基于嘌呤環(huán)檢測Zn2+的熒光探針及其應用

摘 要： 基于嘌呤-色酮的席夫堿，設計、合成并論述了一種新型的檢測Zn2+的開啟式熒光探針（E）-3-（（2-（8，9-二（萘-1-基）-9H-嘌呤-6-基）腙）甲基）-4H-鉻-4-酮（DPHC）.DPHC在DMSO/HEPES （v/v = 9：1， pH = 7.4）溶液中對Zn2+表現(xiàn)出顯著的選擇性和快速響應，并且伴隨著從無色到淡綠色的顏色變化.DPHC的發(fā)射強度與Zn2+的濃度（1-5 μmol/L）之間存在良好的線性關(guān)系（R2=0.979 92），其檢出限為150.0 nmol/L.Job′s plot和1H-NMR進一步證明了DPHC對Zn2+的傳感機理.

關(guān)鍵詞： 嘌呤-色酮；鋅（II）; 顯著選擇性；快速響應；檢出限

中圖分類號：O657.3"" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1673-4807（2024）02-087-06

Fluorescent probe based on purine for detecting Zn2+ and its application

Abstract：A new “turn-on” fluorescent probe derived from purine-chromone Schiff base （E）-3-（（2-（8，9-di（naphthalen-1-yl）-9H-purin-6-yl） hydrazono） methyl）-4H-chromen-4-one （DPHC） for detecting Zn2+ was designed， synthesized and evaluated. The DPHC exhibited remarkable selectivity and rapid response towards Zn2+ in DMSO/HEPES （v/v=9∶1， pH=7.4）， accompanying with a significant color change from colorless to pale green. A good linear relationship （R2=0.979 92） was obtained between the emission intensity of DPHC and the concentration of Zn2+ （1-5 μmol/L） with low detection limit of 150.0 nmol/L. The sensing mechanism of DPHC to Zn2+ was supported by the Job′s plot and 1H-NMR.

Key words：purine-chromone， Zn （II）， remarkable selectivity， rapid response， low detection

離子在自然界中起著重要的作用，并且是大多數(shù)生命體生長過程中必要的需求.其中，鋅離子（Zn2+）廣泛存在于人體和其他生命體中[1-2].因此，鋅離子是生物體生理功能的重要的微量元素之一[3].然而，過量攝入鋅離子會引起神經(jīng)系統(tǒng)紊亂以及阿爾茨海默癥、免疫缺陷和癲癇等許多其他疾病[4-6].所以，鋅離子的選擇性識別和有效檢測對化學、生物學、臨床醫(yī)學和農(nóng)學等領(lǐng)域的相關(guān)研究具有重要意義[7-8].

有機小分子熒光探針以其靈敏度高、選擇性強、響應時間短、效率高等優(yōu)點引起眾多研究組的關(guān)注[9-13].許多關(guān)于檢測Zn2+的研究被報道[14-21]，但很少有基于嘌呤為母體的例子.嘌呤衍生物在自然界分布廣泛，具藥理活性，是一類重要的抗病毒藥物[22-24].嘌呤衍生物是雜環(huán)化合物，它們是由嘧啶環(huán)和咪唑環(huán)稠合形成的化合物[25-26].它們具有平面剛性結(jié)構(gòu)，含有豐富的氮原子和п-п共軛體系[27-28].因此，嘌呤衍生物可以有效地與金屬離子配位，可以作為熒光探針的重要中間體[29-30].

在此，一種新型的熒光探針被設計、合成，且命名為（E）-3-（（2-（8，9-二（萘-1-基）-9H-嘌呤-6-基）腙）甲基）-4H-鉻-4-酮（DPHC）.DPHC在DMSO/HEPES溶液（9/1， v/v， pH 7.4， HEPES緩沖液，0.2 mmol/L）中對Zn2+具有顯著的選擇性和快速響應，并且顏色可以從無色變?yōu)闇\綠色.通過Job′s plot實驗確定了Zn2+與DPHC的結(jié)合方式為1∶1，并通過密度泛函數(shù)（DFT）和1H NMR進一步認證了絡合機制.

1 實驗

1.1 試劑與儀器

所有試劑：色酮-3-甲醛、二甲基亞砜（安耐吉化學，化學純）；乙醇（上海沃化，工業(yè)級）；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Jamp;K， 化學純）.

