中試膜生物反應(yīng)器處理奶牛養(yǎng)殖污水的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

摘要：為了研究中試膜生物反應(yīng)器在不同運(yùn)行參數(shù)下處理高濃度奶牛養(yǎng)殖污水時(shí)膜生物反應(yīng)器（Membrane bioreactor，MBR）內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的演變情況，對(duì)不同污泥齡（Sludge retention time，SRT）、水力停留時(shí)間（Hydraulic retention time，HRT）和曝氣 方式（連續(xù)曝氣、3種間歇曝氣）形成的5種工況下MBR微生物組成、多樣性以及優(yōu)勢(shì)菌群分布進(jìn)行了表征，同時(shí)對(duì)比研究了不同工況下污染物去除效果。結(jié)果表明，MBR處理高濃度奶牛養(yǎng)殖污水的最佳運(yùn)行參數(shù)：SRT為30 d、HRT為96 h、曝15 min/停10 min，此參數(shù)條件下化學(xué)需氧量（COD）、NH+4-N、總氮（TN）和總磷（TP）的去除率分別為97．0%±0．5%、90.4%±1.3%、85.5%±1.8%和89.6%±5.6%，處理出水中4種水質(zhì)指標(biāo)濃度分別為（224±56）、（45±8）、（105±19）mg·L-1和（4±2）mg·L-1，運(yùn)行期間部分處理出水的COD濃度達(dá)到農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求，高效穩(wěn)定的有機(jī)物和氮磷去除效果依賴于MBR微生物的多樣性和功能微生物的穩(wěn)定性。反硝化除磷菌門的Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）的豐度占總細(xì)菌的85.2%，污水高效 脫氮除磷效率與反硝化除磷菌的種類、相對(duì)豐度密切相關(guān)；優(yōu)勢(shì)菌綱Gammaproteobacteria（γ-變形菌綱）、Bacteroidia（擬桿菌綱）和Clostridia（梭菌綱）的相對(duì)豐度總占比達(dá)81.2%，其中功能性除磷菌綱Gammaproteobacteria的豐度最高，達(dá)57.3%，保證了處理出水較低的TP濃度；優(yōu)勢(shì)反硝化菌屬為Ottowia（奧托氏菌屬），相對(duì)豐度占比達(dá)54.8%，可顯著提高M(jìn)BR脫氮效率。MBR處理高濃度奶牛養(yǎng)殖污水可實(shí)現(xiàn)良好的污染物去除效果，污染物去除效果與優(yōu)勢(shì)菌群密切相關(guān)，優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度越高，越有利于提高污水處理效果和出水水質(zhì)。

關(guān)鍵詞：膜生物反應(yīng)器；污水；工況；微生物群落；相對(duì)豐度

中圖分類號(hào)：X713 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024）09-2093-11 doi：10.11654/jaes.2023 -0926

奶牛養(yǎng)殖場污水成分復(fù)雜，其中含有大量有機(jī)物、氮和磷等污染物，若直接排放會(huì)破壞周邊環(huán)境，危害人類健康，因此必須采取有效處理措施在達(dá)到污染物排放標(biāo)準(zhǔn)后排放或消毒處理后安全回用。目前奶牛場大多采用常規(guī)厭氧—好氧方法處理高濃度污水，但其工藝繁瑣復(fù)雜且好氧曝氣會(huì)造成大量能源浪費(fèi)，部分處理工程產(chǎn)物不能完全還田利用。近年來，膜生物反應(yīng)器（Membrane bioreactor，MBR）作為一種新型生物處理工藝備受關(guān)注，其采用的結(jié)合活性污泥法和膜分離技術(shù)具有占地面積小、工藝簡單、運(yùn)行成本較低以及出水水質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，MBR較高的處理效率和較低的膜污染速率已被證實(shí)可應(yīng)用于高濃度奶牛養(yǎng)殖污水處理。

