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    高溫脅迫對不結(jié)球白菜幼苗生理指標(biāo)的影響及相關(guān)基因篩選

    2024-10-31 00:00:00賈婧怡陶心怡魏艷欣年雨虹丁心茹朱波
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年17期

    摘要:為探究不結(jié)球白菜不同品種對高溫脅迫的生理響應(yīng)和分子機(jī)制,以耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃為試驗(yàn)材料,通過人工模擬高溫(38 ℃)試驗(yàn),分別在0、3、6、9、12 d測定幼苗葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量及POD、SOD活性等生理生化指標(biāo),并在0、6、24 h取樣,選取熱激轉(zhuǎn)錄因子和熱激蛋白家族中的相關(guān)基因,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)來比較2個(gè)品種的高溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明:(1)矮腳黃的類胡蘿卜素含量在高溫脅迫3 d時(shí)較對照組顯著下降了42.86%,而脯氨酸含量在高溫脅迫6 d時(shí)是對照組的9.33倍,其POD活性在高溫脅迫12 d是對照組活性的10.00倍,SOD活性在高溫脅迫處理6 d時(shí)顯著下降,與3 d時(shí)的活性相比降低了52.10%。(2)SHI的葉綠素含量在高溫脅迫處理12 d時(shí)較對照組顯著提高20.61%,與此同時(shí),可溶性糖含量與3 d時(shí)相比顯著上升了1.59 mg/g,可溶性蛋白含量與9 d時(shí)相比顯著上升,為52.91 mg/g。(3)HSP基因家族中HSP57-1、HSP17.3、HSP57-2以及HSF基因家族中HSFA6b-1、HSFA6b-2、HSFA3、HSFA4a在耐熱品種中整體上表達(dá)量更高。綜上,耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃在高溫脅迫處理下類胡蘿卜素、脯氨酸含量和酶(POD、SOD) 活性均有所波動(dòng),但矮腳黃比SHI波動(dòng)更大。耐熱品種的葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量在高溫脅迫后期均呈明顯上升趨勢。HSP基因家族中HSP57-1、HSP17.3、HSP57-2以及HSF基因家族中HSFA6b-1、HSFA6b-2、HSFA3、HSFA4a為篩選出的耐熱相關(guān)基因,可能在幫助不結(jié)球白菜抵御高溫脅迫中發(fā)揮作用。

    關(guān)鍵詞:不結(jié)球白菜;高溫脅迫;生理指標(biāo);熱激蛋白;熱激轉(zhuǎn)錄因子

    中圖分類號(hào):S634.301 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2024)17-0140-09

    收稿日期:2023-09-20

    基金項(xiàng)目:大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(編號(hào):S202110370088)。

    作者簡介:賈婧怡(1998—),女,山西晉中人,碩士研究生,主要從事園藝植物逆境脅迫研究。E-mail:1005832854@qq.com。

    通信作者:朱 波,博士,副教授,主要從事園藝植物逆境脅迫研究。E-mail:zhubo_ybdx119@163.com。

    不結(jié)球白菜屬于十字花科 (Brassicaceae) 蕓薹屬蕓薹種的亞種[1],因其種質(zhì)資源豐富、生長周期較短、易于栽培種植等特點(diǎn),在我國多個(gè)省市及地區(qū)周年栽種。不結(jié)球白菜偏喜冷涼氣候,最適生長溫度為15~20 ℃。夏季高溫條件下,不結(jié)球白菜生長衰弱,易死苗,容易感染病蟲害,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降[2]。近年來全球氣候變暖,高溫會(huì)引起植物一系列生理生化和分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng),嚴(yán)重影響植物的生長與生存[3]。

