高中生物“基因工程”教學(xué)中幾個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題的探討

錢(qián)雪梅

（南京外國(guó)語(yǔ)學(xué)校 江蘇南京 210008）

現(xiàn)代社會(huì)中，生物學(xué)科學(xué)發(fā)展迅猛，基因工程技術(shù)也是日新月異。基于基因工程這部分內(nèi)容在高中教材中的呈現(xiàn)、高考要求，下面對(duì)幾個(gè)高頻出現(xiàn)的問(wèn)題做了整理和簡(jiǎn)要闡述。

（1）自然界中的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，只將其內(nèi)部Ti質(zhì)粒中的一段T-DNA侵入并整合到植物細(xì)胞中的染色體上，其自身并不侵入植物細(xì)胞中，有什么意義？

農(nóng)桿菌侵染的主要是雙子葉植物和裸子植物，當(dāng)植物體細(xì)胞受損傷時(shí)，損傷的部位分泌出酚類(lèi)物質(zhì)，如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮等物質(zhì)。這些酚類(lèi)物質(zhì)可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒中的Vir基因的表達(dá)，且表達(dá)的一部分產(chǎn)物參與將Ti質(zhì)粒上T-DNA片段的一條鏈切下，另一部分產(chǎn)物即與該單鏈T-DNA形成復(fù)合物，保證復(fù)合物的穩(wěn)定性，同時(shí)促進(jìn)其侵入植物細(xì)胞并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。當(dāng)其T-DNA成功插入植物細(xì)胞的染色體組后，其在植物細(xì)胞中表達(dá)并產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素及冠癭堿等物質(zhì)。激素類(lèi)物質(zhì)可促進(jìn)受傷部位的細(xì)胞大量增殖形成冠癭瘤，冠癭堿從瘤細(xì)胞中分泌出去作為農(nóng)桿菌的碳源和氮源，同時(shí)冠癭堿有利于農(nóng)桿菌吸附于植物細(xì)胞壁上，更有利于其得到更多的有機(jī)物，從而更好地進(jìn)行繁殖。

（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，在目的基因前后加裝的啟動(dòng)子和終止子是如何選擇的?

啟動(dòng)子和終止子是基因表達(dá)時(shí)RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)。在體外構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，啟動(dòng)子和終止子通常是已經(jīng)安裝在載體上，只需將目的基因的片段插入到載體中特定的啟動(dòng)子和終止子之間即可。啟動(dòng)子和終止子的選擇直接影響目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)效率?？蒲腥藛T通常是根據(jù)目的基因受體細(xì)胞類(lèi)型，如特定類(lèi)型的細(xì)胞或特定發(fā)育階段的細(xì)胞來(lái)確定。例如，CMV啟動(dòng)子是啟動(dòng)真核基因表達(dá)的強(qiáng)有力啟動(dòng)子，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建真核表達(dá)載體；而構(gòu)建原核表達(dá)載體常用的是T7啟動(dòng)子；若僅讓目的基因在神經(jīng)元中表達(dá)，則可選用神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子（NSE、SYN等）。除此之外，還可選擇受體細(xì)胞中特定時(shí)空表達(dá)的基因啟動(dòng)子和終止子裝入表達(dá)質(zhì)粒中，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的時(shí)空特異性表達(dá)。例如，將人的胰島素基因先導(dǎo)入牛的受精卵中，欲讓其在乳腺細(xì)胞中表達(dá)，則通常選擇牛的乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子和終止子裝載到表達(dá)質(zhì)粒中。

（3）通過(guò)反轉(zhuǎn)錄法合成目的基因需用逆轉(zhuǎn)錄酶，還需要DNA聚合酶嗎？

獲取目的基因的方法有多種。方法之一是以目的基因的mRNA為模板通過(guò)反轉(zhuǎn)錄法合成目的基因，此過(guò)程中用到的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶，不需要DNA聚合酶參與。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，功能強(qiáng)大。主要包括以下幾種活性：①DNA聚合酶活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過(guò)程；②RNase H活性：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，由RNase H從RNA 5′端水解RNA鏈，此過(guò)程也由逆轉(zhuǎn)錄酶完成；③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以反轉(zhuǎn)錄合成的DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成互補(bǔ)的DNA鏈，從而可得到一條雙鏈DNA分子，此過(guò)程也由逆轉(zhuǎn)錄酶完成。除此之外，有些逆轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因能整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于基因工程技術(shù)起了很大的推動(dòng)作用，它已成為一種重要的工具酶在基因工程的具體操作得到廣泛應(yīng)用。

