CXCL趨化因子在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

[關鍵詞] 趨化因子； 生物信息學； 頭頸部鱗狀細胞癌； 預后； 免疫浸潤

[中圖分類號] R739.81 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/gjkq.2024012

頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamouscell carcinoma，HNSCC） 是世界上第六大最常見的惡性腫瘤，全世界每年有超過50萬例HNSCC新發(fā)病例，每年有超過14萬人死于HNSCC[1]。目前，治療HNSCC的主要方法是手術切除及輔助放射和化學治療。雖然在手術、放射和化學治療方面取得了較大進展，但目前HNSCC患者的總生存率沒有顯著改善。HNSCC具有侵襲性生長、遠處轉(zhuǎn)移、術后復發(fā)率高、預后差的特點，其發(fā)生和發(fā)展是受多因素影響的復雜過程[2]。因此，早期診斷和有效評估預后對于改善HNSCC生存率具有重要意義。

趨化因子是細胞分泌的小分子細胞因子或信號蛋白，相對分子質(zhì)量?。s810 kDa），主要由4個亞家族組成：CXC、CC、CX3C和XC，趨化因子通過與G蛋白連接的跨膜受體（趨化因子受體）相互作用發(fā)揮其生物學效應，并參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3-4]。其中CXC趨化因子配體（chemotactic ligand，CXCL） 家族參與調(diào)節(jié)免疫細胞活性、誘導腫瘤細胞遷移、調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖和腫瘤微血管形成，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。CXCL家族包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4 （PF4） 、CXCL5、CXCL6、CXCL7（PPBP）、CXCL8 （IL8）、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16和CXCL17，已有研究[6]表明部分CXCL趨化因子家族成員參與HNSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，但CXCL家族在作為HNSCC診斷和預后標志物的作用至今尚未明確。在本研究中，通過利用相關公共數(shù)據(jù)庫及R語言對CXCL在HNSCC中的表達和生存數(shù)據(jù)進行全面的生物信息學分析，闡明整個CXCL家族在HNSCC中的預后價值。

1 材料和方法

1.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/） 基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）3級RNA-seq和31種癌癥類型的臨床數(shù)據(jù)[7]。本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫探討HNSCC組織與正常組織之間CXCL的表達。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫

TCGA是一項包含多種人類腫瘤致癌基因組改變的公共數(shù)據(jù)庫[8]。為確定CXCL趨化因子家族在HNSCC中的表達量， 使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CXCL家族在HNSCC與正常頭頸組織中的表達量。

1.3 GEPIA網(wǎng)站

GEPIA（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index） 是一種新開發(fā)的交互式網(wǎng)站，使用標準流程處理分析來自TCGA和GTEx項目的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)[9]。GEPIA提供腫瘤/正常差異表達分析、根據(jù)腫瘤類型或病理分期進行分析、患者生存分析、相似基因檢測、相關性分析和降維分析。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫

Kaplan-Meier Plotter（ http：//kmplot.com/ analysis/）是最權威的生存分析數(shù)據(jù)庫，能夠評估21種腫瘤中54 000個基因與生存參數(shù)的關系[10]。本研究利用GEPIA數(shù)據(jù)庫評估差異表達的CXCL在HNSCC中的預后價值，并通過K-M生存曲線驗證其相關性。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 TIMER數(shù)據(jù)庫

TIMER （http：//timer. comp-genomics. org/） 數(shù)據(jù)庫是一種評判免疫細胞浸潤及其對疾病影響的分析網(wǎng)站[11]。使用 TIMER數(shù)據(jù)庫預測并評估差異表達的CXCL與HNSCC患者免疫細胞浸潤之間的相關性。

2 結(jié)果

2.1 CXCL趨化因子在HNSCC中的表達情況

基于TCGA數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示CXCL趨化因子在HNSCC組織與正常組織中表達的熱圖（圖1）。與正常組織相比，HNSCC組織中CXCL8 （IL8）、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 和CXCL14高表達（Plt;0.05），CXCL12和CXCL17低表達（Plt;0.05）（圖2），其余CXCL趨化因子在HNSCC組織與正常組織中的表達量差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。

在GEPIA中評估了差異表達CXCL趨化因子和HNSCC患者病理分期之間的相關性，如圖3所示：CXCL9 （P=0.035）、CXCL10 （P=0.004）、CXCL11（P=0.003）、CXCL12 （P=0.02）、CXCL14（P=0.02） 的表達量在HNSCC的4個病理分期中差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。