    高溫脅迫不僅會(huì)抑制植物的光合反應(yīng),而且會(huì)破壞光合機(jī)構(gòu),使光合作用速率下降,葉片顏色會(huì)逐漸變淺,抑制花青素積累,一些植物的可溶性糖、可溶性蛋白含量降低,纖維素含量增加。植物在高溫脅迫下產(chǎn)生的大量活性氧 (ROS) 會(huì)引起膜脂過氧化。這些ROS會(huì)對植物的細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損傷[4]。植物通過使用抗氧化底物和保護(hù)酶來對抗氧化應(yīng)激,它們與植物抗氧化防御系統(tǒng)的活性具有密切關(guān)系[5]。葉片超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD) 是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧系統(tǒng)中的重要酶,能有效地阻止O-2·和H2O2在植物體內(nèi)積累,使細(xì)胞內(nèi)自由基維持在低水平上,防止細(xì)胞受自由基的毒害[6]。徐海等研究了不結(jié)球白菜高華青等3個(gè)品種的耐熱性,發(fā)現(xiàn)不結(jié)球白菜在應(yīng)對熱脅迫時(shí)葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白及淀粉等的含量均有所下降;脯氨酸和游離氨基酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量則呈上升趨勢,且均以熱敏材料上升幅度最大;丙二醛含量在熱脅迫處理前后變化不明顯;POD活性均為先下降再上升,耐熱材料高于熱敏材料;SOD活性總體均呈上升趨勢,且以熱敏材料升高幅度最明顯;抗壞血酸氧化酶活性則均呈現(xiàn)先大幅升高再大幅下降的變化趨勢[7]。由此表明,熱脅迫下耐熱品種具有更強(qiáng)的調(diào)控能力,以提高不結(jié)球白菜對熱脅迫的適應(yīng)性。

    研究表明,熱激蛋白(HSP)的轉(zhuǎn)錄受熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)調(diào)控,HSPs廣泛參與植物響應(yīng)各種脅迫[8-9]。根據(jù)分子量可分為2類,即高分子量熱激蛋白 (HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和HSP40) 和低分子量熱激蛋白 (sHSP)[10]。其中HSP90和HSP70在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用;sHSP基因在高溫、鹽脅迫等條件下高表達(dá)[11]。多項(xiàng)研究表明,sHSP基因在高溫脅迫下呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)模式,如花楸、茶樹和水稻的個(gè)別sHSP基因在高溫脅迫初期快速上調(diào)表達(dá),在達(dá)到峰值后下降[12-14]。HSF參與植物生長發(fā)育和抵御多種非生物脅迫的調(diào)控[15]。在高溫脅迫下,HSF可以提高熱激蛋白、活性氧清除系統(tǒng)、分子伴侶等抵御脅迫相關(guān)基因的表達(dá),增強(qiáng)植物的抵御能力。高溫是HSF對非生物脅迫響應(yīng)研究最多的因素。例如,番茄的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因slHSFA2及其調(diào)控的熱激蛋白基因HSP在高溫脅迫下表達(dá)增加。抑制slHSFA2活性后,番茄對高溫的敏感性增強(qiáng),說明其在高溫脅迫響應(yīng)中起作用[16]。擬南芥的4個(gè)HSFA1基因控制超過65%的熱應(yīng)答基因,并影響植株的耐熱能力;另一類基因HSFA2在正常生長時(shí)表達(dá)很少,但在高溫脅迫下表達(dá)明顯增多,并調(diào)控多個(gè)逆境脅迫的下游基因,具有信號(hào)放大功能[17-18]。

    不結(jié)球白菜耐熱性不同的品種應(yīng)答高溫脅迫的機(jī)制還不清楚。本研究對不結(jié)球白菜耐熱性不同的品種幼苗連續(xù)高溫脅迫處理0、3、6、9、12 d,分別測定其膜脂過氧化相關(guān)酶活性,以及葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量,并從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選取6個(gè)HSF基因和6個(gè)HSP基因,設(shè)計(jì)它們用于熒光定量PCR的引物序列,通過測定待測基因在植株中的表達(dá)量,證實(shí)待測基因可能為不結(jié)球白菜在高溫脅迫條件下保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用的基因。本研究的結(jié)果可為今后深入研究高溫脅迫下不結(jié)球白菜耐熱機(jī)制及培育耐高溫不結(jié)球白菜品種提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    選擇不結(jié)球白菜耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃為本研究的試驗(yàn)材料。矮腳黃的種子通過網(wǎng)絡(luò)途徑購買,SHI的種子為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所惠贈(zèng)。