所有儀器：BSA124S電子天平、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE 100-pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、79-1磁力攪拌器、UV-3010紫外分光光度計、Bruker-Advance DPX 400核磁光譜儀、Agilent-6110質(zhì)譜儀、Spectrofluorometer FS5熒光光譜儀、PHS-25C pH計.

1.2 合成方法

圖1為將嘌呤衍生物1a（100 mg， 0.25 mmol）與色酮-3-甲醛（65 mg， 0.37 mmol）溶解在乙醇（2 mL）中，然后將混合物回流反應2 h，待反應完全.冷卻至室溫，抽濾，用乙醇洗滌固體，得到淡黃色固體（72 mg， 52 %）.

DPHC的表征：1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ12.19 （s， 1H）， 8.84 （s， 1H）， 8.59 （s， 1H）， 8.35 （s， 2H）， 8.15 （dd， J=7.9， 1.7 Hz， 1H）， 7.98 （t， J=7.4 Hz， 2H）， 7.93-7.82 （m， 3H）， 7.74-7.65 （m， 2H）， 7.58-7.47 （m， 6H）， 7.41 （dd， J=4.7， 1.7 Hz， 2H）， 7.32 （dd， J=8.3， 7.2 Hz， 1H）. 13C NMR （101 MHz， DMSO-d6） δ175.44， 156.23， 154.15， 153.32， 150.88， 134.98， 134.00， 133.39， 131.84，131.50，130.61，130.26，130.10，129.34，128.67 （d，J=6.6 Hz），127.87 （d，J=12.1 Hz），127.43，127.22 （d，J=12.6 Hz），126.86，126.36 （d，J=14.7 Hz），125.74 （d，J=12.2 Hz），125.01，123.85，122.91，119.54，119.16，118.79. ESI-MS： calcd. for" + 559.2，found 559.2.

2 結(jié)果與討論

2.1 DPHC對金屬離子的光學作用

為了研究探針DPHC的金屬離子響應，首先，在DMSO/HEPES的緩沖溶液中，將探針與不同金屬陽離子（Zn2+， Co2+， Ni2+， Al3+， Cr3+， Mn2+， Mg2+， Ba2+， Pb2+， K+， Ca2+， Cs2+， Na+， Ag+， Cd2+， Pd2+， Fe3+ 和 Cu2+）絡合并進行熒光測試.如圖2，在添加Zn2+后，探針會在509 nm處有強發(fā)射，而其他離子并沒有引起發(fā)射增強.另外，通過熒光燈照射可以發(fā)現(xiàn)，探針標樣本身無色，但加入鋅離子后，溶液從無色變?yōu)闇\綠色.

接著，為了進一步探索DPHC對Zn2+的選擇性，在相同體系中進行了競爭實驗.DPHC首先與Zn2+（5 eq）進行絡合，然后分別添加相同當量的其他離子（Co2+， Ni2+， Al3+， Cr3+， Mn2+， Mg2+， Ba2+， Pb2+， K+， Ca2+， Cs2+， Na+， Ag+， Cd2+， Pd2+， Fe3+ 和 Cu2+）（5 eq）.如圖3，在多離子存在情況下，Cu2+具有一定的淬滅作用，而DPHC-Zn2+的熒光強度受其他離子干擾較少.

2.2 DPHC的絡合機制

為了探究DPHC與Zn2+的靈敏度，進行了滴定實驗（圖4）.通過實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在509 nm處DPHC的熒光強度隨著Zn2+的濃度增加而增加，并且在離子達到5個當量時候飽和.如圖5，探針DPHC在509 nm處的熒光強度與Zn2+之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（R2=0.979 92）.通過3Sb1/S公式計算，可以得出DPHC-Zn2+的檢出限為150 nmol/L，這遠遠低于WHO規(guī)定的允許值（76.0 μmol/L）.另外，通過Benesi-Hildebrand（圖6）方程確定了DPHC與Zn2+的絡合常數(shù)K為7.616×10-5.

