新加蓯蓉菟絲湯通過(guò)線粒體自噬途徑促卵泡發(fā)育的分子機(jī)制

摘要：基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討新加蓯蓉菟絲湯（XJCRTST）通過(guò)顆粒細(xì)胞線粒體自噬途徑促卵泡發(fā)育的分子生物學(xué)機(jī)制。通過(guò)LC-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出XJCRTST的主要成分、其治療卵巢功能減退疾病靶點(diǎn)及通路。選取雌性SD大鼠分為模型組，西藥組，XJCRTST高、中、低劑量組共5組。HE染色觀測(cè)卵巢形態(tài)學(xué)變化；透射電鏡觀察卵巢顆粒細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)及線粒體自噬體。結(jié)果表明，LC-MS技術(shù)鑒定出XJCRTST化合物共252個(gè)，其治療卵巢功能減退類疾病潛在作用靶點(diǎn)42個(gè)，GO功能富集過(guò)程中主要涉及BP（1 168項(xiàng)）、CC（45項(xiàng)）和MF（59項(xiàng)），KEGG通路富集顯示參與的通路有AGE-RAGE、Prolactin及TNF信號(hào)通路等，Mitophagy-animal過(guò)程中共富集了3個(gè)靶基因：Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，中藥治療組大鼠卵泡數(shù)量增多，閉鎖卵泡減少。電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)中藥組線粒體腫脹減輕、線粒體自噬情況減少。綜上得出XJCRTST治療卵巢功能減退可能通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞中線粒體功能和線粒體自噬相關(guān)通路發(fā)揮其治療作用。

關(guān)鍵詞：新加蓯蓉菟絲湯；卵巢功能減退；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；線粒體

中圖分類號(hào)：R282文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-4026（2024）05-0025-10

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

The molecular mechanisms by which Xinjia Cistanche Tusi Decoction

promotes follicular development through mitophagy

YAN Jin1， LI Fei2*， WU Keming3，YANG Haobo1

（1. School of Basic Medicine， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China; 2. Affiliated Hospital of

Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China; 3. Affiliated Hospital of

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610000， China）

Abstract∶Using light chromatography-mass spectrometry （LC-MS）， network pharmacology， and animal experiments， we explored the molecular mechanism by which Xinjia Cistanche Tusi Decoction （XJCRTST） promotes follicular development through granulosa cell mitophagy. LC-MS and network pharmacology were used to screen for the main components of XJCRTST and its therapeutic targets and pathways related to hypoovarianism. Female Sprague-Dawley rats were divided into five groups： model group， western medicine group， and XJCRTST high dose， medium dose， and low dose groups. The morphological changes of the ovary were observed through hematoxylin and eosin staining， and the structure and morphology of mitochondria and mitophagosomes in ovarian granulosa cells were observed through transmission electron microscopy. Two hundred and fifty-two compounds were identified in XJCRTST， with 42 potential targets for treating hypoovarianism， and the Gene Ontology enrichment mainly involved biological process （1 168 items）， cell composition（45 items）， and molecular function（59 items）. KEGG pathway enrichment showed that the pathways involved were AGE-RAGE， Prolactin and TNF signaling pathways. Three target genes Parkin/PINK1， HIF1A and MAPK8 were enriched in the Mitophagy-animal process.Animal experiments showed that the number of follicles increased and the atretic follicles decreased in the Chinese medicine treatment group. Electron microscopy found that mitochondrial swelling and mitophagy decreased in the Chinese medicine group. XJCRTST may play a therapeutic role in treating hypoovarianism by regulating mitochondrial function and mitophagy-related pathways in ovarian granulosa cells.