MBR在運(yùn)行過程中微生物作為其生化反應(yīng)的主要參與者，決定著污染物去除能力，微生物代謝產(chǎn)物及微生物本身也顯著影響膜分離過程，通過微生物群落分析可以進(jìn)一步挖掘MBR功能微生物及其豐度變化等信息，揭示MBR生化動(dòng)力學(xué)。目前MBR內(nèi)微生物群落和生態(tài)學(xué)特性研究在城市污水、生活污水和人工合成廢水等低濃度污水領(lǐng)域已有報(bào)道，但對(duì)高濃度畜禽污水[化學(xué)需氧量（COD）和總氮（TN）濃度分別高于5 000 mg·L-1和500 mg·L-1]的微生物研究較少且主要集中于豬場污水研究。姜超等和Sui等采用序批式膜生物反應(yīng)器處理豬場污水，結(jié)果均表明，當(dāng)進(jìn)水COD、TN濃度分別高于7 000、1 000 mg·L-1時(shí)兩種指標(biāo)的去除率均在92%以上，功能菌氨氧化細(xì)菌（Ammonia oxidizing bacteria，AOB）和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（Nitrite oxidizing bacteria，NOB）分別富集／減少數(shù)倍，微生物多樣性顯著增強(qiáng)。陳彥霖等考察了低溫環(huán)境下序批式膜生物反應(yīng)器對(duì)豬場污水的脫氮效果及關(guān)鍵功能菌群的演替特征，結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)水COD、TN濃度分別為9 377、880 mg·L-1時(shí)，COD、NH+4-N和TN的去除率均在96.5%以上，硝化菌屬（Nitrosomonas）和反硝化菌屬的豐度較高。卞含笑等采用MBR開展豬場沼液部分亞硝化工藝研究，結(jié)果表明，系統(tǒng)在進(jìn)水NH+4-N濃度為395 mg·L-1條件下運(yùn)行時(shí)，部分亞硝化過程中氨氧化細(xì)菌活性明顯提高、微生物多樣性增加且菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。針對(duì)畜禽養(yǎng)殖污水，大多數(shù)研究還是關(guān)注MBR在不同處理下對(duì)特定畜禽養(yǎng)殖污水的處理效果及特定功能微生物的研究，但不同畜禽污水種類、成分組成、濃度以及MBR規(guī)模會(huì)導(dǎo)致MBR微生物群落差異較大?；谥性囈?guī)模的MBR處理高濃度奶牛養(yǎng)殖污水的微生物群落解析鮮見報(bào)道，因此，本研究進(jìn)一步深入探究了奶牛場污水中試規(guī)模MBR微生物群落演替規(guī)律以及種群特征。

本研究采用中試規(guī)模（有效容積為6 m3）MBR開展高濃度奶牛養(yǎng)殖污水處理研究，通過高通量測序技術(shù)比較中試MBR在不同運(yùn)行工況／運(yùn)行參數(shù)[污泥齡（SRT）、曝氣周期和水力停留時(shí)間（HRT）]下膜池活性污泥混合液內(nèi)微生物多樣性、菌群結(jié)構(gòu)演替及功能微生物的變化，探討MBR運(yùn)行狀況和功能的變化與其活性污泥優(yōu)勢(shì)菌群的相互關(guān)系，以期為奶牛養(yǎng)殖場MBR系統(tǒng)的微生物群落特征研究提供科學(xué)支撐、為優(yōu)化MBR運(yùn)行及應(yīng)用于處理高濃度奶牛養(yǎng)殖污水工程實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用的MBR（圖1）由不銹鋼材質(zhì)制成，包括微孔曝氣盤、膜組件、鼓風(fēng)機(jī)和出水系統(tǒng)，其中膜組件為聚偏氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）平板膜，膜孔徑0.1 μm，總膜面積20 m2。MBR池體長、寬、高分別為4、2、2m，有效容積為6 m3，設(shè)計(jì)日處理量為5m3。MBR進(jìn)水由管道泵提升至膜池，膜組件過濾后經(jīng)自吸泵間歇抽吸（開8 min、停2min）產(chǎn)水，并通過轉(zhuǎn)子流量計(jì)調(diào)節(jié)產(chǎn)水量；利用鼓風(fēng)機(jī)經(jīng)由曝氣盤和膜組件給膜池供氧；液位器控制膜池水位；通過時(shí)間繼電器控制鼓風(fēng)機(jī)的曝氣時(shí)間和停曝時(shí)間；整個(gè)MBR系統(tǒng)及設(shè)備均由控制箱控制實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)運(yùn)行。

