麥飯石和硝酸鉀添加對石油污染土壤的生物修復作用

摘要：為研究麥飯石和硝酸鉀對石油污染土壤的生物修復作用，本試驗通過向石油污染土壤中投加麥飯石和硝酸鉀，比較了兩種修復劑對不同污染時長土壤中石油烴的去除作用和毒性抑制效果。結果表明：對于新污染土壤，施加硝酸鉀和麥飯石修復110d后，總石油烴（Total petroleum hydrocarbon，TPH）的去除率分別為12.03%和17.09%。其中，施加硝酸鉀修復45d時主要增強了土壤微生物的硝化潛力，修復后期（第46-110天）主要通過強化好氧反硝化作用實現對TPH的去除。對于陳舊性污染土壤，投加硝酸鉀和麥飯石修復110d后，TPH去除率分別為24.41%和22.07%，石油烴的去除主要發(fā)生在修復后期（第46-110天）。陳舊性污染土壤中添加硝酸鉀提高了土壤微生物固氮和硝化潛力。麥飯石的添加對不同污染時長土壤中石油烴的去除主要通過吸附作用實現。蚯蚓急性毒性實驗結果表明，麥飯石處理組蚯蚓7d平均死亡率為35%，顯著低于對照組的60%和硝酸鉀處理組的100%死亡率，表明施入硝酸鉀修復顯著增強了土壤的生態(tài)毒性，施人麥飯石可降低石油污染土壤的生態(tài)毒性。研究表明，相比硝酸鉀，麥飯石兼具石油烴去除和降低土壤生態(tài)毒性的作用，可作為一種優(yōu)質修復劑處理石油污染土壤。

關鍵詞：石油污染土壤；生物刺激；生態(tài)毒性；麥飯石；硝酸鉀

中圖分類號：X53 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）09-2014-08 doi：10.11654/jaes.2023-0894

隨著工業(yè)化的快速發(fā)展，石油作為一種戰(zhàn)略性能源的需求量日益增加。在石油的開采、運輸、儲存和加工等環(huán)節(jié)不可避免地存在漏油事故，從而造成土壤污染。石油污染不僅對土壤理化性質和生物造成直接危害，同時可以通過生物鏈傳遞至人類，對人體健康造成風險。

石油烴外源碳大量進入土壤導致氮、磷營養(yǎng)的相對不足，制約了土壤微生物的生長和代謝活性，繼而影響了其對石油烴的降解能力。投加氮磷營養(yǎng)等生物刺激劑是一種廣泛應用的石油污染場地生物修復技術，營養(yǎng)鹽的加入提升了土著微生物對石油污染物的分解代謝效率，進而實現污染物的去除。一些研究結果表明，向石油污染土壤中施入NH4Cl、KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4和尿素[CO（NH2）2]等氮源均可有效降低土壤總石油烴（Total petroleum hydro-carbon，TPH）污染水平。然而，外源氮的施入在去除土壤TPH的同時，也增加了土壤的生態(tài)毒性。因此，尋找新型的兼具良好石油烴去除效果和低生態(tài)毒性的生物刺激劑十分必要。

麥飯石是一種天然無機硅酸鋁礦物，具有獨特的孔道性質和較大的比表面積，對于污染物具有一定的吸附和絡合作用。麥飯石對生物無毒、無害并具有一定的生物活性，能促進有機碳和氮的降解。目前利用麥飯石進行土壤和水體中重金屬污染修復的文獻較多，但對于利用麥飯石修復石油污染土壤及抑制污染物毒性的作用機制研究有待進一步深入。

本試驗選取硝酸鉀和麥飯石作為生物刺激劑，以陜北靖邊地區(qū)石油污染土壤為研究對象，利用盆栽實驗比較研究了投加麥飯石和硝酸鉀對污染土壤中石油烴的去除效果和生態(tài)毒性抑制作用，同時對修復過程中土壤理化性質及微生物數量變化情況進行分析，探究了兩種生物刺激劑對石油烴的去除機制和生態(tài)毒性抑制效果，以期為陜北油田區(qū)污染土壤的修復治理提供一定的理論基礎和方法參考。

