一種檢測牛奶中喹諾酮類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法

摘 要：本文基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了一種高精密度檢測牛奶中喹諾酮類藥物的方法，并對所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察與驗證。本研究參考已有的標(biāo)準(zhǔn)，對標(biāo)準(zhǔn)的前處理步驟進(jìn)行優(yōu)化，最后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。20種喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.995 59～0.999 91，方法檢出限為0.051 4～0.928 μg/kg，回收率為73.6％～110.0％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33％～7.69％。該方法前處理簡便、高效，所得結(jié)果檢出限低，回收率較好，精準(zhǔn)度高，重復(fù)性好，可以為檢驗牛奶中喹諾酮類藥物提供有力的方法支撐。

關(guān)鍵詞：喹諾酮類藥物；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；高精密度；高回收率

中圖分類號：TS252.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）05-0081-08

喹諾酮類藥物是一種具有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、價格低廉等特點的人工合成抗菌藥，其作用機(jī)制是抑制DNA回旋酶發(fā)揮作用，導(dǎo)致mRNA與蛋白質(zhì)合成失控從而達(dá)到殺死細(xì)菌的目的[1]。常見的喹諾酮類藥物有諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等，常用于預(yù)防和治療畜禽細(xì)菌性疾病[2]。但這也不可避免地導(dǎo)致藥物在動物體內(nèi)殘留，繼而經(jīng)口攝入進(jìn)入人體，對人類健康產(chǎn)生不良影響[3]。喹諾酮類藥物可對人體造成多系統(tǒng)的不良反應(yīng)，包括胃腸道不適、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)、肌腱炎及反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、影響軟骨發(fā)育以及肝臟損傷等[1，4]。

牛奶是日常生活中十分常見的飲品，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等，具有很高的營養(yǎng)價值。牛奶在生產(chǎn)、運輸、包裝到銷售的過程中均存在被污染的可能，從而對人體健康產(chǎn)生不良影響。其中抗菌藥濫用導(dǎo)致的藥物殘留是不容忽視的問題，而牛奶中喹諾酮類藥物的殘留現(xiàn)象較為普遍，已成為一個嚴(yán)重的食品安全問題[5]。因此，建立準(zhǔn)確測定牛奶中喹諾酮類藥物殘留的方法至關(guān)重要，對保障牛奶等乳產(chǎn)品的食品質(zhì)量安全和降低健康風(fēng)險具有重要意義。目前，牛奶中喹諾酮類藥物的檢測方法主要有免疫學(xué)方法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）等[6-8]。其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對復(fù)雜樣本的分離能力和定性效果好，可同時檢測多種藥物殘留，具有選擇性和靈敏度高的特點，應(yīng)用廣泛[9]。

現(xiàn)存大多數(shù)研究檢測的喹諾酮類藥物種類較少，不夠全面；現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB 29692—2013《牛奶中喹諾酮類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》也只規(guī)定了11種喹諾酮類藥物的測定方法[10]。因此，有必要開發(fā)一個包括更多種類藥物的測定方法。本研究以牛奶為樣本，在國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，建立簡便、快速、可重復(fù)性高的前處理方法，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣本中的依諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星以及氧氟沙星這20種喹諾酮類藥物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量檢測，以期為喹諾酮類藥物的檢測提供有力的方法及技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Aglient 1290超高效液相色譜儀，美國AB Sciex Triple Quad? 5500質(zhì)譜儀，OAN-EVAP 24型全自動氮吹儀，日本TAITEC Mix-VR多管漩渦混合儀，梅特勒AG285型天平，IKAKS501型旋渦混合器，德國Sigma 3K15冷凍離心機(jī)，Millipor超純水儀，新芝SB-1200DT型超聲波清洗機(jī)。

1.2 材料與試劑

乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；甲酸（色譜純）；0.2％甲酸甲醇溶液（V甲醇∶V甲酸=100∶0.2）；甲醇水溶液（V甲醇∶V水=1∶1）。

QuEChERS緩沖鹽試劑袋；Waters PRIME HLB（6cc 200 mg）固相萃取柱；快速定量濾紙。

1.3 樣本制備

量取適量牛奶，裝入潔凈容器作為試樣，密封并標(biāo)記，放置于－18 ℃冰箱中備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取20種喹諾酮類藥物（依諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，－20 ℃冰箱中保存，有效期 12個月；分別移取適量1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，－20 ℃冰箱中保存，有效期6個月；再移取100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 樣本前處理

準(zhǔn)確稱取試樣5.00 g于50 mL離心管中，加入0.2％甲酸甲醇溶液10 mL，渦旋混勻后振蕩5 min，超聲提取5 min，5 000 r/min 離心5 min，收集上清液；向上清液中加入QuEChERS緩沖鹽試劑袋，充分渦旋混合1 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液過快速定量濾紙，所得濾液收集備用。

移取上述濾液4.0 mL，過PRIME HLB固相萃取柱洗脫，準(zhǔn)確移取2.5 mL洗脫液至15 mL離心管內(nèi)，在40 ℃水浴下氮氣吹干，再用甲醇水溶液（體積比1∶1）定容至1.00 mL，渦旋后過0.22 μm濾膜，待HPLC-MS/MS分析。