1.2 MBR運(yùn)行條件及進(jìn)水水質(zhì)

MBR接種污泥取自北京某規(guī)?；膛鑫鬯幚碚荆ㄎ勰酀舛葹? 000 mg·L-1），MBR污泥培養(yǎng)馴化完成后開始試驗(yàn)。MBR不同運(yùn)行工況如表1所示，MBR在5種工況下連續(xù)運(yùn)行，每種工況各穩(wěn)定運(yùn)行1個(gè)月，試驗(yàn)過程持續(xù)150 d。MBR膜通量為10 L·m-2·h-1，鼓風(fēng)機(jī)曝氣強(qiáng)度為1.8 m3·m-2·h-1。連續(xù)曝氣時(shí)間歇出水，間歇曝氣時(shí)出水系統(tǒng)僅在曝氣階段出水，自吸泵和鼓風(fēng)機(jī)的啟閉由時(shí)間繼電器控制。利用出水管上真空壓力表來監(jiān)測跨膜壓力（Transmembranepressure，TMP）變化，當(dāng)TMP接近30 kPa時(shí)利用次氯酸鈉溶液和檸檬酸溶液清洗膜組件，且每種工況試驗(yàn)結(jié)束后排泥、恢復(fù)試驗(yàn)初始污泥濃度，并對(duì)膜組件進(jìn)行維護(hù)性清洗。

MBR進(jìn)水為現(xiàn)場中試絮凝裝置處理后的上清液，試驗(yàn)過程中進(jìn)水水質(zhì)稍有波動(dòng)，具體水質(zhì)特性如表2所示。

1.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

MBR系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后分別采集5種工況的膜池活性污泥混合液樣品分析其微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，依次記為MS1、MS2、MS3、MS4和MS5，每種工況采集平行樣3個(gè)。樣品冷凍保存于-25℃冰箱，然后送至某生物科技公司用于DNA提取、PCR擴(kuò)增及Miseq高通量測序。

DNA提取與PCR擴(kuò)增：按照Omega試劑盒（Mag-bind Soil DNA Kit）說明書進(jìn)行基因組DNA提取。PCR反應(yīng)體系為：5×buffer 5.0 μL，dNTP溶液（2.5mmol·1-1） 2.0 μL， Forward

Primer （10 μmol·L-1）1.0μL，Reverse Primer（10 μmol·L-1）1.0 μL，模板DNA1.0 μL，無菌超純水14.75 μL，Q5超保真DNA聚合酶0.25 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性30 s、52℃復(fù)性30 s、72℃延伸45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，其余操作方法參見文獻(xiàn)。利用Illu-mina Miseq高通量測序平臺(tái)（Illumina，美國）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。

采用QIIME2軟件進(jìn)行種群豐富度和多樣性的分析。Alpha多樣性指數(shù)：以Goods coverage指數(shù)表征覆蓋度，以Chaol和Observed species指數(shù)表征微生物豐富度，其值越大表明豐富度越高、物種總數(shù)越多；Shannon指數(shù)用來估算樣本中微生物多樣性，其值越大表明多樣性越高。Beta多樣性是對(duì)不同樣品間的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較，樣品的空間距離越接近，表示樣品的物種組成結(jié)構(gòu)越相似。主成分分析（Principal components analysis，PCoA）可用于組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著性分析，基于Unweighted unifrac距離矩陣，使用QIIME2和Ggplot2軟件包進(jìn)行分析并繪圖。冗余分析（Redundancy analysis，RDA）可用于對(duì)微生物群落與進(jìn)水水質(zhì)及去除效果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，采用Canoc0 5.0（Microcomputer power，美國），基于樣品中前10位菌屬繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 MBR對(duì)污水處理的效果

MBR各工況水質(zhì)去除效果如表3所示，整個(gè)運(yùn)行期間COD、NH+4-N、TN和TP的去除率分別為95.8%±2.2%±77.2%±22.2%、78.5%±15.2%和88.5%±8.2%，對(duì)應(yīng)的處理出水濃度分別為（279±117）、（94±51）、（142±68）mg·L-1和（3±2）mg·L-1。MBR除在工況2對(duì)NH+4-N、TN和TP的去除率較低外，MBR在其他4種工況下出水水質(zhì)均保持優(yōu)良，且工況5對(duì)NH+4-N、TN、TP的去除率最高，分別為90.4%、85.5%和89.6%，此時(shí)MBR脫氮除磷效果最佳。