    1.2 高溫脅迫試驗(yàn)

    取長勢一致且生長良好的幼苗于光照培養(yǎng)箱(SPX-350,寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)中進(jìn)行高溫脅迫試驗(yàn),晝—夜溫度設(shè)定為38 ℃—25 ℃,相對濕度50%,光周期為12 h—12 h(晝—夜),光照度 12 000 lx。分別于高溫脅迫處理0、3、6、9、12 d時(shí)取樣,測定各項(xiàng)生理指標(biāo),同時(shí)于高溫脅迫處理0、6、24 h時(shí)取樣,放置-80 ℃冰箱保存材料,用于后續(xù)的熒光定量PCR試驗(yàn)。

    1.3 生理指標(biāo)測定

    采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定SOD活性;采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性;采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量;采用考馬斯亮藍(lán)G-250試劑染色法測定可溶性蛋白含量;采用酸性茚三酮顯色法測定游離脯氨酸含量;采用乙醇(95%)浸提法測定光合色素含量。生理指標(biāo)測定方法均參照李合生的《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》[19]。所有指標(biāo)的測定均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

    1.4 熒光定量測定

    1.4.1 獲取待測定基因的PCR引物序列

    從實(shí)驗(yàn)室已有的不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出6個(gè)HSF基因和6個(gè)HSP基因,采用Primer 3.0在線軟件設(shè)計(jì)對應(yīng)的引物(表1)。

    1.4.2 不結(jié)球白菜熒光定量試驗(yàn)

    采用改良CTAB法提取高溫脅迫處理不同時(shí)間不結(jié)球白菜幼苗的RNA。使用 NovoScriptPlus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDBA Purge) 方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用熒光定量試劑盒[Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus (Cat. No.:E096)]進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。用2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量[20]。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)處理和顯著性分析使用Microsoft office 2016和SPSS 19.0軟件,利用Graphpad prism 8軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高溫脅迫對不結(jié)球白菜光合色素的影響

    由圖1可知,SHI的葉綠素含量先降低后升高,而矮腳黃的葉綠素含量則先降低后升高再降低。其中矮腳黃在高溫脅迫處理6 d后達(dá)到最大值,為1.14 mg/L,而SHI在高溫脅迫處理12 d后達(dá)到最大值,為1.58 mg/L,較對照組顯著提高20.61% (P<0.05)??傮w來看,相較于熱敏品種矮腳黃,耐熱品種SHI的葉綠素含量更高一些。 SHI和矮腳黃的類胡蘿卜素含量總體變化趨勢一致,都是先降低后升高再降低,但是SHI在總體上基本處于比較穩(wěn)定的趨勢,而矮腳黃下降幅度較大,在高溫脅迫3 d時(shí)含量最低,為0.12 mg/L,與對照組相比下降了 0.09 mg/L,降低幅度高達(dá)42.86%,與對照組具有顯著差異 (P<0.05)。

    2.2 高溫脅迫對不結(jié)球白菜可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量的影響

    由圖2可知,矮腳黃可溶性糖含量呈先下降后上升再下降的趨勢,SHI呈先降后升之后再降再升,整體趨勢呈“W”形。其中矮腳黃在高溫脅迫處理 9 d 時(shí)可溶性糖含量達(dá)到最大值。SHI高溫脅迫處理前的可溶性糖含量最高,而在高溫脅迫處理3 d時(shí)下降幅度較大,含量為2.11 mg/g,與對照組相比顯著下降了63.99%(P<0.05);但在脅迫12 d其含量比3 d時(shí)顯著上升了1.59 mg/g。矮腳黃可溶性蛋白含量先下降后上升再下降再上升,整體趨勢呈“W”形,而SHI先上升后下降再上升。矮腳黃在高溫脅迫處理前的可溶性蛋白含量最高,在高溫脅迫3 d時(shí)就大幅度下降,下降了36.02 mg/g;而SHI在高溫脅迫處理3 d時(shí)達(dá)到最大值,在高溫脅迫處理 9 d 時(shí)驟降,為 11.69 mg/g,與對照組相比,顯著下降72.76% (P<0.05),但在處理12 d時(shí)其含量顯著上升,為52.91 mg/g,與處理9 d時(shí)具有顯著差異 (P<0.05)。2個(gè)品種脯氨酸含量均隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先升后降的趨勢,但是SHI的變化趨勢相較于矮腳黃更為平緩,矮腳黃在高溫脅迫6 d時(shí)含量劇增,含量高達(dá)99.28 μg/g,是對照組的9.33倍,與對照組相比顯著增加了 88.64 μg/g (P<0.05)。