接著，為了研究探針DPHC與Zn2+的絡合機制，繪制了Job′s plot圖，從圖7中可以發(fā)現(xiàn)，在Zn2+的摩爾分數(shù)達到0.5時，觀察到最大發(fā)射波長，這表明DPHC與Zn2+之間的絡合比為1∶1.因此，可以得出結(jié)論：DPHC通過4個位點與Zn2+絡合，其可能的結(jié)合模式如圖8.

為了進一步驗證DPHC的絡合方式，使用Gaussian 09 W進行密度泛函理論計算（DFT）.如圖9，Zn2+與探針DPHC的亞胺氮原子和羰基配位，形成類四面體的結(jié)構(gòu).在DPHC-Zn2+的絡合物中，Zn-O鍵長為2.064 93 ，Zn-N鍵長為2.053 52（Zn - N嘌呤-氮）.

結(jié)果表明，DPHC可以提供足夠的空間來容納Zn2+.此外，DPHC和DPHC-Zn2+的HOMO-LUMO的差值為0.140 47 a.u.和0.132 59 a.u..因此，DPHC-Zn2+的差值低于DPHC的差值，這可以通過DPHC-Zn2+絡合物在探針DPHC吸收光譜紅移來解釋.此外，圖10介紹了DPHC-Zn2+絡合物的核磁譜圖，在加入Zn2+（1 eq）到DPHC后，亞胺環(huán)的質(zhì)子從7.47×10-6到8.35×10-6，這也支持了以下觀點：亞胺參與了與Zn2+的絡合.

2.3 探針的實際應用

對于探針的實際應用，絡合時間長短與穩(wěn)定性至關(guān)重要.如圖11，DPHC和Zn2+絡合后的熒光強度，在短短10 s內(nèi)就能達到最高值.此外，在60 s的持續(xù)時間內(nèi)，探針DPHC與Zn2+絡合后的產(chǎn)物的熒光強度保持不變，這表明DPHC對Zn2+的檢測足夠穩(wěn)定.

此外，為了探究探針DPHC在不同pH下對Zn2+的檢測效果.首先，使用1 mol/L的HCl或NaOH將儲備液的pH值制備成2.0～13.0.如圖12，探針DPHC的熒光強度在6～9的pH范圍內(nèi)沒有明顯變化.當添加Zn2+后，在509 nm處，探針DPHC在2.0～13.0的pH范圍內(nèi)顯著增強，并且在pH=7時候熒光強度最高.然而，在強酸條件下（pHlt;6），未觀察到明顯的熒光信號，這有可能是探針結(jié)構(gòu)中多個氮原子發(fā)生了質(zhì)子化，不利于探針與Zn2+的配位.此外，在堿性條件下（pHgt;9）的發(fā)射強度逐漸降低，這有可能是因為Zn2+與OH-結(jié)合形成Zn（OH）2，從而降低了Zn2+的濃度.綜上可以得出結(jié)論，DPHC檢測Zn2+的最佳pH值為6.0～9.0.

通過試紙實驗來進一步證明DPHC的實用性（圖13）.首先，制備濾紙條并用DPHC溶液（1 mmol/L）浸泡，然后再空氣中干燥.將制備好的試紙浸泡到不同濃度的Zn2+溶液中（0、0.3、1.0 mmol/L），通過熒光等觀察到試紙由深色變?yōu)闇\色.因此，探針DPHC可以以固體形式測試Zn2+.

3 結(jié)論

（1） 一種新型的基于嘌呤衍生物與色酮-3-甲醛的席夫堿結(jié)構(gòu)的熒光傳感器DPHC被設計合成，該探針是基于PET機制設計的，分子內(nèi)誘導轉(zhuǎn)移限制了探針本身的熒光強度，當加入Zn2+后，PET過程受到抑制，熒光強度增強并伴隨著顯著的顏色變化.

（2） 探針在DMSO/HEPES溶液體系中對Zn2+具有高選擇性和高靈敏度：探針DPHC可以在10 min內(nèi)對Zn2+進行“開啟”式熒光效應；該探針的pH適用范圍是6.0～9.0.

（3） DPHC對Zn2+的檢出限低至150.0 nmol/L，這遠遠低于WHO規(guī)范的標準.此外，Job′s plot確定了Zn2+與DPHC結(jié)合的化學計量為1∶1，并且密度反函數(shù)（DFT）和1H NMR進一步證明了其結(jié)合機制.探針的試紙實驗證明了該探針的實用性.

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