1 材料和方法

1.1 石油污染土壤

陳舊性污染土壤取自陜西省延安市靖邊縣某油井附近，污染年限超過5a。土樣經風干、除雜、破碎、過2 mm篩混勻后部分用于測定TPH含量（32 000mg·kg-1）和土壤理化指標及進行修復實驗，其余置于4℃保存?zhèn)溆谩ｊ惻f性污染土壤理化性質：TPH（31 990±40） mg·kg-1（超聲萃取-重量法）；氨態(tài)氮（2.71±0.25） mg·kg-1（連續(xù)流動分析儀）；硝態(tài)氮（3.84±0.21） mg·kg-1（紫外分光光度法）；有效磷（1.14±0.12） mg·kg-1（碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法）；pH 8.38±0.02（pH電極法）；含水率（3.50±0.10）%（稱質量的方法）；土壤微生物數量I.OIX108±4.50×106cfu·g-1（流式細胞術）。同時在附近取潔凈的未受污染土壤[石油烴含量低于背景值（500 mg·kg-1）]，密封儲存于聚乙烯袋中帶回實驗室。

新污染土壤的制備：使用一定量正己烷溶解150g原油（所用石油為長慶油田采油六廠原油，屬于石蠟基輕質原油）并噴灑于3.0 kg潔凈土壤，攪拌混勻30 min后置于室溫下老化7d。老化后測定土壤TPH含量（TPH測定值為44 980 mg·kg-1）和理化指標，同時進行修復實驗。

1.2 麥飯石

供試麥飯石取自陜西省洛南縣華南生態(tài)農業(yè)科技開發(fā)有限公司。麥飯石的主要成分為：Si0264.60%; Al2o3 17.98%; Fe2O3 2.69%; K2O 3.85%; Na2O6.44%：CaO 0.64%： MgO 1.08%; P2O5 0.079%。

1.3 修復方案

分別利用硝酸鉀和麥飯石作為生物刺激劑對新污染土壤和陳舊性污染土壤進行連續(xù)110 d的生物修復，具體修復方案如表1所示，每個處理3個重復。定期向土壤中加入滅菌超純水以保持土壤含水率為15%，同時每3d翻動一次以增加土壤氧含量。

1.4 分析測定方法

1.4.1 土壤石油烴的提取和測定

利用超聲波萃取土壤中TPH并用稱質量的方法進行測定，具體步驟為：取定量待測土樣置于通風櫥風干研磨后，準確稱取5.0 g于50 mL離心管內，加入25 mL萃取液（正己烷：二氯甲烷=1：1）。冰浴條件下利用超聲波細胞破碎儀（JY96-ⅡN，寧波新芝生物科技股份有限公司）超聲萃取10 min，功率為180 w。在4℃條件下，以8 000 r·min-1離心15 min，使用定量濾紙過濾并收集濾液于恒質量的30 mL稱量瓶。重復上述操作兩次，合并濾液并置于通風櫥內風干。利用恒質量計算得到石油污染土壤中的TPH含量和降解率（η，%），具體見公式1。

η=（W1-W2）/W1×100%（1）

式中：W1為土樣中石油烴的初始含量；W2為不同處理土樣中石油烴的殘留含量。

1.4.2 土壤微生物數量的測定

利用流式細胞術測定土壤微生物數量，詳細步驟包括：稱取1.0 g土樣于10 mL離心管內，加入9.0mL PBS緩沖液上下振動10次，使土壤與緩沖液充分混合。將其放入恒溫水浴振動培養(yǎng)器（150 r·min-1，25℃）中振蕩培養(yǎng)30 min，隨后取出靜置20 min。使用5μm無菌濾頭過濾2 mL上清液，得到土壤細菌提取液。吸取20 μL提取液于1.5 mL無菌離心管，加入980 μL PBS緩沖液，手動振搖5次。隨后轉移5.0 μL于1.5 mL無菌離心管中，依次加入490 μL PBS緩沖液和5.0 μL SC／PI染色溶液（PI染料濃度為5 mg·L-1，SG染料濃度為在原液基礎上稀釋1 000倍）。35℃恒溫金屬浴中溫育15 min，期間避免光照。最后利用流式細胞儀（Accuri C6，美國BD）測定總細菌數量，以高溫滅活的菌懸液進行SG/PI染色后測定的結果作為陰性對照。

