厚皮甜瓜‘SN-1’組培再生和遺傳轉化體系的建立

關鍵詞：厚皮甜瓜；組培再生；遺傳轉化

甜瓜為葫蘆科瓜類蔬菜，因其果實味甜多汁、香氣濃郁、且富含多種維生素和有機酸等營養(yǎng)成分，深受消費者喜愛，是我國重要的經(jīng)濟作物之一。然而，目前我國甜瓜產(chǎn)業(yè)仍存在品種單一、趨同性高，高端、優(yōu)質(zhì)、特色品種匱乏等問題，亟待通過持續(xù)的種源創(chuàng)新，推動育種工作高質(zhì)量發(fā)展［1，2］。組培再生和遺傳轉化是開展功能基因組學研究的前提條件之一。前人對甜瓜的組培再生體系展開研究，成功誘導出多個品種的愈傷組織并獲得再生植株［1，3-5］；由于其類型多樣，遺傳背景差異較大，因此組培再生和遺傳轉化體系仍不成熟，存在不定芽和根系分化困難、轉化效率低等問題。

影響甜瓜組培再生的因素包括基因型、苗齡、外植體類型、培養(yǎng)基組分、激素種類和配比等［6-9］。研究表明，不同類型甜瓜間再生效果差異明顯，且薄皮類型再生效率高于厚皮類型［6］，不同品種甜瓜外植體的最佳取樣的時間為播種后2～6d［9，10］。培養(yǎng)基成分、特別是激素種類和配比對外植體再生影響顯著。甜瓜組培中常用的生長調(diào)節(jié)劑包括6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等，其中6-BA為愈傷和不定芽誘導所必需，使用濃度一般在0.5～2.0mg·L-1，適量添加IAA或ABA可平衡內(nèi)源激素水平，抑制玻璃化的發(fā)生［11］。同時，遺傳轉化過程亦受到農(nóng)桿菌菌株種類、侵染和共培養(yǎng)時間等因素影響，導致不同材料間轉化效率差異顯著［12］。課題組前期構建了薄皮甜瓜‘YJM’的組培再生和遺傳轉化體系［13］，但厚皮甜瓜如‘SN-1’在該體系條件下極易出現(xiàn)不定芽玻璃化和生根困難等問題。針對這些難點，本研究通過篩選和優(yōu)化種子處理方法、外植體處理條件、共培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分、激素配比等，建立了適于‘SN-1’的組培再生和遺傳轉化體系，為厚皮甜瓜種源創(chuàng)制和分子設計育種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試甜瓜材料 供試材料為厚皮甜瓜（CucumismeloL.ssp.melo）自交系‘SN-1’，試驗地點為山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室。

1.1.2 菌株及載體 雙元表達載體pFGC5941-CRISPR_CmPMI1由本實驗室構建；大腸桿菌菌株Trans1-T1和農(nóng)桿菌菌株EHA105分別購自北京全式金生物技術股份有限公司和上海唯地生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)和消毒條件的篩選 選取飽滿均一的甜瓜種子，滅菌后置于Agar、1/2MS+Agar和MS+Agar3種萌發(fā)培養(yǎng)基，28℃、暗培養(yǎng)2d后統(tǒng)計萌發(fā)率和整齊度；隨后配制3種濃度NaClO消毒液（2%、3%和4%，v/v），對種子分別進行10、15、20和25min處理，28℃、暗培養(yǎng)2d后統(tǒng)計萌發(fā)率和整齊度。試驗設置3次重復，每組30粒種子。

1.2.2 外植體收集時間和方法的篩選 在播種后24、32、40、48和56h收集子葉節(jié)，置于誘導培養(yǎng)基［13］，在28℃、光周期16h/8h、光強8000lx條件下培養(yǎng)4周，統(tǒng)計不定芽分化情況。進一步以“二分法”和“四分法”切取外植體（圖1），置于誘導培養(yǎng)基、相同環(huán)境條件下培養(yǎng)3d后，統(tǒng)計外植體轉綠時間、污染率和不定芽分化情況。試驗設置3次重復，每組15粒種子。