Key words∶Xinjia Cistanche Tusi Decoction; ovarian hypoplasia; network pharmacology; LC-MS；mitochondria

卵泡發(fā)育障礙是導(dǎo)致40歲以下女性月經(jīng)稀發(fā)量少、閉經(jīng)等病癥的“罪魁禍?zhǔn)住保瑖?yán)重影響女性身心健康。近年來(lái)，受環(huán)境污染、工作學(xué)習(xí)壓力增加、食品安全問(wèn)題等因素影響，臨床上卵巢功能減退類病癥發(fā)病率逐年增高［1-2］，這類病癥是以卵巢內(nèi)卵泡的數(shù)量、質(zhì)量降低，卵泡發(fā)育和成熟障礙，同時(shí)伴隨低雌激素及高促性腺激素為特征，出現(xiàn)以稀發(fā)量少、月經(jīng)紊亂甚至閉經(jīng)、生育力降低或不孕的一類病癥，包括卵巢儲(chǔ)備功能低下（decline in ovarian reserbe，DOR）、早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）和卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）等［3］。西醫(yī)尚無(wú)有效恢復(fù)患者卵巢功能的方法，多采用雌-孕激素補(bǔ)充或替代療法（hormone replacement therapy，HRT），以改善患者圍絕經(jīng)期癥狀和維持人工月經(jīng)，但停藥后病情常常反復(fù)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為卵巢功能減退多因腎精不足、腎氣虧虛、兼肝郁血瘀，造成沖任虛衰、天癸早竭而發(fā)病，以補(bǔ)腎益精、養(yǎng)血活血為基本治法，在結(jié)合明代醫(yī)家武之望《濟(jì)陰綱目》蓯蓉菟絲丸與卓雨農(nóng)《中醫(yī)婦科治療學(xué)》加減蓯蓉菟絲丸的基礎(chǔ)上，吳克明教授創(chuàng)制新加蓯蓉菟絲湯，臨床用于治療卵巢功能減退類病癥效果顯著［4-7］，但其具體分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。

因此，本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出方劑中的所有有效成分及其治療卵巢功能減退的相關(guān)靶點(diǎn)和通路，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為后續(xù)研究提供一定參考方向。

1材料與方法

1.1新加蓯蓉菟絲湯中藥復(fù)方LC-MS物質(zhì)鑒定分析

1.1.1新加蓯蓉菟絲湯中藥復(fù)方

肉蓯蓉15 g、菟絲子15 g、黃精10 g、淫羊藿15 g、覆盆子10 g、山茱萸10 g、當(dāng)歸10 g、熟地10 g、澤蘭10 g、烏藥10 g（10味藥，共重115 g）。規(guī)格：每115 g生藥加工成12 g免煎顆粒劑。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

質(zhì)譜乙腈（Fisher）、甲酸（Sigma-Aldrich）、質(zhì)譜儀（TripleTOF5600+）、色譜儀（Nexera UHPLC LC-30A）。

1.1NoNhK/aHuKg4W0IaP053yQ==.3實(shí)驗(yàn)方法

取樣品2.5 g于EP管，加入10 mL熱水，超聲10 min， 12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液0.45 μm膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)，進(jìn)樣10 μL。

1.2網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1主要活性成分篩選與潛在靶點(diǎn)信息收集

使用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），將新加蓯蓉菟絲湯中各味中藥分別輸入，并將口服生物利用度、類藥性分別設(shè)置為OB>30%，DL>0.18［8-10］。通過(guò)R包將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成gene symbol。將質(zhì)譜所獲取的化合物輸入Pubchem、Drugbank、TCMSP、SwissTargetPrediction平臺(tái)來(lái)預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)，去重后，共得到374個(gè)靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。在GeneCards（https：//www.genecards.org）及OMIM（http：//www.omim.org）中進(jìn)行搜索卵巢功能減退類病癥，合并兩個(gè)庫(kù)的數(shù)據(jù)后去重，得到潛在疾病靶點(diǎn)。