1.4.3 土壤碳氮轉化功能基因豐度的測定

土壤DNA的提?。簻蚀_稱取0.25 g土樣，利用DNA抽提試劑盒（B618763-0100，上海生工生物工程有限公司）按照操作說明進行土壤基因組DNA的提取。利用微量分光光度計（ND-2000，美國Thermo）測定土壤基因組DNA濃度（ng·μL-1）和純度，為后續(xù)qP-CR反應體系所需DNA添加量提供參考。

qPCR上機測定：以提取的DNA作為反應模板，使用SYBR染料進行實時熒光定量PCR反應（BioradIQ5，美國伯樂），總反應體系為20 μL，其中包括10μL 2×SYBR real-time PCR premixture（Biorad IQ5，美國伯樂）、上下游引物各0.5 μL、DNA模板5μL、ddH2O 4 μL，每個樣品3個重復。

1.4.4 土壤pH值的測定

采用電極法測定土壤pH。向50 mL離心管中加入10.0 g待測土樣及25 mL無二氧化碳蒸餾水，磁力攪拌1 min后靜置30 min，澄清后利用校準過的pH計（PHS-3CT，上海雷磁）進行pH測定。

1.4.5 土壤氮素的測定

分別采用靛酚藍比色法和紫外分光光度法對石油污染土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮進行測定。

1.4.6 蚯蚓急性毒性實驗

實驗用赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）購于陜西省西安市某花鳥市場。選擇環(huán)帶顯著、大小相近、體質量在300-400 mg之間的成蟲作為實驗用。蚯蚓經流水沖洗體表泥垢后，置于濕潤的濾紙上，放入干凈的蚯蚓飼養(yǎng)盒中清腸，每盒蚯蚓30條，12 h后再次利用流水沖洗蚯蚓體表排泄物與分泌物，選取健康有活力的蚯蚓使用濾紙擦拭干凈稱質量后作為實驗蚯蚓。將清腸完畢并稱完質量的10條實驗蚯蚓放入各處理土壤中進行毒性實驗，每天觀察蚯蚓的活動狀態(tài)。在第7天和第14天倒出實驗土，撥動土壤找出蚯蚓，刺激蚯蚓頭尾若無反應則認定為死亡，為避免對其他蚯蚓生長產生影響，死亡蚯蚓直接丟棄，記錄存活蚯蚓數量，清洗干凈后稱取質量。死亡率（S）及體質量抑制率（Ⅳ）計算如公式2和公式3。

S=（10-H）/10×100%（2）

N=[（W/10-Y/H）/W/10]×100%（3）

式中：H為第7天或第14天存活蚯蚓數量；Ⅳ為人士前蚯蚓總體質量；Y為第7天或第14天存活蚯蚓的總體質量。

2 結果與討論

2.1 麥飯石和硝酸鉀添加對土壤TPH的修復效果

向新污染土壤（污染7d）和陳舊性污染土壤（污染Sa以上）中分別加入麥飯石和硝酸鉀作為修復劑進行110d的處理，TPH的去除效果如圖1a和圖1b所示。

分析可知，對于新污染土壤，在110 d的周期內，麥飯石修復處理（MFGX）對TPH的去除效果最好，TPH含量由45 230 mg·kg-1降低至37 500 mg·kg-1，TPH去除率為17.09%；硝酸鉀處理（WJGx）和自然放置（CKGx）的土壤中TPH分別由44 980 mg·kg-1和44 280 mg·kg-1降低至39 570 mg·kg-和39 880 mg·kg-1，TPH去除率分別為12.03%和9.94%。硝酸鉀對新污染土壤TPH的去除效果不顯著。

對于陳舊性污染土壤，修復110 d時，硝酸鉀修復處理（WJDj）對TPH去除效果最好，TPH含量由32 820 mg·kg-1降低至24 810 mg·kg-1，去除率為24.41%，麥飯石修復處理（MFDj）的TPH含量由32 720 mg·kg-1降低至25 500 mg·kg-1，去除率為22.07%，說明對于陳舊性污染土壤，硝酸鉀和麥飯石的加入均可對石油烴起到有效去除作用。自然放置處理（CKDj）的TPH去除率僅為2.94%，效果顯著低于硝酸鉀和麥飯石處理。