MBR在5種工況下對(duì)COD的去除率均在93%以上，這與許多研究學(xué)者報(bào)道的MBR對(duì)污水COD去除率在85%-98%的結(jié)論一致。MBR采用間歇曝氣會(huì)同時(shí)產(chǎn)生硝化反硝化活動(dòng)，因此可同時(shí)去除NH+4-N和TN。MBR對(duì)TP的去除除了歸因于系統(tǒng)定期排泥除磷外，還包括生物除磷過程，即好氧條件下聚磷菌的釋放和富集對(duì)TP的去除。Sui等采用序批式MBR處理豬場污水，結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)水COD、NH+4-N和TN濃度分別為（7 046.3±1 287.4）、（811.7±6.6）mg·L-1和（1 042.5±147.8）mg·L-1時(shí)，3種水質(zhì)指標(biāo)的去除率分別為95%、99%和93%，NH+4-N和TN的去除率均高于本試驗(yàn)結(jié)果，可能是Sui等的HRT（6 d）是本試驗(yàn)（4 d）的1.5倍，功能性反硝化菌群有更充分的反應(yīng)時(shí)間來降解污染物。陳彥霖等采用序批式MBR處理生豬養(yǎng)殖廢水，COD、NH+4-N和TN的去除率分別為96.5%、98.6%和96.5%，COD去除率和本試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)，而脫氮效果優(yōu)于本試驗(yàn)，這是因?yàn)殛悘┝氐炔捎玫男蚺組BR配備的缺氧和好氧單元降低了進(jìn)水氮負(fù)荷，進(jìn)而提高了脫氮效率。

2.2 MBR內(nèi)微生物Alpha多樣性分析

MBR膜池活性污泥混合液樣品微生物Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表4，以此反映微生物群落的豐度和多樣性。所有膜池混合液樣品的Goods coverage指數(shù)均大于0.99，測序結(jié)果均能準(zhǔn)確反映樣品的微生物群落多樣性。當(dāng)MBR采用連續(xù)曝氣時(shí)，工況2的Chaol指數(shù)和Observed species指數(shù)均高于工況1，但差異不顯著，表明延長SRT至45 d使膜池混合液內(nèi)微生物群落豐富度升高；工況3較工況1的豐富度高，可能因?yàn)椴捎闷?0 min/停30 min時(shí)MBR存在更多的反硝化菌種，膜池內(nèi)物種總數(shù)增多；當(dāng)MBR采用SRT為30 d、HRT為96 h時(shí)，工況4和工況5的微生物群落豐富度低于其他3種工況，工況5的微生物群落豐富度高于工況4。

SRT由30 d延長至45 d時(shí)工況2的Shannon指數(shù)高于工況1，表明延長SRT使膜池混合液內(nèi)微生物群落多樣性增多；工況2的Shannon指數(shù)顯著高于工況3-工況5（圖2），表明工況2的微生物種群多樣性較高，此時(shí)膜池內(nèi)優(yōu)勢(shì)微生物占總生物量的比例較小。MBR中的微生物多樣性與水質(zhì)和活性污泥特性密切相關(guān)。MBR在工況2中的微生物豐富度和多樣性最高，這是因?yàn)榇藭r(shí)MBR采用45 d的高SRT時(shí)膜池排掉的剩余污泥量較小，而活性污泥迅速增殖，膜池混合液污泥濃度為（11 823±3 194）mg·L-1，MBR處于較高污泥濃度環(huán)境中，其豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)增大。工況3-工況5采用3種間歇曝氣時(shí)，Shannon指數(shù)分別為6.84、5.54和5.75，微生物多樣性由高到低依次為工況3、工況5和工況4。Li等探討不同SRT下MBR微生物群落多樣性的結(jié)果顯示，增加SRT導(dǎo)致活性污泥微生物群落多樣性指數(shù)降低，與SRT相關(guān)的微生物多樣性存在明顯差異；Deb等同樣證實(shí)了改變SRT能影響微生物多樣性指數(shù)；Cheng等對(duì)比分析了4種類型MBR內(nèi)微生物群落，結(jié)果顯示，較長HRT有利于提高微生物群落多樣性和豐度?？傊琈BR活性污泥微生物Alpha多樣性指數(shù)表現(xiàn)出不同程度的增加或減少，表明MBR運(yùn)行參數(shù)的改變會(huì)直接影響菌群多樣性的變化，且菌群可以逐漸適應(yīng)運(yùn)行工況的變化，逐漸演替適應(yīng)環(huán)境的變化，從而實(shí)現(xiàn)污水的高效處理。