2.2 CXCL趨化因子在HNSCC患者中的預后價值

通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫探討HNSCC中CXCL趨化因子改變的預后價值，與總體生存期顯著相關的趨化因子共6個，其總生存期（overall"survival，OS） 曲線如圖4所示，結(jié)果表明：CXCL9、CXCL10、CXCL13、CXCL14及CXCL17高表達以及CXCL8低表達的HNSCC患者與更長的OS相關（Plt;0.05）。

2.3 CXCL 趨化因子與HNSCC患者免疫細胞浸潤的相關性

TIMER數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示差異表達的CXCL趨化因子與HNSCC患者免疫細胞浸潤（CD8+T細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及B細胞） 密切相關，其中CXCL9/10/11/14與CD8+T細胞浸潤呈正相關，CXCL12/13/17 與CD8+T細胞浸潤呈負相關（Plt;0.05），CXCL9/10/11/12/13/17與CD4+T細胞浸潤呈正相關，CXCL14與CD4+T細胞浸潤呈負相關（Plt;0.05）；CXCL10/11/14與B細胞浸潤呈正相關，CXCL12與B細胞浸潤呈負相關（Plt;0.05）；CXCL8/9/10/11/12/13與中性粒細胞浸潤呈正相關，CXCL14與中性粒細胞浸潤呈負相關（Plt;0.05）；CXCL9/10/11/13/14與樹突狀細胞浸潤呈正相關，CXCL17與樹突狀細胞浸潤呈負相關（Plt;0.05）；CXCL8/12/13與巨噬細胞浸潤呈正相關，CXCL10/17與巨噬細胞浸潤呈負相關（Plt;0.05）；其余差異表達的CXCL趨化因子與免疫浸潤無顯著相關性。

2.4 HNSCC中CXCL趨化因子的功能富集分析

利用GEPIA和Metascape分析HNSCC患者中差異表達的CXCL8/9/10/11/12/13/14/17的功能、通路富集。如圖5所示：基因功能主要富集在趨化因子活性（chemokine activity）、細胞趨化作用（cell"chemotaxis）、白細胞趨化性的正向調(diào)控（positiveregulation of leukocyte chemotaxis）、鈣離子轉(zhuǎn)運的正向調(diào)控（positive regulation of calcium ion transport）；KEGG通路主要富集在病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用（viral protein interactionwith cytokine and cytokine" receptor）、細胞因子-細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptorinteraction）、TLR信號通路（Toll-like receptorsignaling pathway） 。

2.5 HNSCC患者CXCL趨化因子的基因改變分析

通過cBioportal數(shù)據(jù)庫分析差異表達的CXCL趨化因子在HNSCC患者中的突變情況，如圖6所示：這些差異表達的CXCL趨化因子均發(fā)生了不同比例的突變， 其中CXCL12 突變率最高， 達到2.6%，主要包括基因擴增和突變；CXCL13/14突變率最低為0.4%。通過cBioportal數(shù)據(jù)庫分析了CXCL8/9/10/11/12/13/14/17之間的相關性，結(jié)果如圖6顯示，以下CXCL趨化因子發(fā)生突變關系為正相關。

3"討論

全世界每年有超過250萬人患有HNSCC，每年死亡病例超過37萬例[12]。HNSCC的主要治療方法通常是手術聯(lián)合放射和化學治療，雖然在手術、放射和化學治療方面取得了較大進展，但目前HNSCC患者的總生存率沒有顯著改善。HNSCC具有侵襲性生長、遠處轉(zhuǎn)移、術后復發(fā)率高、預后差的特點，其發(fā)生和發(fā)展是受多因素影響的復雜過程[2]。因此，早期診斷和有效評估預后對于改善HNSCC生存率具有重要意義。

趨化因子是一組結(jié)構(gòu)上相關的小的相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)[13]。這些分子在許多類型細胞的生長、分化和活化中起重要作用。趨化因子主要由白細胞合成，并通過其同源G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用，引起細胞應答，如遷移、黏附和趨化性[14]。趨化因子及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用是調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。臨床研究[15]證明：其中一些趨化因子能夠在轉(zhuǎn)移中促進腫瘤播散，包括腫瘤細胞與內(nèi)皮的黏附、增殖、從血管外滲、血管生成以及保護免受宿主反應。這些蛋白質(zhì)還可能簡化腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME） 內(nèi)惡性細胞和非腫瘤細胞之間的通訊，促進中性粒細胞和腫瘤相關巨噬細胞的浸潤和活化[16]。