    2.3 高溫脅迫對不結(jié)球白菜抗氧化酶活性的影響

    由圖3可知,熱敏品種矮腳黃的POD活性隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加而不斷升高,高溫脅迫處理12 d時(shí)高達(dá)2 100.00 U/(g·min),是對照組活性

    的10.00倍,與對照組具有顯著性差異 (P<0.05),而耐熱品種SHI的POD活性先降低后升高再降低再升高,總體趨于平緩,高溫脅迫處理12 d的POD活性與對照組差異不顯著。2個(gè)品種的SOD活性隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加均先升高后下降再有一定程度的上升,矮腳黃在高溫脅迫處理6 d時(shí)SOD活性顯著下降,為166.67 U/g,與高溫脅迫處理3 d時(shí)的活性相比顯著下降52.10% (P<0.05);而SHI在高溫脅迫處理9 d時(shí)SOD活性下降最明顯,與高溫脅迫處理6 d相比下降了33.88%。在高溫脅迫處理12 d時(shí)2個(gè)品種的SOD活性與對照組均具有顯著性差異 (P<0.05)。

    2.4 高溫脅迫對不結(jié)球白菜HSP基因表達(dá)量的影響

    本研究通過熒光定量PCR法得到了不結(jié)球白菜耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃在高溫脅迫處理不同時(shí)間的HSP基因家族多個(gè)基因(包括HSP57-1、HSP17.3、HSP57-2、HSP23.5、HSP21和HSP17.4基因)的表達(dá)變化。由圖4可以看出,HSP57-1和HSP17.3基因在SHI中隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢,表達(dá)量在高溫脅迫處理6 h達(dá)到峰值,且2個(gè)基因在SHI品種中的表達(dá)量均高于矮腳黃。總體上與矮腳黃相比,HSP57-1基因在SHI中的相對表達(dá)量均較高,且在高溫脅迫 6 h 相對表達(dá)量上調(diào)趨勢更明顯,較對照組上調(diào)了258.00%,6 h的表達(dá)量是對照組的3.58倍;而在矮腳黃中,高溫脅迫6 h的表達(dá)量相較對照組上調(diào)了182.00%,與對照組具有顯著差異 (P<0.05)。HSP17.3基因在SHI中,高溫脅迫6 h的相對表達(dá)量較對照組大幅度上升,是對照組的17.33倍,且不同脅迫時(shí)間的表達(dá)量之間均具有顯著性差異 (P<0.05);而在矮腳黃中,隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加,該基因呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢,但總體趨于平緩,不同高溫脅迫處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量之間均沒有顯著差異。

    HSP57-2基因和HSP23.5基因在2個(gè)品種中隨高溫脅迫處理時(shí)間的增加均持續(xù)上調(diào)表達(dá),在 24 h 高溫脅迫處理時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。HSP57-2基因在SHI中,高溫脅迫24 h的相對表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào)(P<0.05),是對照組的9.50倍;而在矮腳黃中,該基因的相對表達(dá)量隨著高溫脅迫時(shí)間延長持續(xù)上調(diào),在高溫脅迫24 h達(dá)到最大值,是對照組的3.13倍,且與對照組具有顯著差異 (P<0.05)??傮w上,HSP57-2基因在SHI品種中的相對表達(dá)量更高一些。HSP23.5基因在SHI品種中,高溫脅迫處理24 h達(dá)最大值, 是對照組的7.93