2.3 MBR內(nèi)微生物Beta多樣性分析

如圖3所示，對(duì)MBR在不同運(yùn)行工況下膜池混合液樣品進(jìn)行PCoA分析，以了解各工況下微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。PCo1的貢獻(xiàn)率為22.4%，PCo2的貢獻(xiàn)率為10.2%，2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為32.6%，可以表征所有的變量特征。結(jié)果顯示，除了MS4和MS5樣品距離較近外，其余工況樣品距離較遠(yuǎn)，表明MBR在工況1-工況3改變運(yùn)行參數(shù)后膜池混合液內(nèi)物種組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯差異，而MBR在工況4和工況5時(shí)SRT和HRT分別均為30 d和96 h，僅停曝時(shí)間相差5 min，所以MS4和MS5樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)基本相似。Adonis分析可用于評(píng)估組間的整體差異，對(duì)不同運(yùn)行工況下膜池活性污泥混合液樣品進(jìn)行Adonis分析，結(jié)果顯示Adonis分析中P=0.001＜0.05，說明不同運(yùn)行工況下樣品組間群落結(jié)構(gòu)存在差異，且差異顯著體現(xiàn)在工況1-工況3。綜上所述，調(diào)整運(yùn)行參數(shù)可改變MBR膜池混合液內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.4 MBR內(nèi)微生物群落組成及豐度變化

2.4.1 門水平上微生物群落組成及豐度變化

圖4為5種工況下膜池混合液樣品在門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分布情況，從中可以看出，樣品中主要包括Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）和Patescibacteria等，且以Proteobacteria（相對(duì)豐度在18.2% - 64.8%）、Firmicutes（相對(duì)豐度在11.4% -33.8%）和Bacteroidetes（相對(duì)豐度在10.2% - 32.9%）為主，三者的豐度占總細(xì)菌的70.7%-89.5%。

從門水平的微生物中篩選出和脫氮相關(guān)的細(xì)菌，包括Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Patesci-bacteria和Chloroflexi（綠彎菌門），各樣品脫氮微生物在門水平的相對(duì)豐度見表5。MBR采用連續(xù)曝氣時(shí)由工況1調(diào)整為工況2，SRT由30 d增加到45 d，Pro-teobacteria的相對(duì)豐度從44.9%減小到26.9%，但是Firmicutes和Bacteroidetes的相對(duì)豐度均有增加趨勢(shì)，分別從16.6%、16.9%增加到28.8%、22.7%，表明30 dSRT有利于Proteobacteria的富集，這與Sofia等的研究結(jié)果一致。MBR采用3種間歇曝氣時(shí)工況3的微生物群落結(jié)構(gòu)與工況4、工況5的差異較大，Proteo-bacteria的相對(duì)豐度從43.2%增加到63.1%、60.5%，F(xiàn)irmicutes的相對(duì)豐度從17.3%減小到12.3%、12.9%，Bacteroidetes的相對(duì)豐度從21.2%減小到11.7%、11.8%：MBR由工況3運(yùn)行到工況4，曝氣、停曝時(shí)間縮短，Proteobacteria的相對(duì)豐度增加19.9個(gè)百分點(diǎn)，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes的相對(duì)豐度分別減小5.0、9.5個(gè)百分點(diǎn)。MBR由工況4運(yùn)行到工況5，曝氣時(shí)間不變、停曝時(shí)間增加，在門水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)組成無顯著差異且3種優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度無顯著變化。此外，樣品中還檢測到Patescibacteria和Chlo-roflexi，其均為重要的反硝化功能菌門，在本試驗(yàn)中所占比例相對(duì)較小，分別為2.3%-6.7%和1.1%-2.7%。

