一種檢測(cè)家禽配合飼料中蛋白同化激素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法

摘 要：本文基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種高精密度檢測(cè)家禽配合飼料中蛋白同化激素的方法，并對(duì)所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察與驗(yàn)證?；诂F(xiàn)存研究對(duì)前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化，并采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.997 143、0.999 041、0.994 270、0.999 698，方法檢出限分別為2.26、2.29、2.78、2.34 μg/kg，回收率為89.0％～101.3％、87.5％～107.0％、91.0％～107.0％、86.5％～102.0％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1％～4.1％、3.0％～4.2％、2.7％～4.1％、2.2％～4.3％。結(jié)果表明，該方法檢出限低，回收率較好，同時(shí)精準(zhǔn)度高，重復(fù)性好，可以為檢驗(yàn)家禽配合飼料中蛋白同化激素提供有力的方法支撐。

關(guān)鍵詞：蛋白同化激素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；精密度；回收率

中圖分類號(hào)：TS252.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）05-0062-04

蛋白同化激素（anabolic androgenic steroids）是同化類固醇，是雄性化作用減弱而蛋白同化作用增強(qiáng)的甾體激素，主要種類包括睪酮衍生物（睪酮、勃地龍等）、雄烷衍生物（美雄酮、雄烯二酮等）、諾龍衍生物（諾龍、丙酸諾龍等）、雜環(huán)衍生物和雜類合成類固醇（美倫孕酮、黃體酮等）五大類[1]。這些物質(zhì)具有相似的生理功能，但其M/A分化指數(shù)（M表示同化作用，A表示雄性激素活性）存在差異，M/A分化指數(shù)越高，同化作用相對(duì)越強(qiáng)[2]。蛋白同化作用可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，減少蛋白質(zhì)分解，從而使肌肉和體重增加，同時(shí)促進(jìn)鈣、磷吸收，加速骨鈣化；此外，還可以刺激生成促紅細(xì)胞生成素，促進(jìn)血細(xì)胞的生成以及加速傷口愈合[3-4]。由于具有以上作用，蛋白同化激素被不法商家非法添加在畜禽飼料中以提高肉類產(chǎn)品的產(chǎn)量，含有這些激素的農(nóng)產(chǎn)品被人攝入后在體內(nèi)遷移蓄積，長(zhǎng)期食用會(huì)導(dǎo)致性功能異常、肝功能障礙、內(nèi)分泌紊亂，甚至誘發(fā)心血管疾病，從而對(duì)人體健康產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)的不良影響[3，5]。因此，檢測(cè)飼料中蛋白同化激素的含量對(duì)保障畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全、維護(hù)人體健康有著重要意義。

目前蛋白同化激素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）、氣譜法、免疫分析法等[6-7]。其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合了色譜的良好分離能力與質(zhì)譜的高特異性檢測(cè)特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定，適用于復(fù)雜生物樣本的分析檢測(cè)。然而，使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中蛋白同化激素的相關(guān)研究較少[8-9]。

因此，本研究以家禽配合飼料為樣本，建立簡(jiǎn)便、快速、可重復(fù)性高的前處理，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)樣本中的睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍這4種蛋白同化激素進(jìn)行定性定量檢測(cè)，以期為蛋白同化激素的檢測(cè)提供有力的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Aglient 1290超高效液相色譜儀，AB Sciex Triple Quad? 5500質(zhì)譜儀，OAN-EVAP 24型全自動(dòng)氮吹儀，TAITEC Mix-VR多管漩渦混合儀，梅特勒AG285型天平，IKAKS501型旋渦混合器，Sigma 3K15冷凍離心機(jī)，Millipor超純水儀，研磨機(jī)。

1.2 試劑

乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），甲酸（色譜純），0.1％（體積分?jǐn)?shù)）甲酸溶液。

1.3 樣本制備

取適量家禽配合飼料，用組織搗碎機(jī)搗碎，放入潔凈容器作為試驗(yàn)樣本，密封并標(biāo)記，常溫保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的標(biāo)準(zhǔn)樣本，用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣本儲(chǔ)備液，－20 ℃冰箱中保存，有效期12個(gè)月；分別取4種1 000 μg/mL的蛋白同化激素標(biāo)準(zhǔn)樣本儲(chǔ)備液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，－20 ℃冰箱中保存，有效期 6個(gè)月；再取100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)樣本工作液。

1.5 樣本前處理

稱取5.00 g均質(zhì)試驗(yàn)樣本，置于50 mL離心管中，加入5 g碾磨小珠和乙腈20 mL。 10 000 r/min快速碾磨30 s后，6 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL梨形瓶中，在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑靡译妫ê?.1％甲酸）1.0 mL溶解殘?jiān)?，渦旋45 s后過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.6 HPLC-MS/MS條件

1.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相A相為0.1％甲酸水溶液；流動(dòng)相B相為甲醇；色譜柱溫度為40 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL。梯度洗脫程序見表1。

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描方式為負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度600 ℃；氣簾氣壓力為28 psi；碰撞氣壓力為10 psi；霧化氣壓力為55 psi；輔助加熱氣壓力為60 psi。

定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、采集時(shí)間、去簇電壓及碰撞能量見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按方法條件設(shè)置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL），待儀器參數(shù)穩(wěn)定后，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的相關(guān)系數(shù)為0.997 143、0.999 041、0.994 270、0.999 698，具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白家禽配合飼料樣本為基質(zhì)，做7個(gè)平行添加試驗(yàn)，陽性添加濃度睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍均為20 μg/kg，按照1.5方法進(jìn)行前處理和上機(jī)測(cè)定，測(cè)得睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的方法檢出限分別為2.26、2.29、2.78、2.34 μg/kg，具體見表3。計(jì)算公式如下：

檢出限（μg/kg）= K·Sb·C/X

式中：K取3；Sb為平行測(cè)試樣含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；C表示加標(biāo)濃度，μg/kg；X指平行試樣含量的平均值。

2.3 回收率及精密度確定

以空白家禽配合飼料樣本為基質(zhì)，向家禽配合飼料樣本中添加蛋白同化激素（睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍）濃度水平分別為20.0、40.0、200.0 μg/kg進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。按照方法進(jìn)行前處理，上機(jī)測(cè)試，結(jié)果見表4和表5。

根據(jù)表4與表5中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，且回收率表現(xiàn)較好，睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的回收率分別為89.0％～101.3％、87.5％～107.0％、91.0％～107.0％、86.5％～102.0％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1％～4.1％、3.0％～4.2％、2.7％～4.1％、2.2％～4.3％。該方法的檢出限較低、同時(shí)重復(fù)性較好，并且能保持較為優(yōu)異的回收率，可用于睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的準(zhǔn)確定性、定量檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文旨在建立一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)家禽配合飼料中蛋白同化激素簡(jiǎn)便測(cè)定方法，為相關(guān)行業(yè)檢測(cè)工作提供該類激素的檢測(cè)方法及檢測(cè)技術(shù)參考。結(jié)果表明，此方法前處理簡(jiǎn)單，精密度高而且穩(wěn)定性好，較大地提高了檢測(cè)效率，適用于家禽配合飼料中睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍殘留量的定性、定量檢測(cè)。

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作者簡(jiǎn)介：龐李艷（1991－ ），女，本科，主要從事動(dòng)物疫病預(yù)防控制相關(guān)工作；E-mail：348776239@qq.com共同第一作者：次仁玉珍

*通信作者：韓銀濤（1982－ ），男，高級(jí)獸醫(yī)師張秋韻