本文研究結(jié)果顯示：在HNSCC中趨化因子（CXCL） 存在差異性表達，其中CXCL8/9/10/11/13/14在HNSCC組織中顯著高表達，而CXCL12/17在HNSCC組織中顯著低表達，高表達的CXCL9/10/11/14與低表達的CXCL12同時在HNSCC的不同病理分期中的表達差異存在統(tǒng)計學意義，表明這些CXCL趨化因子在HNSCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有研究[17]表明：CXCL9/CXCR3軸能激活Ca127移植瘤Akt信號通路，誘導裸鼠舌鱗狀細胞癌移植瘤細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，介導癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。通過對CXCL趨化因子生存分析發(fā)現(xiàn)：低表達CXCL9/10/13/14/17以及過表達CXCL8的HNSCC患者與HNSCC不良的臨床結(jié)局相關，提示CXCL趨化因子可作為判定HNSCC預后的標志物。Yorozu等[18]通過對腫瘤內(nèi)高表達CXCL12定量分析顯示：CXCL12表達降低與較差的總生存期相關。以上研究結(jié)果表明：CXCL趨化因子對HNSCC的發(fā)生發(fā)展有一定的作用，具有作為判別病理分期及預后標志物的潛力。

本研究結(jié)果顯示：差異表達的CXCL趨化因子與HNSCC 患者免疫細胞浸潤（CD8+T 細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及B細胞） 密切相關。Wang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)：上調(diào)的CXCL9/10/11-CXCR3A軸可能與口腔白斑病和口腔鱗狀細胞癌中的免疫檢查點及其配體相互作用，影響口腔鱗狀細胞癌CD274和IDO1的浸潤。另外有研究[20]表明：過表達腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（tumor necrosis factor relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL） 可以下調(diào)腫瘤細胞CXCL10的分泌，減少對CD8+T細胞的趨化。CXCL12表達水平與α平滑肌肌動蛋白表達呈負相關， 并與CD8+淋巴細胞浸潤呈正相關。Parikh等[21]的研究發(fā)現(xiàn)：口腔鱗狀細胞癌細胞中較高的CXCL14表達與腫瘤生長減少以及腫瘤浸潤淋巴細胞增加有關，CXCL14在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中下調(diào)，CXCL14介導的免疫浸潤可能阻止侵襲和轉(zhuǎn)移的可能性。

目前，有研究[22-23]證實：CXCL是TME的重要組成部分，CXCL及其受體可以作為化學誘導物引導免疫細胞向TME的浸潤，可促進免疫識別反應，殺傷腫瘤細胞，亦可抑制免疫反應，對腫瘤的生長增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移等有一定的促進作用，對于評估新輔助免疫治療療效有一定的指導作用。CXCL可以參與免疫細胞發(fā)揮抗腫瘤效應，CXCL及其受體作為腫瘤免疫治療靶點，可以指導有前景的免疫治療策略。以上結(jié)果表明：CXCL8/9/10/11/12/13/14/17趨化因子表達與HNSCC免疫細胞浸潤有關，提示CXCL趨化因子可作為HNSCC預測免疫治療療效的生物標志物以及作為腫瘤免疫治療靶點。

通過對CXCL趨化因子在HNSCC中表達的功能富集分析及基因改變情況分析得出：基因功能主要富集在趨化因子活性、細胞趨化作用、白細胞趨化性的正向調(diào)控、鈣離子轉(zhuǎn)運的正向調(diào)控；KEGG通路主要富集在病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用、TLR信號通路。這就提示CXCL趨化因子對HNSCC細胞的作用主要通過以上功能及通路實現(xiàn)，為后續(xù)進一步驗證其相關分子信號通路提供理論基礎。通過基因突變分析得出差異表達的CXCL趨化因子與HNSCC發(fā)生發(fā)展密切相關，有研究[24]表明基因組擴增可作為有前景的預測分子生物標志物并且可以用于靶向治療，本研究結(jié)果中CXCL12突變率最高，主要包括基因擴增和突變，表明CXCL12可能作為未來HNSCC患者基因治療的潛在靶點。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。