    倍,且具有顯著差異(P<0.05);該基因在矮腳黃品種中,高溫脅迫處理24 h達(dá)最大值,是對照組的9.04倍,具有顯著差異 (P<0.05),HSP23.5基因在矮腳黃品種中的相對表達(dá)量比在SHI中更高一些。

    HSP21基因在SHI中隨高溫脅迫處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢,在高溫脅迫24 h達(dá)到最大值,是對照組的7.01倍,且與對照組具有顯著差異 (P<0.05),但與高溫脅迫6 h不具有顯著差異;在矮腳黃中表達(dá)趨勢呈先上升后下降的趨勢,在高溫脅迫6 h顯著升高,是對照組的27.16倍,與對照組具有顯著差異 (P<0.05)。HSP17.4基因在2個(gè)品種中隨高溫脅迫處理時(shí)間的延長均先上調(diào)后下調(diào),在SHI中,峰值出現(xiàn)在高溫脅迫處理6 h,是對照組的56.60倍,與對照組具有顯著差異 (P<0.05);在矮腳黃中,高溫脅迫處理6 h表達(dá)量升高,是對照組的188.17倍,在不同高溫脅迫處理時(shí)間的表達(dá)量均具有顯著性差異 (P<0.05)。

    2.5 高溫脅迫對不結(jié)球白菜HSF基因表達(dá)量的影響

    本研究利用熒光定量PCR法得到了不結(jié)球白菜耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃在高溫脅迫處理不同時(shí)間的HSF基因家族多個(gè)基因(包括HSFA6b-1、HSFA3、HSFA6b-2、HSFA4a、HSFB1和HSFA8)的表達(dá)變化。由圖5可以看出,HSFA6b-1基因在SHI中隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長而持續(xù)上調(diào),在高溫脅迫處理6 h表達(dá)量升高了46.53%,在24 h達(dá)峰值,是對照組的2.55倍(P<0.05);在矮腳黃中隨高溫脅迫處理時(shí)間延長呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢,且在高溫脅迫6 h達(dá)峰值,相較于對照組升高了97.00%(P<0.05),在高溫脅迫處理24 h略微下降,較脅迫處理6 h下降了31.47%,但2個(gè)時(shí)間的表達(dá)量具有顯著性差異 (P<0.05)。

    HSFA3基因在2個(gè)品種中均有表達(dá),在SHI中隨高溫脅迫處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的趨勢,在高溫脅迫6 h表達(dá)量顯著升高,是對照組的36.69倍,在高溫脅迫24 h驟降,與對照組沒有顯著差異;在矮腳黃中持續(xù)上調(diào),在高溫脅迫 6 h 其表達(dá)量是對照組的4.04倍,但與對照組沒有顯著差異,在高溫脅迫24 h達(dá)峰值,是對照組的6.72倍,與對照組表達(dá)量具有顯著性差異 (P<0.05)。但總體上,HSFA3基因在SHI中的表達(dá)量較矮腳黃高。

    HSFA6b-2基因在SHI中,高溫脅迫處理 6 h,較對照組表達(dá)量降低了28.71%,在高溫脅迫24 h,該基因的表達(dá)量顯著提高,是對照組的11.78倍,與對照組和高溫脅迫6 h的表達(dá)量均具有顯著差異 (P<0.05);而在矮腳黃中隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加,該基因的表達(dá)量呈上升趨勢,在高溫脅迫24 h達(dá)峰值,是對照組的4.87倍,高溫脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均具有顯著性差異 (P<0.05)。但總體上,HSFA6b-2基因在SHI中的表達(dá)量較矮腳黃高。

    HSFA4a基因在2個(gè)品種中的表達(dá)量隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢。在SHI中,該基因在高溫脅迫處理6 h表達(dá)量下降了61.39%,而在高溫脅迫處理24 h上升到最大值,是對照組表達(dá)量的3.70倍,與對照組具有顯著差異 (P<0.05);在矮腳黃中,該基因的表達(dá)量相對穩(wěn)定,在高溫脅迫6 h的表達(dá)量與對照組相比下降了6.93%,而在高溫脅迫24 h較對照組的表達(dá)量顯著提高,是對照組的2.10倍,與對照組和高溫脅迫處理6 h的表達(dá)量均具有顯著性差異 (P<0.05)。