1.2.3 誘導和生根培養(yǎng)基激素配比的篩選 收集子葉節(jié)，置于含不同濃度6-BA（0.25、0.5、1和2mg·L-1）的誘導培養(yǎng)基［13］，環(huán)境條件同1.2.2，28d后統(tǒng)計不定芽分化和玻璃化情況；在此基礎上進一步添加不同濃度IAA和ABA（表1，IM-1～IM-16），培養(yǎng)4周后統(tǒng)計不定芽分化和玻璃化情況。切取長度3cm左右的不定芽，轉至含不同濃度IAA的生根培養(yǎng)基（表1，RM-1～RM-5），環(huán)境條件同1.2.2，10d后統(tǒng)計生根率。試驗設置3次重復，每組20個子葉節(jié)或不定芽。

1.2.4 共培養(yǎng)條件的篩選 將農(nóng)桿菌侵染后的子葉節(jié)置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，28℃、暗培養(yǎng)1～4d，統(tǒng)計外植體污染情況；進一步配制不同激素配比共培養(yǎng)培養(yǎng)基（表1，CM-1～CM-5），28℃、暗培養(yǎng)3d后，統(tǒng)計外植體褐化和污染情況。試驗設置3次重復，每組20個子葉節(jié)。

1.2.5 轉基因陽性苗的鑒定 取適量葉片充分研磨，隨后將PAT/BAR金標免疫快速檢測試紙條浸入組織勻漿，室溫靜置5min，觀察顯色結果以確定再生植株Basta抗性；進一步利用CTAB法提取基因組DNA，PCR擴增、Sanger測序分析靶位點突變情況。

2 結果與分析

2.1 不同萌發(fā)培養(yǎng)基對‘SN-1’種子萌發(fā)的影響

如圖2所示，Agar、1/2MS+Agar和MS+Agar三種培養(yǎng)基上種子萌發(fā)率雖無顯著差異，但在萌發(fā)整齊度和時間方面卻差異明顯，其中Agar組兩指標（86%和40h）均優(yōu)于1/2MS+Agar（78%和45h）和MS+Agar組（70%和55h），故選擇其為‘SN-1’的萌發(fā)培養(yǎng)基。

2.2 消毒劑配比和處理時間對‘SN-1’種子萌發(fā)的影響

以不同濃度NaClO溶液對種子進行消毒處理，28℃、暗培養(yǎng)2d后統(tǒng)計其萌發(fā)率和整齊度，結果如圖3A～B所示，三組種子萌發(fā)率雖無顯著差異，但整齊度指標差異明顯，其中2%和3%兩組均在85%以上，而4%組僅為60%，顯著低于前兩組；進一步分析發(fā)現(xiàn)3%組種子萌發(fā)率和整齊度均值分別為95.3%和88.9%，略高于2%組兩指標的均值（92%和72%），故選擇該濃度消毒劑進行種子處理。隨后比較不同消毒時間對種子萌發(fā)的影響，結果如圖3C～D所示，隨著處理時間的增加，種子萌發(fā)率和整齊度呈先上升后下降的趨勢，其中15min處理的種子兩指標分別為91%和88%，顯著優(yōu)于其他處理，因而確定其為最佳消毒時間。

2.3 外植體切取方式和時間對‘SN-1’子葉節(jié)組培再生的影響

如圖4A～C所示，相較傳統(tǒng)的“二分法”，“四分法”取樣在不影響子葉節(jié)轉綠時間、污染率和不定芽分化率的前提下，大幅度增加了外植體的獲取數(shù)量和種子的利用率；進一步對子葉節(jié)取樣時間進行篩選，結果如圖4D～E所示，不同時期子葉節(jié)的不定芽誘導率差異明顯，相較其他取樣時期，以播后48h、胚根長度約5mm的種子為供體所收集的子葉節(jié)，不定芽分化率最高（75.3%），因此該時期為‘SN-1’外植體最佳取樣時間。

2.4 不同激素濃度和配比對‘SN-1’子葉節(jié)組培再生的影響

如圖5A～B所示，隨著誘導培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加，不定芽分化率呈先升高后降低的趨勢，玻璃化率則逐漸升高，其中6-BA濃度0.5mg·L-1時子葉節(jié)的不定芽誘導率可達85%，顯著優(yōu)于其他處理，且不定芽玻璃化率較低、大多可分化為正常植株；在此6-BA濃度基礎上添加IAA和ABA，分析不同激素配比對不定芽分化和玻璃化的影響，結果如圖5C～D所示，相較其他激素組合，IM-10不定芽分化率最佳，達到90%以上，且玻璃化率較低，因此誘導培養(yǎng)基的激素配比確定為0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+1mg·L-1ABA。進一步分析IAA對‘SN-1’生根的影響，結果如圖6所示，再生苗在不同IAA濃度生根培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生不定根，但所需時間存在差異，當IAA濃度為0.4mg·L-1時生根率最高、且生根時間最短，因此該濃度為最佳。

