金釵石斛AP2/ERF基因家族的鑒定和表達(dá)分析

摘要：對金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因家族在全基因組上進(jìn)行鑒定及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步闡明金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的功能研究奠定理論基礎(chǔ)。利用BLASTP比對金釵石斛蛋白，并通過在線網(wǎng)站NCBI CDD、InterPro和SMART進(jìn)一步鑒定，共獲得97個(gè)金釵石斛AP2/ERF基因，然后通過ProtParam分析金釵石斛AP2/ERF家族蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性，使用MEGA11.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，利用Map Gene Chrome、GSDS、MEME、PlantCARE在線工具分析AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的基因定位、基因結(jié)構(gòu)和保守基序，并預(yù)測基因上游的順式作用元件，利用TBTools分析并可視化AP2/ERF基因在各部位的表達(dá)情況。結(jié)果表明，金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，大部分定位在細(xì)胞核中，相對分子質(zhì)量介于2 726.88～71 682.81 u之間，氨基酸數(shù)量介于94～659個(gè)之間，等電點(diǎn)介于4.45～10.44之間。進(jìn)化樹分析顯示，AP2/ERF家族成員分為AP2、RAV、ERF及DREB 4個(gè)亞家族。97條基因不均勻地分布在19條染色體上，各個(gè)亞族都有獨(dú)特基序，AP2/ERF基因啟動子上游區(qū)域光響應(yīng)作用元件種類最多，數(shù)量也最多。大多數(shù)DnAP2s基因在根中的表達(dá)量最大，不同的居群DnAP2s基因表達(dá)有較大不同。鑒定得到97個(gè)金釵石斛AP2/ERF蛋白，DnAP2s基因在根莖葉花中表達(dá)具有差異性，地理分布導(dǎo)致不同居群的遺傳多樣性水平不同。

關(guān)鍵詞：金釵石斛；AP2/ERF基因家族；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

中圖分類號：Q943.2；S567.23+9.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）17-0047-11

收稿日期：2023-08-11

基金支持：國家自然科學(xué)基金（編號：31870697）。

作者簡介：于相麗（1975—），女，河南漯河人，碩士，講師，主要從事植物生物技術(shù)和生物信息學(xué)研究。E-mail：yuxli2001@163.com。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，包含DNA結(jié)合區(qū)、核定位信號、蛋白質(zhì)相互作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等區(qū)域［1］。植物基因組中有很大一部分基因編碼轉(zhuǎn)錄因子［2］，如BBS［3］、NAC［4］、WRKY［5］、LIM［6］、bZIP［7］、MYB［8］等。AP2/ERF基因家族是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，該類轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物學(xué)過程，包括植物生長、花發(fā)育、果實(shí)發(fā)育、種子發(fā)育、損傷、病菌防御、高鹽、干旱等環(huán)境脅迫響應(yīng)等［1］，已在簸箕柳（Salix suchowensis）［9］、歐李（Cerasus humilis）［10］、芝麻（Sesamum indicum L.）［11］、歐洲紅豆杉（Taxus baccata L.）［12］、綠豆（Kigna radiata L.）［13］、羅布麻（Apocynum venetum L.）［14］、桑樹（Morus balba L.）［15］、獼猴桃（Actinidia chinensi Planch）［16］等單雙子葉植物中得到鑒定。

金釵石斛（Dendrobium nobile L.）為蘭科石斛屬草本植物，具有藥用、食用和觀賞價(jià)值。金釵石斛以莖入藥，性寒、味苦、淡、微咸，具有增強(qiáng)免疫力、強(qiáng)陰益精、生津養(yǎng)胃、潤肺止咳、抗腫瘤等功效［17］。其富含生物堿、多糖等活性物質(zhì)，因此成為醫(yī)療、食品等領(lǐng)域的熱門研究對象［18］。除具有較高的藥用價(jià)值外，金釵石斛花色艷麗，形態(tài)優(yōu)美，有非常高的觀賞價(jià)值［19-20］。近年來，大量采集和生態(tài)破壞導(dǎo)致金釵石斛野生資源稀缺，已被國家列入瀕危植物名錄加以保護(hù)［17］。當(dāng)前，關(guān)于金釵石斛AP2/ERF基因家族的鑒定及表達(dá)分析的研究未見報(bào)道，本研究在全基因組范圍內(nèi)鑒定金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員和表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步探索金釵石斛AP2/ERF基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因鑒定及序列分析