MBR運(yùn)行過程中以Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes為主要菌門，且在不同運(yùn)行參數(shù)下優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度發(fā)生變化，這與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致。Guadie等通過高通量測序技術(shù)研究了5種不同的間歇曝氣周期對(duì)流化床反應(yīng)器—膜生物反應(yīng)器組合系統(tǒng)中微生物群落的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Proteobac -teria（相對(duì)豐度為59%）、Firmicutes（相對(duì)豐度為12%）和Bacteroidetes（相對(duì)豐度為11%）是所有樣本中的優(yōu)勢(shì)菌群，組合系統(tǒng)在曝氣45 min/停曝15 min的間歇曝氣下可保持穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)。Li等采用高通量測序?qū)赡ど锓磻?yīng)器系統(tǒng)中的微生物群落進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在好氧MBR池中Proteobacteria的豐度最高，其次是Bacteroidetes和Firmicutes。已有研究表明Proteobacteria和Bacteroidetes是MBR中活性污泥和生物膜內(nèi)的主要菌群，F(xiàn)irmicutes是厭氧環(huán)境下重要的反硝化菌。同時(shí)，國內(nèi)外不少報(bào)道也指出，大多數(shù)具有COD去除以及反硝化除磷功能的微生物均來自于Proteobacteria，另外Firmicutes和Bac-teroidetes也在系統(tǒng)中占據(jù)一定的比例，對(duì)廢水中氮的去除以及維持系統(tǒng)的穩(wěn)定也具有較大貢獻(xiàn)。Pates-cibacteria是一種新型菌群，在本試驗(yàn)中可能具備有機(jī)物利用和反硝化功能。Chloroflexi在污泥中有良好的脫氮除磷作用，常存在于菌膠團(tuán)內(nèi)部，可促成絮體顆粒污泥的形成。

本研究MBR穩(wěn)定運(yùn)行過程中，在各工況下膜池活性污泥混合液樣品中均檢測到相對(duì)豐度較高的功能性除磷微生物以及反硝化菌，其有利于MBR脫氮除磷；同時(shí)，MBR間歇曝氣（工況3-工況5）時(shí)溶解氧濃度為0.47-3.50 mg·L-1，此時(shí)好氧、缺氧和厭氧狀態(tài)同時(shí)存在，進(jìn)一步為反硝化菌提供了有利條件。整個(gè)運(yùn)行期間工況2的反硝化菌Proteobacteria相對(duì)豐度最低（26.9%），脫氮效果相對(duì)較差，NH+4-N和TN去除率僅為36.4%和53.8%，出水含氮濃度最高（表3）。工況3-1況5的微生物群落結(jié)構(gòu)逐漸集中化，此時(shí)優(yōu)勢(shì)菌群逐漸富集且微生物群落越來越穩(wěn)定，而競爭能力弱的菌群逐漸減少。工況4和工況5的運(yùn)行參數(shù)為反硝化細(xì)菌提供了良好的生存條件，使反硝化細(xì)菌逐漸富集并淘汰弱勢(shì)菌群，高效進(jìn)行脫氮除磷，因而TN去除率超過83.7%，TP去除率超過89.0%，出水水質(zhì)較好且穩(wěn)定。Ryu等也報(bào)道了MBR穩(wěn)定運(yùn)行后Proteobacteria逐漸富集占主導(dǎo)，相對(duì)豐度最高（33.1%）且參與去除氮、磷污染物。Ittisupornrat等采用MBR研究不同SRT下微生物種群結(jié)構(gòu)，結(jié)果與本試驗(yàn)一致，即不論SRT大小，Proteobacteria均最具主導(dǎo)地位且在有機(jī)物和氮、磷去除過程中發(fā)揮重要作用，而COD和TP的去除率分別為47.4% -79.4%和17.8%-69.7%，均低于本試驗(yàn)，可能是Ittisupornrat等的試驗(yàn)進(jìn)水濃度較低（342-5 253 mg·L-1）、MBR中污泥濃度低（1.7 g·L-1）以及運(yùn)行參數(shù)不同所致。

試驗(yàn)中相對(duì)豐度增加的菌群Proteobacteria、Fir-micutes和Bacteroidetes均與COD代謝有關(guān)，工況4和工況5對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，提高了微生物多樣性，有利于去除COD相關(guān)微生物的富集，進(jìn)而促進(jìn)污水中有機(jī)物降解，因此MBR對(duì)COD的去除率穩(wěn)定在96.4%以上，出水COD濃度較低。Li等通過高通量測序分析MBR微生物群落結(jié)構(gòu)的研究也得出類似結(jié)論：優(yōu)勢(shì)菌門Proteobacteria和Bacteroidetes是降解COD的主要菌群，且系統(tǒng)內(nèi)好氧和厭氧環(huán)境進(jìn)一步促進(jìn)了COD的去除率（COD去除率超過90%），同時(shí)運(yùn)行參數(shù)SRT對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