    HSFB1基因在2個(gè)品種中均隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。在SHI中,該基因在高溫脅迫6 h表達(dá)量較對照組顯著升高,是對照組表達(dá)量的12.13倍,而在高溫脅迫24 h又呈下降趨勢,與對照組相比差異不顯著。在矮腳黃中,該基因的表達(dá)量在高溫脅迫6 h顯著升高,是對照組的84.42倍,并且具有顯著性差異 (P<0.05),而在高溫脅迫24 h的表達(dá)量又顯著下降。

    HSFA8基因在2個(gè)品種中隨著高溫脅迫時(shí)間的延長表達(dá)量呈現(xiàn)不同的趨勢。該基因在SHI中隨高溫脅迫處理時(shí)間的延長表達(dá)量先下降后升高,在高溫脅迫6 h,較對照組下降了59.41%,但沒有顯著差異,在高溫脅迫24 h表達(dá)量顯著升高,是對照組的5.61倍,且與對照組具有顯著性差異 (P<0.05)。在矮腳黃中,該基因隨高溫脅迫時(shí)間延長表達(dá)量逐漸上升,在高溫脅迫24 h達(dá)到峰值,表達(dá)量是對照組的7.27倍,該基因的表達(dá)量在不同脅迫時(shí)間之間均有顯著差異 (P<0.05)。

    3 討論與結(jié)論

    3.1 葉綠素、類胡蘿卜素與植物耐熱性

    高溫脅迫會(huì)破壞葉綠體類囊體的理化性質(zhì)及組織,導(dǎo)致葉綠體降解,從而降低細(xì)胞中參與光合反應(yīng)的酶活性,致使葉綠素含量下降,進(jìn)而破壞植物生理機(jī)制的正常運(yùn)行,造成植物體內(nèi)代謝紊亂[21]。葉綠體中類胡蘿卜素的合成常處于動(dòng)態(tài)的變化過程以適應(yīng)環(huán)境的變化,從而保證光合作用正常進(jìn)行[22]。本研究結(jié)果顯示,矮腳黃葉綠素含量隨高溫脅迫時(shí)間延長呈先下降后上升再下降的趨勢,高溫脅迫處理12 d的葉綠素含量與對照相比下降,并具有顯著差異 (P<0.05)。這與徐海等的研究結(jié)果[7]是一致的。但SHI中葉綠素含量隨高溫脅迫處理時(shí)間延長呈先下降后上升的趨勢,高溫脅迫處理12 d與對照相比有少許上升,可能高溫脅迫使葉片蒸騰失水,葉綠素相對含量增加,同時(shí)高溫處理也會(huì)使酶失活或鈍化從而抑制葉綠素分解。2個(gè)品種在高溫脅迫處理初期 (3 d)類胡蘿卜素含量均有一定程度的下降,這可能是由于高溫脅迫導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞,但隨著高溫脅迫處理時(shí)間延長(3~6 d)均上升,可能此時(shí)植物體內(nèi)積累一定量的活性氧加速類胡蘿卜素的合成使其清除高溫脅迫產(chǎn)生的活性氧,之后又呈現(xiàn)下降趨勢,可能是由于高溫脅迫時(shí)間過長,植物體內(nèi)代謝紊亂,合成類胡蘿卜素過程被抑制。