本試驗(yàn)的研究對象是金釵石斛AP2/ERF家族。于2023年2月到4月在洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室（215）進(jìn)行軟件操作及信息處理。擬南芥（Arabidopsis thaliana）AP2/ERF基因家族的蛋白質(zhì)序列下載于數(shù)據(jù)庫Tair（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp），金釵石斛基因組文件、蛋白質(zhì)文件、cds文件、gff文件等下載于NCBI生物信息數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），將擬南芥AP2/ERF蛋白質(zhì)序列文件作為標(biāo)準(zhǔn)，利用TBtools［21］與金釵石斛蛋白質(zhì)文件進(jìn)行Blast比對，得到初次篩選的蛋白質(zhì)文件。然后利用NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）、InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）和SMART（https：//smart.embl.de/）對初選蛋白質(zhì)文件進(jìn)行下一步鑒定。

利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和WolF PSOERT（https：//wolfpsort.hgc.jp）分別預(yù)測金釵石斛AP2/ERF蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目、相對分子數(shù)量、等電點(diǎn)數(shù)據(jù)及蛋白質(zhì)位置，并列表記錄。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步分析AP2/ERF家族成員的進(jìn)化特點(diǎn)，利用 MEGA11.0［22］軟件進(jìn)行比對，將金釵石斛與擬南芥AP2/ERF蛋白序列以鄰接法（neighbor-joining，NJ）（自展值1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3 轉(zhuǎn)錄因子的基因定位

根據(jù)gff文件中基因的位置，利用Map Gene Chrome，將AP2/ERF基因定位至染色體上。

1.4 基因結(jié)構(gòu)及保守序列分析

利用GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖和MEME（http：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線工具對金釵石斛基因蛋白序列上的保守基序進(jìn)行預(yù)測。保守基序數(shù)量設(shè)置為20，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，并采用TBtools軟件繪制保守基序圖。

1.5 順式作用元件分析

選取啟動子上游2 000 bp序列，在線網(wǎng)站Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子順式作用元件，篩選整理后，繪制順式作用元件圖。

1.6 基因表達(dá)模式分析

1.6.1 組織特異性分析 從NCBI生物信息數(shù)據(jù)庫獲取已公開的金釵石斛不同部位（根、莖、葉、花）表達(dá)情況的數(shù)據(jù)（SRR1503682，SRR1503683，SRR1503684，SRR1503685，SRR1503686，SRR1503687，SRR1503688，SRR1503689，SRR1503691，SRR870475，SRR870484），TBtools 軟件分析后取FPKM的 log2（FPKM+1） 值，TBtools工具包可視化Dn-AP2s基因的表達(dá)水平。

1.6.2 不同居群金釵石斛中的表達(dá)分析 為探討不同居群金釵石斛AP2/ERF基因表達(dá)模式的差異，從NCBI生物信息數(shù)據(jù)庫獲取已公開的四川、貴州和云南等10個(gè)居群的金釵石斛表達(dá)情況數(shù)據(jù)（PRJNA747120），選取表達(dá)量較高的基因，對不同居群的金釵石斛表達(dá)量進(jìn)行比較。TBtools軟件分析后取FPKM的log2（FPKM+1）值，TBtools工具包可視化Dn-AP2s的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 金釵石斛AP2/ERF基因家族鑒定及序列分析

通過BLAST、NCBI CDD、InterPro和SMART鑒定，最終鑒定到97條AP2/ERF基因，按照基因ID從小到大的順序，依次命名為DnAP2-01～DnAP2-97。從表1可以看出，DnAP2蛋白分子質(zhì)量介于 2 726.88～71 682.81 u之間，氨基酸數(shù)量介于94～659個(gè)之間，等電點(diǎn)介于4.45～10.44之間。其中，56個(gè)蛋白的等電點(diǎn)小于7，偏酸性；其余41個(gè)蛋白的等電點(diǎn)大于7，偏堿性。除了少數(shù)定位于葉綠體（12個(gè)）、線粒體（3個(gè)）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（1個(gè)）外，其余金釵石斛AP2/ERF基因家族成員都定位于在細(xì)胞核。