1.2.2PPI 網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

為更進(jìn)一步闡明新加蓯蓉菟絲湯對(duì)卵巢功能減退類病癥的治療作用，先利用R包對(duì)成分與疾病靶點(diǎn)取交集，并繪制Venn圖。在STRING中的構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)（PPI）中選擇篩選得到的交集靶點(diǎn)，生物種類選定為“人類”，作用閾值選擇“highest confidence”后得到PPI網(wǎng)絡(luò)，保存文件，利用Cytoscape3.7.1的“NetworkAnalyzer”工具進(jìn)行分析，制圖。

1.2.3疾病-靶點(diǎn)-成分作用機(jī)制

將合并后的疾病-靶點(diǎn)-成分關(guān)系文件，導(dǎo)入Cytoscape3.7.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.2.4富集功能分析

將交集靶點(diǎn)利用R包進(jìn)行GO和KEGG分析，分別對(duì)GO中的細(xì)胞組成（CC），生物學(xué)過(guò)程（BP），分子功能（MF）進(jìn)行富集分析并制圖；對(duì)KEGG通路進(jìn)行分析，選取P < 0.01下前20的信號(hào)通路，并繪制柱狀圖。預(yù)測(cè)新加蓯蓉菟絲湯對(duì)卵巢功能減退類病癥的作用機(jī)制。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取7～8周齡、體重約200～220 g的成年雌性SD大鼠30只，所有大鼠實(shí)驗(yàn)前在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。光暗循環(huán)時(shí)間為12 h/12 h，相對(duì)濕度為40%～60%，并配以標(biāo)準(zhǔn)飲食和水，室內(nèi)溫度設(shè)置（25±2）℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自四川成都達(dá)碩生物科技有限公司，SD大鼠使用許可證：SYXK（川）2019-189；SD大鼠生產(chǎn)許可證：SCXY（川）2020-030。清潔級(jí)飼養(yǎng)，由專人負(fù)責(zé)更換墊料、飼料等。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查，審查批件號(hào)為SUCMDL20220304040。

1.3.2藥物、試劑與儀器

新加蓯蓉菟絲湯中藥復(fù)方詳見前LC-MS物質(zhì)鑒定分析、雷公藤甲素（TP，生產(chǎn)批號(hào)：DST200515-034，成都德思特生物技術(shù)有限公司）、戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂(lè)，德國(guó)拜耳醫(yī)藥）、醋酸甲羥孕酮片（浙江仙琚制藥股份有限公司）、倒置生物顯微鏡（DMI1德國(guó)徠卡）、透射電鏡（JEM-1400PLUS）。

1.3.3造模、分組和給藥

購(gòu)入7～8周齡、體重約200～220 g的成年雌性SD大鼠50只，選取其中動(dòng)情周期正常的30只作為本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)選取5只為空白對(duì)照組，其余25只進(jìn)行灌胃造模。雷公藤甲素500 μg/（kg·d） 30 d進(jìn)行造模，各組大鼠均于灌胃結(jié)束前第10 d開始，每日9：00，使用陰道灌洗法采集各組大鼠陰道脫落上皮細(xì)胞：移液槍吸取30 μL生理鹽水，緩慢插入大鼠陰道內(nèi)3～5 mm，吹打3～5次，見液體變渾濁，立即回抽；將每只大鼠的陰道回抽液制備2份陰道涂片，進(jìn)行巴氏染色制片，光鏡下觀察，各組大鼠均出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂或延長(zhǎng)，確定造模成功。將造模成功后的25只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組5只，分別為：模型組、西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，隨機(jī)預(yù)留的5只為空白對(duì)照組，總共6組。給藥：每劑新加蓯蓉菟絲湯生藥總量為115 g，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥劑科制作成免煎顆粒劑（規(guī)格：每115 g生藥加工成12 g免煎顆粒劑），按60 kg成人臨床用藥劑量為12 g/d為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［11］等效劑量系數(shù)折算法，劑量大鼠=6.3×劑量（g/kg） （成人體重按60 kg計(jì)，大鼠按0.2 kg計(jì)）折合后計(jì)算出大鼠的用藥劑量為高劑量2.52 g/（kg·d）、中劑量1.26 g/（kg·d）、低劑量0.63 g/（kg·d），按每只大鼠每100 g體重1 mL量灌胃，每日1次，連續(xù)2周。