    3.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與植物耐熱性

    可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等是植物中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),其含量的增加有利于逆境條件下細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的維持。高溫脅迫使可溶性糖含量降低,不同高溫處理下可溶性糖含量即使有上升趨勢,但也一直低于對照,且耐熱品種的可溶性糖含量降低幅度小于熱敏性品種[23-26]??扇苄缘鞍缀扛叩椭苯优c植物耐熱性相關(guān)[27]。有研究表明,耐熱大白菜品種在高溫下可保持較高的蛋白質(zhì)合成速率和較低的蛋白質(zhì)降解速率[28]。脯氨酸是植物中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),植物在遇到逆境脅迫時(shí),脯氨酸合成酶類對脯氨酸的反饋抑制敏感性降低,導(dǎo)致體內(nèi)脯氨酸含量增加,且增長的百分率大小與耐熱性有關(guān)[29]。本研究結(jié)果表明,高溫脅迫下 矮腳黃可溶性蛋白含量隨高溫脅迫處理時(shí)間的延長先下降后上升再下降再上升,而SHI可溶性蛋白含量在高溫脅迫過程中雖然曾出現(xiàn)下降趨勢,但高溫脅迫處理12 d與對照組相比上升,具有顯著性差異 (P<0.05),說明SHI耐熱能力較高,可保持較高蛋白質(zhì)合成速率和較低蛋白質(zhì)降解速率。2個(gè)品種的脯氨酸含量隨高溫脅迫時(shí)間延長均呈先上升后下降的趨勢,同時(shí)在高溫脅迫處理12 d時(shí)兩者的脯氨酸含量與對照相比均上升,且均具有顯著性差異 (P<0.05)。說明不結(jié)球白菜在遇到高溫脅迫時(shí),脯氨酸合成酶類對脯氨酸的反饋抑制敏感性降低,脯氨酸合成速率加快,減緩高溫對植物細(xì)胞造成的損傷,以提高植物耐熱性。

    3.3 抗氧化系統(tǒng)與植物耐熱性

    高溫脅迫下,植物體內(nèi)生成和清除活性氧的平衡被打破,繼而活性氧不斷積累。植物體內(nèi)的POD和SOD等能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)的ROS,在高溫脅迫下,這些保護(hù)酶類活性的增大有利于緩解過量的ROS對細(xì)胞的損傷。短時(shí)間的高溫脅迫會(huì)提高SOD活性,但隨著脅迫時(shí)間的延長,SOD活性呈下降趨勢,且耐熱性強(qiáng)的品種SOD活性高于耐熱性差的品種[30-31]。在高溫脅迫下大豆耐熱品種的SOD活性高于熱敏感品種,并且其活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)[32]。不同植物應(yīng)對高溫脅迫的生理機(jī)制不同,高溫脅迫下,部分植物出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),使SOD、POD等抗氧化酶活性下降,隨后進(jìn)入適應(yīng)性階段,使抗氧化酶活性上升,但隨著脅迫加強(qiáng)與作用時(shí)間延長,植物受損程度加強(qiáng),植物細(xì)胞代謝活動(dòng)受阻,抗氧化酶活性下降,植物最終受到氧化損傷,甚至死亡[33-35]。SHI的POD活性隨高溫脅迫時(shí)間延長呈周期性先下降后上升的趨勢,而矮腳黃則隨高溫脅迫時(shí)間延長一直呈上升趨勢,2個(gè)品種高溫脅迫12 d與對照組相比均上升,其中矮腳黃的POD活性上升幅度較大。矮腳黃的POD活性顯著增加可能由于植物要對抗高溫脅迫導(dǎo)致的活性氧增加,防止植物細(xì)胞受到損害。而SHI上升的幅度沒有矮腳黃幅度大,可能由于未進(jìn)行高溫脅迫時(shí)耐熱品種的POD9368AWiSX/tMUG5/LrhQnvm0JeVA4QAChK7U0U5bNMc=活性比熱敏品種高,使細(xì)胞免于熱害損傷的能力更強(qiáng),所以高溫脅迫時(shí)反應(yīng)不會(huì)非常敏感,只出現(xiàn)一定幅度的升高以此來保護(hù)植物細(xì)胞免受損傷,維持植物幼苗正常生長。耐熱品種先出現(xiàn)POD活性的下降可能因?yàn)檫m應(yīng)熱激,初步形成穩(wěn)態(tài)后,POD需求量減少,導(dǎo)致POD活性出現(xiàn)短暫下降。之后POD活性又出現(xiàn)上升趨勢,可能由于持續(xù)高溫脅迫導(dǎo)致體內(nèi)活性氧含量增加,為了清除活性氧保護(hù)植物細(xì)胞。而熱敏品種POD活性的增幅大于耐熱品種的增幅,可能由于矮腳黃適應(yīng)于高溫環(huán)境后激發(fā)的POD活性一直保持在較高狀態(tài)。2個(gè)品種SOD活性隨高溫脅迫時(shí)間延長均呈先上升后下降再上升的趨勢,且高溫脅迫12 d與對照組相比均上升,SOD活性增大是為了保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧的損傷,高溫脅迫初期出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),可能使SOD活性下降,但隨著進(jìn)入適應(yīng)性階段,SOD活性逐步上升。

