物脅迫等過程。而GSH中的巰基能夠給自由基提供配對(duì)的電子，使之失去氧化性和攻擊性，進(jìn)而緩解生物體內(nèi)的氧化脅迫。本研究結(jié)果也表明，20-80 mg·kg-1GLA污染土壤顯著提高了GSTs酶活性，而20、40 mg·kg-1GLA顯著促進(jìn)了GSH的合成（P＜0．05，圖4），因此，GSTs酶和GSH也參與蚯蚓體內(nèi)對(duì)GLA致毒的解毒作用。

4 結(jié)論

（1）土壤GLA污染通過上調(diào)蚯蚓體內(nèi)NADPH氧化酶活性，產(chǎn)生了過量的ROS，導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化損傷。

（2）土壤GLA污染還誘導(dǎo)了蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶、GSH、GSTs、泛素-20S蛋白酶體、總蛋白酶和EPs同工酶的應(yīng)激響應(yīng)，緩解了蚯蚓蛋白質(zhì)的氧化損傷，其中泛素-20S蛋白酶體、EPs同工酶、總蛋白酶和GSTs是其重要的解毒酶。

基金項(xiàng)目：安徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（2022AH051587）；淮南師范學(xué)院校級(jí)科學(xué)研究項(xiàng)目（2023XJYB036）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng) 業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202210381102）