2.2 金釵石斛AP2/ERF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

依據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)及其結(jié)構(gòu)域同源性，擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可分為5個(gè)亞家族：AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist。以擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子為參照對象，對97個(gè)金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分類，將其分為4個(gè)亞家族：AP2、ERF、DREB、RAV，缺少Soloist（圖1）。金釵石斛97個(gè)DnAP2s中有48個(gè)成員屬于ERF亞家族，29個(gè)成員屬于DREB亞家族，15個(gè)成員屬AP2亞家族，5個(gè)成員屬于RAV亞家族。ERF亞家族作為最大的亞家族，可進(jìn)一步分類為5個(gè)組：B1、B2、B3、B5和B6；DREB亞家族可分為5個(gè)組：A1、A2、A4、A5和A6。進(jìn)化樹中共有64對旁系同源基因，15對直系同源基因。其中金釵石斛同源基因26對，擬南芥同源基因38對。AP2、RAV亞家族分支非常明顯，表明其在很早時(shí)就發(fā)生了分化，基因序列發(fā)生較大分化［16］；而DREB和ERF亞家族分布和獼猴桃有所不同，說明與獼猴桃AP2/ERF家族進(jìn)化途徑有所不同。

2.3 金釵石斛AP2/ERF基因定位

基因定位是指確定基因所屬連鎖群及基因在染色體上的分布位置，有助于了解基因的作用功能及其之間的相互作用關(guān)系［16］。對金釵石斛97個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因定位（圖2）發(fā)現(xiàn)，在19條染色體上均有AP2/ERF基因的分布，但分布并不均勻。其中以chr13分布最多，為14條，chr4分布最少，僅為1條，chr6和chr9都為10條，chr19為12條。多條染色體上存在基因簇，這些基因簇由串聯(lián)重復(fù)或片段重復(fù)構(gòu)成，如DnAP2-48、DnAP2-49和 DnAP2-50，DnAP2-62和DnAP2-63。

2.4 金釵石斛AP2/ERF基因結(jié)構(gòu)與保守序列分析

保守序列的分析能夠揭示蛋白質(zhì)的相似性、結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系，為進(jìn)一步深入地研究生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。從金釵石斛AP2/ERF基因結(jié)構(gòu)（圖3-b）來看，ERF和DREB這2個(gè)亞家族大部分只有外顯子，沒有內(nèi)含子。RAV亞家族和AP2亞家族含有大量內(nèi)含子，如AP2-68，包含14個(gè)內(nèi)含子，而且這2個(gè)亞家族的基因長度明顯長于ERF亞家族和DREB亞家族，推測較高數(shù)量的內(nèi)含子增加了基因長度，能夠提高基因間的重組頻率。進(jìn)一步對金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3-c）表明AP2/ERF基因家族均包含motif1、motif2這2個(gè)保守基序，而且每個(gè)亞家族都有其特有序列。ERF亞家族基本上都含有motif1、motif2和motif6，其中B3組一部分含有motif7、motif8、motif11、motif18和motif20，另外一部分含有motif15；B5組有motif17。DREB亞家族基本上都含有motif1、motif2和motif8，其中A1組和A4組都含有motif9和motif12，A2組和A5組都只有motif8，A6組含有motif10和motif19。RAV亞家族都含有motif1、motif2、motif3、motif4、motif5和motif16，但是DnAP2-12卻含有motif1、motif2、motif6和motif18。AP2亞家族都有motif1、motif2、motif3、motif4、motif5、motif14和motif16。

2.5 金釵石斛AP2/ERF基因家族順式作用元件分析

順式作用元件是基因的重要組分，能夠反映基因潛在的功能和調(diào)控途徑。對金釵石斛AP2/ERF基因上游2 000 bp序列進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，DnAP2基因含有38種主要順式作用元件，分別參與植物光響應(yīng)、激素響應(yīng)、環(huán)境脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育等過程（圖4），例如G-box（331）、TGACG-motif（303）、CGTCA-motif（302）、BOX4（292）、ABRE（295）、ARE（214）、CATA-box（92）。由圖4可以看出，參與光響應(yīng)的主要啟動子類型占多數(shù)，數(shù)量也最多；參與激素應(yīng)答和植物生長發(fā)育的主要啟動子類型較多，分別為11和8類；主要參與環(huán)境脅迫種類相對較少，只有6類，但數(shù)量相對較多。