（4）如何在人工合成的目的基因中加入限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)？

通過(guò)反轉(zhuǎn)錄法獲取的目的基因不含有限制酶識(shí)別的序列，那如何將目的基因順利地裝載到載體上去的呢？通常是在對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在設(shè)計(jì)的目的基因引物的兩端分別加裝兩種限制酶的識(shí)別序列，限制酶識(shí)別的序列加在引物的5′端。將這兩種引物加入擴(kuò)增體系中，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的目的基因的兩端即含有兩種限制酶的酶切序列，將來(lái)用特定的兩種酶識(shí)別切割后，在目的基因的兩端即有特定的黏性末端，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)即可與載體形成正向連接的有效表達(dá)載體。

例如，用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖1所示，X為某限制酶識(shí)別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖2所示的類(lèi)型片段。

圖1 引物Ⅰ、Ⅱ與DNA的連接示意圖

圖2 擴(kuò)增后的大部分DNA片段示意圖

利用PCR技術(shù)對(duì)DNA分子中的A1片段擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)引物與母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，子鏈延伸總是從5′端到3′端。通過(guò)兩輪復(fù)制后即可得到圖2的片段，經(jīng)過(guò)若干輪的復(fù)制后得到的DNA片段大多是此類(lèi)。若在PCR擴(kuò)增時(shí)，在引物I的5′加裝另一種酶切序列，則該片段的兩端即有兩種限制酶切序列，加裝有兩種限制酶切序列的目的基因在構(gòu)建基因表達(dá)時(shí)將被有效利用。

（5）科研工作者在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)為何常用雙酶切法處理目的基因和載體？

在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)常用到酶切和酶連的方法，酶切方法包括單酶切和雙酶切。若用同一種限制酶對(duì)目的基因和載體進(jìn)行單酶切，得到的目的基因和載體兩端酶切末端相同，將會(huì)出現(xiàn)目的基因和載體的首尾相連即自身環(huán)化現(xiàn)象；目的基因與質(zhì)粒的正向與反向連接等現(xiàn)象。自身環(huán)化后的DNA片段的出現(xiàn)將大大降低重組質(zhì)粒的形成，而且重組質(zhì)粒中反向連接的機(jī)率有50%，目的基因正向連接的表達(dá)載體能正常表達(dá)產(chǎn)生預(yù)期效果，若反向連接目的基因表達(dá)時(shí)RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)正好是將基因的模板鏈的互補(bǔ)鏈為模板轉(zhuǎn)錄出mRNA，將不可能翻譯出正常的蛋白質(zhì)。為了提升目的基因和載體的正向連接的成功率，基因工程的具體操作中常用雙酶切法來(lái)構(gòu)建基因表達(dá)載體。雙酶切即采用兩種不同的限制酶（非同尾酶、同功酶）同時(shí)對(duì)目的基因和載體進(jìn)行切割，這樣有效防止被切割后的目的基因和載體的自身環(huán)化現(xiàn)象，目的基因和載體正確連接形成表達(dá)載體的比例大大提高。雙酶切法已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中。

（6）基因工程中為何在同一載體上設(shè)計(jì)裝載兩個(gè)標(biāo)記基因？

運(yùn)載體上的標(biāo)記基因是為了鑒定和篩選導(dǎo)入目的基因的重組細(xì)胞。這里以目的基因插入到pBR322的BamH I位點(diǎn)中為例來(lái)加以說(shuō)明：圖3是pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，在pBR322質(zhì)粒含有兩個(gè)抗生素抗性基因（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）；還有單一的BamH I的識(shí)別位點(diǎn)。

圖3 pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

在將此質(zhì)粒載體用BamH I酶切后，與用BamH I酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有含有環(huán)狀目的基因、含有普通質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌3種。

那么，如何從以上多種混合的大腸桿菌中篩選得到所需的含有目的基因的受體細(xì)胞呢？此時(shí)，通常是利用兩種抗生素的抗性基因的特點(diǎn)進(jìn)行篩選。首先將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，只有導(dǎo)入普通質(zhì)粒或重組質(zhì)粒的大腸桿菌能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而沒(méi)有被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和只被環(huán)形目的基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌會(huì)全部死亡。又由于BamH I位點(diǎn)位于四環(huán)素的抗性基因中，插入目的基因后就會(huì)破壞四環(huán)素的抗性基因，四環(huán)素的抗性會(huì)消失，所以成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌將不抗四環(huán)素。接著，把生長(zhǎng)在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的大腸桿菌通過(guò)影印法移到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，若在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上仍能正常的大腸桿菌則導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒的細(xì)菌，而不能生長(zhǎng)的則應(yīng)是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，這些才是成功導(dǎo)入了目的基因的大腸桿菌。據(jù)此可以將兩個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行對(duì)照，再?gòu)牡谝慌囵B(yǎng)皿中挑選出相應(yīng)的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，得到所需的受體細(xì)胞。其實(shí)導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌中也有一半是無(wú)效的，因?yàn)槟康幕虻膬啥损ば阅┒耸窍嗤模缓笤倮孟♂屚坎寂囵B(yǎng)大腸桿菌，根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行判斷。