2.5 共培養(yǎng)條件對‘SN-1’子葉節(jié)組培再生的影響和轉基因材料的獲得

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌介導植物遺傳轉化過程中的關鍵步驟之一［14］。對共培養(yǎng)培養(yǎng)基的激素組成進行篩選，結果如圖7A～B所示，CM-2（MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IAA+9g·L-1Agar）子葉節(jié)的存活率和褐化率較CM-1、CM-3～CM-5四組為優(yōu)，故確定該激素組合為最佳；進一步比較共培養(yǎng)時間對子葉節(jié)生長的影響，結果如圖7C～F所示，子葉節(jié)隨著時間延長逐漸膨大、至3d時達到最佳，當4d時因農(nóng)桿菌大量出現(xiàn)而使其生長受到抑制，因此確定暗處理3d為本研究所用共培養(yǎng)時間；隨后對再生苗的進行Basta抗性和測序驗證，鑒定到具有Basta抗性、且目標基因發(fā)生兩個堿基缺失的植株，表明‘SN-1’的組培再生和遺傳轉化體系已成功建立。

3 討論

前人研究表明，種子生長狀態(tài)對不定芽誘導效率至關重要［15］。本試驗通過對甜瓜種子消毒條件、外植體收收集時間和制備方法等進行篩選優(yōu)化，顯著提高了種子利用率和不定芽分化率（圖2-3）。甜瓜組培再生與激素濃度和配比關系密切［16，17］，添加不同激素會直接影響外植體生長狀態(tài)和不定芽誘導效果［18］。本試驗對誘導培養(yǎng)基的激素配比進行了篩選，發(fā)現(xiàn)隨著6-BA濃度的升高，甜瓜愈傷組織和不定芽的玻璃化迅速加重，進而影響不定芽的分化和伸長；當添加了IAA和ABA兩種激素后，不定芽玻璃化程度顯著減輕、分化率顯著提高。這與高寧寧等［1］和王果等［19］研究結果類似。

有報道指出，IAA對側根的形成和發(fā)育有顯著影響［19］，低濃度時可促進葉菜型甘薯不定根生長，而高濃度抑制其生長［20］。據(jù)此，我們在生根培養(yǎng)基中添加了IAA，并對其適宜濃度進行了篩選，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)IAA濃度的增加可顯著縮短不定芽的生根時間，但當其濃度超過0.8mg·L-1時，會導致再生苗早衰、生長受抑等（圖6）。

遺傳轉化效率受多種因素的影響。李娟等在西瓜研究中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌在外植體切口處需保持至少16h，才有可能誘導外植體產(chǎn)生愈傷組織并啟動侵染過程，因此建議共培養(yǎng)時間應超過16h［21］。本研究對‘SN-1’共培養(yǎng)時間進行了篩選，發(fā)現(xiàn)處理時間3d效果最佳，若時間過短，外植體無法完全膨大，影響后續(xù)不定芽分化，但時間過長則會導致農(nóng)桿菌過度侵染，外植體出現(xiàn)死亡、褐化等（圖7C～F），這與劉麗峰等［22］結果一致。隨后對激素配比進行了篩選，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加ABA極易導致外植體褐化、死亡，因此‘SN-1’共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基僅添加了適宜濃度6-BA和IAA，這與萬麗麗等［12］研究結果有所差異，可能是由甜瓜品種間差異所致。

4 結論

本研究建立了厚皮甜瓜‘SN-1’的組培再生和遺傳轉化體系，發(fā)現(xiàn)以3%NaClO溶液處理種子15min、Agar培養(yǎng)基作為萌發(fā)培養(yǎng)基，滅菌和萌發(fā)效果最佳；播種后48h、胚根長度約5mm時，所收集子葉節(jié)的不定芽分化效果最優(yōu)；最佳誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基配方分別為（MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+1mg·L-1ABA+9g·L-1Agar）和（MS+0.4mg·L-1IAA+9g·L-1Agar）；農(nóng)桿菌侵染的子葉節(jié)置于含0.5mg·L-16-BA和0.1mg·L-1IAA的MS固體培養(yǎng)基、共培養(yǎng)3d，其生長均一、污染率最低、且后期愈傷誘導和不定芽分化最好。