2.4.2 綱水平上微生物群落組成及豐度變化

如圖5所示，不同工況樣品在綱水平的菌群相對(duì)豐度發(fā)生變化，但優(yōu)勢(shì)菌綱Gammaproteobacteria（γ -變形菌綱）、Bacteroidia（擬桿菌綱）和Clostridia（梭菌綱）保持不變，3種優(yōu)勢(shì)菌綱的相對(duì)豐度分別為10.1%-61.0%、10.1%-32.9%和8.0% -23.1%，且三者的豐度占總細(xì)菌的46.7%-82.1%。

對(duì)綱水平下變形菌門的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（表6），本試驗(yàn)變形菌門的功能性微生物主要集中在Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria（α-變形菌綱）和Deltaproteobacteria（δ-變形菌綱）。當(dāng)MBR由工況1運(yùn)行到工況2時(shí)，Gammaproteobacteria的相對(duì)豐度從40.7%減小到15.2%，而Alphaproteobacteria的相對(duì)豐度從3.2%增加到10.3%，這是因?yàn)榇藭r(shí)SRT由30 d延長至45 d，表明SRT是影響變形菌綱相對(duì)豐度變化的關(guān)鍵因素；MBR采用3種間歇曝氣時(shí)Gamma-proteobacteria的相對(duì)豐度為40.4% -60.0%，且在工況4和工況5中維持主導(dǎo)地位，MBR除磷效果也逐漸提升，而Alphaproteobacteria的相對(duì)豐度基本維持在1.6%- 1.9%；5種工況下Deltaproteobacteria的相對(duì)豐度基本維持在1.0%-1.4%。試驗(yàn)中Gammaproteobac-teria和Alphaproteobacteria表現(xiàn)出顯著的群落變化，這主要取決于SRT和曝氣周期的變化。

Gammaproteobacteria是變形菌門中豐度最大的功能性除磷菌綱（10. 1%-61.0%），其在釋磷吸磷過程中發(fā)揮了重要作用，使得MBR實(shí)現(xiàn)較好的除磷效果（TP去除率為88.5%±8.2%），出水TP濃度穩(wěn)定在3.4-5.7 mg·L-1。Alphaproteobacteria和Deltaproteo-bacteria是變形菌門中的一個(gè)類群，在廢水脫氮處理中也起著重要作用。同樣，Ittisupornrat等研究不同SRT下MBR微生物種群時(shí)也發(fā)現(xiàn)Alphaproteobac-teria和Deltaproteobacteria在變形菌門中占主導(dǎo)地位。G ammaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Deltapro-teobacteria具有較好的反硝化能力，其大量富集有利于系統(tǒng)脫氮。

2.4.3 屬水平上微生物群落組成及豐度變化

屬分類水平上，5種工況分別檢測到395、452、405、335個(gè)和325個(gè)屬，活性污泥微生物組成在屬水平的分布如圖6所示，改變MBR運(yùn)行參數(shù)，膜池活性污泥混合液中微生物菌屬組成發(fā)生了顯著變化。工況1和工況3的優(yōu)勢(shì)菌屬為Ottowia（奧托氏菌屬，相對(duì)豐度分別為20.7% - 39.0%和11.8%-54.7%）和DMER64（相對(duì)豐度分別為5.4%- 10.8%和0.7%-11.6%）。工況4和工況5主要為Ottowia，相對(duì)豐度分別為48.7 %-52.3%和52.5%- 54.8%。而工況2隨著SRT延長至45 d，優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生顯著變化，這可能是膜池污泥濃度逐漸增大所致?？梢?，MBR在工況1-工況3改變SRT、曝氣方式后膜池活性污泥混合液內(nèi)物種組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯差異，而在工況4和工況5延長HRT以及縮短曝氣和停曝時(shí)間后微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征基本相似。