（7）標(biāo)記基因和報(bào)告基因之間有什么區(qū)別與聯(lián)系？

標(biāo)記基因（marker gene）是一種已知功能或已知序列的基因，其編碼產(chǎn)物能夠使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織具有對(duì)抗生素等的抗性，或者使轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織具有代謝的優(yōu)越性。常用的標(biāo)記基因是一些抗生素抗性基因，如在培養(yǎng)基中加入抗生素等選擇試劑的條件下，非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)受到抑制，而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠繼續(xù)存活，從而將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織從大量的細(xì)胞或組織中篩選出來(lái)。標(biāo)記基因通常用來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化成功與否。

報(bào)告基因（reporter gene）是一種編碼產(chǎn)物容易被檢測(cè)與鑒定的基因，已被克隆且全序列已測(cè)定，在受體細(xì)胞中不存在、也無(wú)相似內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物。通常要把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或者與目的基因連接成融合基因，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。因此，報(bào)告基因不僅也能作為標(biāo)記基因，還能用于研究基因的表達(dá)調(diào)控，檢測(cè)啟動(dòng)子的活性，發(fā)現(xiàn)新的啟動(dòng)子，觀察報(bào)告基因和目的基因的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置等。在植物基因工程研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如熒光素酶基因（luc），不但無(wú)放射性，半衰期短，而且檢測(cè)方法靈敏及簡(jiǎn)單。將報(bào)告基因（熒光酶素基因）與目的基因連接成融合基因，然后構(gòu)建表達(dá)載體，融合基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能保留兩種蛋白質(zhì)各自的功能。

（8）在基因工程中，如何將逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體來(lái)構(gòu)建基因表達(dá)載體的？

基因工程中常用動(dòng)植物病毒及λ噬菌體的衍生物作為載體來(lái)構(gòu)建基因表達(dá)載體，原因是它們有雙鏈DNA分子，可以與目的基因進(jìn)行連接。而目前基因工程中常以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，其優(yōu)點(diǎn)是逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體時(shí)可以將外源基因插入到受體細(xì)胞染色體，使外源基因隨染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，并進(jìn)行表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組（RNA）的核心部分包括三個(gè)基因：gag基因（編碼病毒的核心蛋白）、pol基因（編碼逆轉(zhuǎn)錄酶）、env基因（編碼病毒的表面糖蛋白）。而位于這些基因兩端的有LTR序列（含有啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)基因等），控制著逆轉(zhuǎn)錄基因組核心基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)移。

圖4是構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及用于培育轉(zhuǎn)基因小鼠的流程圖。首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄法將病毒的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)形成雙鏈DNA，將其中的gag、pol、env等3個(gè)核心基因?qū)?yīng)的部分全部切下，并用目的基因替換到相應(yīng)的部位。然后，將通過(guò)以上操作得到的2個(gè)DNA分子分別構(gòu)建基因表達(dá)載體并注入到同一個(gè)特殊的動(dòng)物細(xì)胞中，2個(gè)DNA片段都能在特殊細(xì)胞中表達(dá)。3個(gè)核心基因表達(dá)出病毒的外殼蛋白；含有目的基因的DNA片段能轉(zhuǎn)錄出含有LTR和目的基因的mRNA的RNA片段，在特殊細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒的外殼即可包裝該RNA片段，形成新型的逆轉(zhuǎn)錄病毒即為構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)病毒表達(dá)載體，從而成為一種含有目的基因的具有感染力的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。

圖4 構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及用于培育轉(zhuǎn)基因小鼠的流

這種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體作為一種表達(dá)載體，在侵染了動(dòng)物細(xì)胞后可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄法形成雙鏈DNA并整合到動(dòng)物細(xì)胞的染色體上，從而可以通過(guò)細(xì)胞分裂傳給下一代的子細(xì)胞，并永久性地表達(dá)目的蛋白。