2.6 金釵石斛AP2/ERF基因家族基因表達(dá)模式分析

2.6.1 組織特異性分析 利用金釵石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析DnAP2s在金釵石斛根、莖、葉和花中的表達(dá)量結(jié)果（圖5）表明，DnAP2s基因在根莖葉花中表達(dá)具有差異性。DnAP2-11、DnAP2-15、DnAP2-30、DnAP2-49、DnAP2-50等基因在根莖葉花中均未表達(dá)，推測在正常條件下，這些基因的功能與組織特異性表達(dá)無關(guān)。表達(dá)量最高的基因DnAP2-13、DnAP2-21、DnAP2-24、DnAP2-25、DnAP2-39、DnAP2-62、DnAP2-63、 DnAP-70和DnAP2-77等均在根中。DnAP2-05、DnAP2-45、 DnAP2-58、DnAP2-68、DnAP2-79等基因中僅在根中不表達(dá)，但DnAP2-78僅在根中表達(dá)；DnAP2-76僅在莖中不表達(dá)，但DnAP2-26、DnAP2-27等基因只在莖中表達(dá)；DnAP2-16僅在葉中不表達(dá)；在花中不表達(dá)的基因較多，有DnAP2-14、DnAP2-29、DnAP2-40、DnAP2-48、DnAP2-72和DnAP2-95，但DnAP2-31只在花中表達(dá)，DREB亞家族的B3組在花中表達(dá)相對較高，說明B3組DnAP2s可能

參與開花過程。

2.6.2 不同居群金釵石斛中的表達(dá)分析 為探討不同居群Dn-AP2s基因表達(dá)模式的差異，對來自云南的1個(gè)居群（ML）、貴州的2個(gè)居群（FX和WL）和四川的7個(gè)居群（FM、WT、XM、LJ、SJ、FB、SP）的部分DnAP2基因表達(dá)量進(jìn)行分析比較（圖6）。結(jié)果顯示，所有居群中，DnAP2-01和FDrEkkurac1Bya1KwTmIUvMwANqU6UWyvwaihdaeoxk=DnAP2-56表達(dá)量都很高，但DnAP2-56在ML居群中不表達(dá)。ML居群和其他居群相比，除了DnAP2-16、DnAP2-26、DnAP2-44、DnAP2-72和DnAP2-97表達(dá)和其他居群沒有明顯區(qū)別外，其余DnAP2成員表達(dá)量顯著高于或低于其他居群；FX和WL這2個(gè)居群基因表達(dá)量無明顯區(qū)別，DnAP2s表達(dá)更接近于四川居群；來自四川的居群FM的DnAP2-26、

DnAP2-30和DnAP2-62表達(dá)量和其他居群有明顯區(qū)別，LJ居群的 DnAP2-26和DnAP2-72表達(dá)量較低，明顯區(qū)別于其他5個(gè)居群，SP居群的DnAP2-16、DnAP2-62、DnAP2-63和DnAP2-72表達(dá)量明顯低于其他居群，其他4個(gè)居群DnAP2s具有相似的表達(dá)量，無明顯差異。

3 討論與結(jié)論

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在高等植物的生長發(fā)育、應(yīng)對外界刺激反應(yīng)以及基因的調(diào)控等方面發(fā)揮重要的作用［23］。本研究從金釵石斛中共鑒定出97條AP2/ERF家族蛋白，目前不同植物中鑒定出AP2/ERF家族蛋白數(shù)目各不相同，綠豆（Vigna radiata L.）87條［13］、新疆野蘋果（Malus sieversii）106條［24］、藍(lán)莓（Vaccinium spp.） 160條［25］、油橄欖（Canarium oleosum） 110條［26］、歐洲山楊（Populus tremula） 210條［27］，說明不同物種之間AP2/ERF家族蛋白條數(shù)存在差異。