2.2 不同修復劑對土壤理化性質和微生物數量的影響

2.2.1 土壤pH值變化

由圖2分析可知，對于新污染土壤，硝酸鉀修復處理顯著降低了土壤pH值，與未經修復處理的土壤相比，pH值總體上降低了0.5個單位，而麥飯石修復處理對土壤pH值無顯著影響。對于陳舊性污染土壤，與自然放置處理相比，硝酸鉀修復處理的土壤pH值降低了0.04-0.25個單位，麥飯石修復處理的土壤pH值總體上無顯著變化。

硝酸鉀作為生物刺激劑進入土壤后（WJGx處理），土壤pH值顯著下降（圖2），造成這一結果的原因可能與土壤中離子交換過程相關。與之相反，麥飯石作為一種天然硅酸鹽礦物，對污染土壤的pH值未造成顯著影響。

2.2.2 土壤中氮素變化

由圖3a分析可知，硝酸鉀修復處理的新污染土壤中，硝態(tài)氮含量由初始值3.84 mg．kg-1增加至1 049.65 mg·kg-1，修復0-14 d時，硝態(tài)氮含量由1 049.65 mg·kg-降低至341.87 mg·kg-1；修復15-45 d時，硝態(tài)氮含量增加至1 247.4 mg·kg-1；在45 d后含量迅速降低并穩(wěn)定至363.81 mg·kg-1。麥飯石修復處理的土壤中，硝態(tài)氮含量無顯著變化，在0.5 -4.0 mg·kg-1范圍內波動。

由圖3b，分析可知，硝酸鉀修復處理的陳舊性污染土壤硝態(tài)氮含量由初始值3.84 mg·kg-1增加至978.19mg·kg-1，修復第45天之前，硝態(tài)氮含量基本不變，在第45天后，硝態(tài)氮含量迅速降低，修復第110天時降低至212.19 mg·kg-1。麥飯石修復的處理中，土壤硝態(tài)氮含量無顯著變化，在1.0-6.0 mg·kg-1范圍內波動。

由圖3c和圖3d分析可知，新污染和陳舊性污染土壤中的銨態(tài)氮含量在0.5-10.5 mg·kg-1和1.0-11.0mg·kg-1范圍內變化。與自然放置相比，加入硝酸鉀和加入麥飯石對土壤銨態(tài)氮含量無顯著影響。

土壤硝態(tài)氮含量在修復45-110 d時顯著降低，與TPH含量變化情況一致。由此推測，修復45 d時土壤微生物開始大量利用硝酸鹽通過同化或異化的方式清除石油污染物。有文獻報道土壤微生物可以以硝酸鹽為電子受體，TPH為電子供體進行污染物代謝。土壤銨態(tài)氮含量在0-7 d時增加，可能是由于土壤含水量（15%）和含氧量（翻土）的增加促進了土壤中微生物將有機氮逐步轉化為無機氮，從而使得銨態(tài)氮含量增加。

2.2.3 土壤微生物數量變化

由圖4a分析可知，新污染土壤硝酸鉀修復處理在45-75 d內，微生物數量顯著增加，在修復第45天和第75天時分別是麥飯石修復處理的5.9、6.0倍是自然放置處理的3.0、3.0倍。微生物數量增加的原因可能是經過45 d富硝酸鉀環(huán)境，土壤中與硝化／反硝化相關的微生物大量增殖。在第110天時加入硝酸鉀修復的土壤中微生物數量減少，此時土壤硝態(tài)氮含量較少（圖3a），無法為大量的氮轉化相關微生物提供營養(yǎng)。

由圖4b分析可知，硝酸鉀修復14-75d時，陳舊性污染土壤微生物數量均顯著高于加入麥飯石處理和自然放置處理，在修復第14天土壤微生物數量分別增加了5.6、2.7倍，第75天時分別增加了3.3、4.1倍。

上述分析表明，在對新污染和陳舊性污染土壤修復時，硝酸鉀添加增加了土壤微生物數量，且在修復45-110 d時以好氧反硝化菌的增加為主；麥飯石添加對新污染土壤和陳舊性污染土壤中的土壤微生物數量變化無明顯影響。然而，麥飯石添加對新污染土壤中的TPH去除效果顯著，推測可能是麥飯石具有的獨特蜂窩狀孔洞結構，對TPH的吸附作用較強。