    綜上所述,高溫脅迫下,不結(jié)球白菜SOD、POD活性升高,以抵御高溫脅迫所帶來的活性氧、自由基的威脅,葉綠素含量會(huì)降低,脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量會(huì)增加,從而減少高溫脅迫對植物造成的傷害。

    3.4 熱激蛋白、熱激轉(zhuǎn)錄因子與植物耐熱性

    溫度是影響植物正常生長的關(guān)鍵環(huán)境因素之一。高溫會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生熱激反應(yīng),誘導(dǎo)熱激轉(zhuǎn)錄因子和下游的熱激蛋白等相關(guān)基因表達(dá),這是植物對高溫脅迫的分子響應(yīng)[36-37]。HSP通過參與蛋白質(zhì)的正確折疊實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的保護(hù),HSF則在這個(gè)過程中起信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵作用。Tian等研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)PtsHSP17.2基因煙草與野生型植物相比,在熱脅迫下葉綠素含量、相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的變化較小,抗氧化物酶活性和脯氨酸含量在熱脅迫下明顯增強(qiáng),這證明過表達(dá)的PtsHSP17.2基因提高了煙草對高溫的耐受性[38]。另外,Sedaghatmehr等在擬南芥的熱脅迫研究中發(fā)現(xiàn),質(zhì)體金屬蛋白酶TtsH6缺失可以促進(jìn)HSP21蛋白在高溫脅迫后期的積累,并提高植物對高溫的耐受性[39]。RNA-seq分析結(jié)果顯示AsHSP16.5調(diào)控生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá),如熱休克因子和其他轉(zhuǎn)錄因子等,進(jìn)而增強(qiáng)水稻的耐熱性[40]。雷明娜等的研究表明,AtsHSP17.4還可與過氧化氫酶發(fā)生互作,增強(qiáng)過氧化氫酶的活性[41]。在正常脅迫條件下,組成型AsHSP17的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)出對高溫的敏感性增強(qiáng),葉片葉綠素含量降低和光合作用降低[42]。Poonia等研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)TaHsfA6b的轉(zhuǎn)基因大麥株系表現(xiàn)出較好的耐熱性,TaHsfA6b基因的組成性過表達(dá)上調(diào)了主要熱休克蛋白和其他非生物應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)[43]。Schramm等研究證實(shí),HsfA3是由DREB2A轉(zhuǎn)錄控制的,對耐熱性的建立很重要[44]。

    本研究中,HSP基因家族中的HSP17.3、HSP21以及HSF基因家族中的HSFA6b-1、HSFA3、HSFA6b-2、HSFA8在耐熱品種SHI中的表達(dá)模式與熱敏品種矮腳黃中存在明顯差異。HSP57-1、HSP17.3、HSP57-2、HSFA6b-1、HSFA3、HSFA6b-2和HSF4a在耐熱品種SHI中的表達(dá)量比熱敏品種矮腳黃相對更高。以上結(jié)果表明,HSF基因家族中的HSFA6b-1、HSFA6b-2、HSFA3、HSFA4a基因以及HSP基因家族中的HSP57-1、HSP57-2、HSP17.3基因可能參與了不結(jié)球白菜對高溫脅迫的響應(yīng)過程。總體來說,HSF基因在2個(gè)品種之間的表達(dá)量差異提示SHI能更快激活下游HSP等抗逆基因的表達(dá),HSP基因的高表達(dá)則有利于維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性從而提高耐熱性。本研究的結(jié)果為后續(xù)開展不結(jié)球白菜耐高溫的分子機(jī)制以及培育耐熱品種奠定了一定的基礎(chǔ)。

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