Ottowia是MBR內(nèi)主要的反硝化菌，工況4和工況5的Ottowia相對(duì)豐度均在50%左右，此時(shí)TN去除率均在83%以上，而工況2對(duì)TN的去除率降低至53.8%，這可能是因?yàn)楣r2時(shí)SRT由30 d增加到45d，反硝化菌屬Ottowia相對(duì)豐度顯著降低（P＜0．05），這表明MBR的脫氮效率與優(yōu)勢(shì)反硝化菌的相對(duì)豐度密切相關(guān)。卞含笑等采用中試MBR處理豬場沼液試驗(yàn)中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Nitrosomonas（亞硝化單胞菌），不同于本試驗(yàn)優(yōu)勢(shì)菌屬的原因可能是因?yàn)楸搴Φ乳_展的部分亞硝化、厭氧氨氧化反應(yīng)研究，有效促進(jìn)了硝化細(xì)菌Nitrosomonas的產(chǎn)生和富集，而本試驗(yàn)曝氣周期形成硝化反硝化活動(dòng)有利于反硝化菌Ottowia的高效富集，從而造成兩個(gè)試驗(yàn)不同的脫氮效果，本試驗(yàn)TN去除率是卞含笑等試驗(yàn)結(jié)果的1.8倍。Sui等采用序批式MBR處理豬場污水試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)反硝化菌（Pseudomonas、Flavobacterium、Thermomo-nas、Paracoccus和Thauera等）的種類和多樣性較本試驗(yàn)更豐富，具備更強(qiáng)反硝化能力，因此TN去除率比本試驗(yàn)高7.5%。可見，污水高效脫氮效果依賴于反硝化菌的種類和相對(duì)豐度。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)DMER64菌屬的相對(duì)豐度為0.3% -11.6%，作為一種產(chǎn)氫菌，其微生物機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

不同工況下進(jìn)水水質(zhì)和活性污泥菌屬的RDA分析如圖7所示，進(jìn)水COD、NH+4-N、TN和TP的濃度均會(huì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。相較于進(jìn)水COD濃度，進(jìn)水NH+4-N、TN和TP濃度對(duì)微生物群落的影響相對(duì)較小。進(jìn)水COD濃度與Prevotella_1、Hydrogenibacillus和Acholeplasma呈負(fù)相關(guān)，而與Ottowia、Fastidiosipila、Truepera和DMER64等優(yōu)勢(shì)菌屬呈正相關(guān)，表明這些功能性微生物能夠適應(yīng)高濃度有機(jī)污水的沖擊，維持系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行。優(yōu)勢(shì)菌屬Ottowia與4種水質(zhì)指標(biāo)的去除率呈正相關(guān)，表明Ottowia相對(duì)豐度越高，污染物去除率越高。Prevotella_1、Hydrogenibacillus和Acholeplasma與NH+4-N、TN和TP的去除率呈正相關(guān)，表明此3個(gè)菌屬的相對(duì)豐度越高，系統(tǒng)脫氮除磷效果越好。

綜上，MBR運(yùn)行采用最佳參數(shù)（SRT、曝氣周期和HRT等）能引起功能性菌群組成及豐度變化、有利于優(yōu)勢(shì)菌群富集，菌群結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一種動(dòng)態(tài)的演替過程。MBR污染物去除效果與優(yōu)勢(shì)菌群密切相關(guān)，優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度越高，MBR的污染物去除效果越好。

3 結(jié)論

（1）膜生物反應(yīng)器（MBR）處理高濃度奶牛養(yǎng)殖污水的最佳運(yùn)行參數(shù)：污泥齡（SRT）為30 d、水力停留時(shí)間（HRT）為96 h、曝15 min/停10 min，此時(shí)COD、NH+4-N、TN和TP的去除率分別為97．0%±0．5%、90.4%±1.3%、85.5%±1.8%和89.6%±5.6%，處理出水中4種水質(zhì)指標(biāo)濃度分別為（224±56）、（45±8）、（105±19）mg·L-1和（4±2）mg·L-1，運(yùn)行期間部分處理出水的COD濃度達(dá)到農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求，此最佳參數(shù)有利于微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行。

（2）污水脫氮除磷效率與反硝化除磷菌的種類、相對(duì)豐度密切相關(guān)。優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria、Fir-micutes和Bacteroidetes，此3種反硝化除磷菌的豐度占總細(xì)菌70.7%- 89.5%，優(yōu)勢(shì)菌屬Ottowia的相對(duì)豐度可達(dá)54.8%，能保證MBR高效的脫氮除磷效果。

（3）調(diào)整SRT、曝氣周期以及HRT等運(yùn)行參數(shù)均可改變MBR內(nèi)微生物多樣性、菌群結(jié)構(gòu)，提高優(yōu)勢(shì)微生物在總菌群中占比，從而有利于提高污水處理效果和出水水質(zhì)。

（責(zé)任編輯：李丹）

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（ASTIP-CAAS）