2.3 土壤中降解功能基因豐度

對不同修復處理0、45、110 d土壤中的3種石油烴降解功能基因和3種氮轉化功能基因進行測定，結果如圖5所示。分析可知，新污染土壤中的鏈烷烴單加氧酶基因（AlKBPp）和亞硝酸鹽還原基因（NirK）豐度最高，分別為8.3×05-2.8×107 copy.g-1和3·6×105-2.9×109 copy·g-1；對于陳舊性污染土壤，修復0d和45d時，烷烴單加氧酶基因（AM）豐度最高（7.8×105copy·g-1），修復110 d時，AIKBPp豐度最高（8.7×106copy·g-1），3種氮轉化功能基因中，NirK豐度最高，為7.6×105- 1.3×109 copy·g-1。

與自然放置的土壤相比，硝酸鉀修復處理對新污染土壤中石油烴降解功能基因無明顯影響，使陳舊性污染土壤中石油烴降解功能基因豐度增加。麥飯石修復處理中石油烴降解功能基因豐度無明顯變化，新污染土壤中NirK基因豐度明顯增加，說明麥飯石的添加增強了新污染土壤中的微生物固氮潛力，但對其他氮轉化功能影響不顯著。

總體上，向石油污染土壤中添加硝酸鉀進行生物修復，使得新污染土壤中微生物的硝化潛力以及好氧反硝化作用增強。硝酸鉀在提高土壤微生物硝化潛力的同時，也提高了土壤微生物的氨化潛力和固氮性能。麥飯石提高了新污染土壤中微生物的固氮性能和硝化潛力，而對于陳舊性污染土壤，添加麥飯石則提高了土著微生物的氨化潛力。

2.4 土壤的生態(tài)毒性

對修復110 d的污染土壤進行蚯蚓急性毒性實驗，記錄蚯蚓死亡數（圖6a）和體質量變化（圖6b）情況。

在自然放置的新污染土壤中，蚯蚓體質量抑制率和死亡率分別為61%和30%。硝酸鉀修復處理的土壤中，蚯蚓體質量抑制率和死亡率均為100%，顯著高于自然放置的土壤。麥飯石修復處理的土壤中，蚯蚓體質量抑制率和死亡率分別為41%和5%，低于自然放置處理。自然放置的陳舊性污染土壤中，蚯蚓的體質量抑制率和死亡率分別為90%和70%，硝酸鉀修復處理土壤中的蚯蚓體質量抑制率和死亡率均為100%，麥飯石修復處理土壤中的蚯蚓體質量抑制率和死亡率分別為67%和35%，顯著低于自然放置處理。

施入硝酸鉀顯著增加了土壤的生態(tài)毒性．可能是由于土壤中的石油烴初始含量較大，為保持土壤碳氮比為100：10，加入的硝酸鉀含量過高（初始硝氮含量超過1 000 mg·kg-1）。另外，與具有強氧化性的硝酸鉀接觸后，蚯蚓體壁可能發(fā)生潰爛，進而影響蚯蚓的生長活性。施入麥飯石顯著降低了土壤的生態(tài)毒性，可能是由于麥飯石對生物無毒、無害，并含有大量動植物生長所需的營養(yǎng)物質，且對土壤酸堿度具有雙向調節(jié)性，因此可對土壤中石油烴的毒性起到消減或抑制作用。

3 結論

（1）與自然放置的污染土壤相比（TPH自然降解率為2.94%），加入麥飯石或硝酸鉀均可促進土壤中石油烴的去除。對于新污染土壤，添加麥飯石對石油烴的修復效果優(yōu)于硝酸鉀，修復110d時TPH去除率分別為12.03%（硝酸鉀）和17.09%（麥飯石）。對于陳舊性污染土壤，添加硝酸鉀和麥飯石對TPH的修復效果接近，修復110 d時的TPH去除率分別為24.41%和22.07%。

（2）硝酸鉀主要通過提高土壤微生物的固氮和硝化潛力實現TPH的去除，麥飯石對土壤TPH的去除可能是通過吸附作用。施入硝酸鉀修復石油污染土壤增加了土壤的生態(tài)毒性，施入麥飯石可顯著降低土壤中石油烴的生態(tài)毒性。

基金項目：國家自然科學基金項目（52070154）；陜西省科技廳重點研發(fā)計劃項目（2023-YBNY-251）