對97條金釵石斛蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)等方面進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)存在很大差異，最短蛋白質(zhì)只有94個(gè)氨基酸，最長蛋白質(zhì)有659個(gè)氨基酸；一部分蛋白質(zhì)是酸性，一部分是堿性。這些差異在綠豆［13］、羅布麻（Apocynum venetum）［14］、桑（Morus alba L.）［15］、獼猴桃（Actinidia chinensi）［16］等植物中也存在不同，推測其可能決定了各轉(zhuǎn)錄因子執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能。通過motif蛋白保守基序研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列存在差異，但均包含motif1和motif2這2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，這表明 AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子在物種進(jìn)化過程中高度保守。而每個(gè)亞家族各有自己特有的motif，可能是植物在進(jìn)化過程中為了適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生了變異［25］，使得不同亞家族中保守的氨基酸中存在較大的差異。

金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子大部分只含有外顯子，并無內(nèi)含子，在光皮樺［28］、小麥［29］、蓖麻［30］中也出現(xiàn)此現(xiàn)象。RAV亞家族含有內(nèi)含子和外顯子，AP2亞家族除了DnAP2-03無內(nèi)含子以外，其余基因都含外顯子和內(nèi)含子。成員之間內(nèi)含子長度、位置和數(shù)目存在差異，說明其家族在進(jìn)化過程中發(fā)生了較強(qiáng)的分化，這可能也是導(dǎo)致其成員功能不同的原因［28］。

真核生物的轉(zhuǎn)錄過程主要在細(xì)胞核中發(fā)生，所以轉(zhuǎn)錄因子蛋白一般情況下也是定位在細(xì)胞核中，這符合其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因表達(dá)的特性［25］，有時(shí)候轉(zhuǎn)錄因子也定位在葉綠體和線粒體中［31］。金釵石斛AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白大部分定位在細(xì)胞核、線粒體和葉綠體中，只有1個(gè)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。原始小球藻［31］AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)；藍(lán)莓［25］和小麥［28］AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白除了定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、質(zhì)膜和細(xì)胞外基質(zhì)。獼猴桃［16］、新疆野蘋果［24］、阿拉伯巖薺［32］、白樺［33］、甘薯［34］等植物中均未發(fā)現(xiàn)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。這說明不同植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白定位略有差異，可能與該種植物生活方式、生存環(huán)境及在AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白植物體內(nèi)執(zhí)行的作用和功能有關(guān)，具體作用仍需要進(jìn)一步研究探討。

金釵石斛AP2/ERF基因家族在不同組織中的表達(dá)存在很大差異，有的基因只在一種組織中表達(dá)，有的基因只在2種組織中表達(dá)，還有的基因只在3種組織中表達(dá)，更有部分基因在4種組織中均未表達(dá)，這表明DnAP2s表達(dá)具有組織特異性。ERF亞家族響應(yīng)外界的非生物脅迫，擬南芥AtERF49在鹽堿脅迫中有響應(yīng)［35］，野生大豆GsERF6在水稻中過表達(dá)可提高水稻耐鹽［36］，棉花GhERF5能響應(yīng)枯萎病脅迫［37］，光皮樺ERF和DREB對高溫脅迫有明顯響應(yīng)［28］。金釵石斛ERF亞家族中的DnAP2-11和DnAP2-30在各個(gè)組織中均不表達(dá)，表明其可能在外界脅迫中發(fā)揮作用。

AP2/ERF基因能夠調(diào)節(jié)葉片大?。?8］，植物枝條和側(cè)根［39］，促進(jìn)水稻不定根發(fā)育［40］，調(diào)控株高［41-42］和花序分生與小穗分生組織［43］，參與萼片修飾［44］和唇瓣表皮發(fā)育［41］，調(diào)節(jié)生菜種子形狀［45］，促進(jìn)果實(shí)成熟［46］。AP2/ERF基因功能導(dǎo)致植物具有不同的形狀。金釵石斛不同居群之間存在較高的遺傳分化，可能是由于地理隔離、分散分布和自然居群之間缺乏交流，在長期進(jìn)化過程中存在高度的遺傳分化［47］。試驗(yàn)采集的樣本居群分布在云南低緯度地區(qū)、貴州高原赤水河沿岸和四川盆地丘陵地區(qū)。如此廣泛的地理分布導(dǎo)致不同居群的遺傳多樣性水平不同。這些群體之間的遺傳分化程度不同可能與它們對不同環(huán)境的適應(yīng)能力有關(guān)［47］。

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