1.6 HPLC-MS/MS條件

1.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A相為0.1％甲酸水溶液；流動相B相為甲醇；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL。梯度洗脫程序見表1。

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電噴霧電壓為5 500 V；離子源溫度為600 ℃；氣簾氣壓力為28 psi；碰撞氣壓力為10 psi；霧化氣壓力為55 psi；輔助加熱氣壓力為60 psi。

定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓及碰撞能量見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按方法條件設(shè)置儀器參數(shù)，16種喹諾酮類藥物（依諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星）配制濃度為1.00、2.00、20.00、100.00、200.00、300.00 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其余4種喹諾酮類藥物（諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）配制濃度為1.00、2.00、4.00、20.00、40.00、60.00 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待儀器參數(shù)穩(wěn)定后，對系列標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)r的范圍為0.995 59～0.999 91。具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白牛奶樣本為基質(zhì)，做7個平行添加試驗，陽性添加20種喹諾酮類藥物的濃度均為0.500 0 μg/kg，按照1.4方法進(jìn)行前處理，進(jìn)行上機(jī)測定，測得方法檢出限范圍為0.051 4 ～0.928 0 μg/kg，具體見表3。計算公式如下：

檢出限（μg/kg）=K·Sb·C/X

式中：K取3；Sb為平行測試樣含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；C為加標(biāo)濃度，μg/kg；X為平行試樣含量的平均值。

2.3 回收率及精密度確定

以空白牛奶樣本為基質(zhì)，向牛奶樣本中添加16種喹諾酮類藥物（依諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星）項目混標(biāo)0.5、10.0、100.0 μg/kg濃度水平，其余4種喹諾酮類藥物（諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）項目混標(biāo)0.5、2.0、20.0 μg/kg濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。按照方法進(jìn)行前處理，上機(jī)測試，結(jié)果如表4及表5所示。

根據(jù)表4與表5中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，且回收率表現(xiàn)較好，回收率為73.6％～110.0％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33％～7.69％。該方法的檢出限較低，同時重復(fù)性較好，并且能保持較為優(yōu)異的回收率，可用于20種喹諾酮類藥物的準(zhǔn)確定性、定量檢測。

3 結(jié)論

本研究在現(xiàn)存標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對牛奶中喹諾酮類藥物的前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化：純化步驟采用QuEChERS緩沖鹽試劑袋對樣本進(jìn)行初純化，同時緩沖鹽能夠更好地平衡提取體系的pH和防止樣本乳化；使用PRIME HLB小柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，可以進(jìn)一步降低基質(zhì)干擾。在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析中也得到了較為滿意的回收率、穩(wěn)定性和精密度結(jié)果。因此，本研究建立了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測牛奶中喹諾酮類藥物的簡便測定方法，為相關(guān)行業(yè)檢測工作提供了檢測方法及技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 孫慧萍，蔡力力，閻賦琴，等．喹諾酮類藥物的作用機(jī)制及不良反應(yīng)[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18（7）：1014-1016.

[2] 李倩，王甲，張玉潔，等．動物性食品中喹諾酮類藥物殘留檢測方法研究進(jìn)展[J]．食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2021，12（8）：3016-3022.

[3] 王翠月，陳大偉，馬麗娜，等．動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留現(xiàn)狀和檢測方法研究進(jìn)展[J]．中國家禽，2022，44（12）：92-97.

[4] 李倩，張玉潔，李丹，等．獸用喹諾酮類藥物的使用情況及藥物殘留檢測進(jìn)展[J]．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2020（19）：51-54.

[5] 肖瀟，王冉冉，艾依熱提·買買提，等．牛奶中6種喹諾酮類獸藥殘留的QuEchERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定法[J]．職業(yè)與健康，2023，39（8）：1046-1049，1056.

[6] 張瑞婷．超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中8種氟喹諾酮類獸藥殘留[J]．食品安全導(dǎo)刊，2023（16）：115-117.

[7] 李燕君，譚梅，岳秀英，等．牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留同步快速檢測的酶聯(lián)免疫吸附法研究[J]．中國獸藥雜志，2020，54（1）：46-52.

[8] 馬立才，邢維維，于瑩，等．牛奶中喹諾酮類藥物殘留的AlphaLISA檢測方法的研究[J]．食品工業(yè)科技，2024，45（14）：264-270.

[9] 郭佩佩，劉海峰，潘明，等．牛奶中氟喹諾酮類抗生素殘留檢測技術(shù)現(xiàn)狀分析[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備，2022，43（2）：26-30.

[10] 農(nóng)業(yè)部，衛(wèi)生和計劃生育委員會．食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 牛奶中喹諾酮類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法：GB 29692—2013[S]．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

作者簡介：韓銀濤（1982－ ），男，學(xué)士，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫病預(yù)防控制相關(guān)工作；E-mail：18738294@qq.com

共同第一作者：龐李艷（1991－ ），女，學(xué)士，獸醫(yī)師；E-mail：348776239@qq.com

*通信作者：次仁玉珍（1994－ ），女，學(xué)士，助理獸醫(yī)師；E-mail： 2449552533@qq.com

吳凱（1991－ ），男，學(xué)士，助理獸醫(yī)師；E-mail： 465358852@qq.com