1.3.4標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

動(dòng)物處死后，迅速解剖并分離雙側(cè)卵巢，固定組織，中性甲醛固定大于24 h沖洗后全自動(dòng)脫水，石蠟包埋，冷卻后切片，溫水展片，60 ℃以上烤片10～30 min，自動(dòng)HE染色儀加液染色，二甲苯脫蠟置水，中性樹膠封片。光鏡下觀察卵巢結(jié)構(gòu)變化及各級(jí)卵泡。新鮮卵巢組織3%戊二醛固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，濃度間隔20%至5%逐漸縮小，環(huán)氧樹脂置換80 ℃過(guò)夜包埋，包埋塊顯微鏡下仔細(xì)修出便于切片的規(guī)整形態(tài)，分別以醋酸鈾與枸櫞酸鉛染色風(fēng)干后，JEM-1400PLUS透射電鏡下觀察卵巢顆粒細(xì)胞線粒體形態(tài)、線粒體自噬體。

2結(jié)果

2.1新加蓯蓉菟絲湯中藥復(fù)方分析及LC-MS物質(zhì)鑒定分析

新加蓯蓉菟絲湯臨床用治卵巢功能減退類病癥的基礎(chǔ)方。本方主治DOR、POI、POF導(dǎo)致的月經(jīng)后期量少、不孕癥、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)等多種婦科疑難病癥。該方中肉蓯蓉、菟絲子、黃精為君藥，平補(bǔ)肝脾腎三臟，固腎益精。熟地、山茱萸、覆盆子、淫羊藿、當(dāng)歸五味藥共為臣藥，其中熟地滋腎陰、養(yǎng)精血，滋養(yǎng)肝腎之陰血，山茱萸養(yǎng)陰澀精，與熟地共用，補(bǔ)斂兼具，覆盆子和淫羊藿補(bǔ)益肝腎之精，又可同補(bǔ)腎中之陽(yáng)，當(dāng)歸補(bǔ)血，為血中氣藥。澤蘭為佐藥，行氣活血，調(diào)經(jīng)祛瘀。烏藥為使藥，理氣行滯。

通過(guò)混合四極TOF LC-MS質(zhì)譜儀系統(tǒng)完成了對(duì)新加蓯蓉菟絲湯成分鑒定。共鑒定出252個(gè)化合物，其中負(fù)離子物質(zhì)168種、正離子物質(zhì)84種，涵蓋了蛋白質(zhì)與氨基酸類、脂類、糖及其衍生物、有機(jī)酸、酚類和鞣質(zhì)、醌類、內(nèi)酯、香豆精和異香豆精類、木脂素類、萜類、揮發(fā)性成分、生物堿類等物質(zhì)類別，其中以黃酮類、有機(jī)酸類、生物堿類含量較為豐富。（圖1）

2.2基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析新加蓯蓉菟絲湯治療卵巢功能減退類病癥的作用機(jī)制

2.2.1主要活性成分篩選與潛在靶點(diǎn)信息收集

新加蓯蓉菟絲湯經(jīng)質(zhì)譜分析共得到252個(gè)化合物，其中負(fù)離子物質(zhì)168種、正離子物質(zhì)84種，將所獲取的化合物輸入Pubchem、Drugbank、TCMSP、SwissTargetPrediction平臺(tái)來(lái)預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)，共得到374個(gè)靶點(diǎn)。在Gene Cards，OMIM、TTD、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入Premature ovarian failure（POF）、Primary Ovarian Insufficiency（POI）、Diminished ovarian reserve（DOR）關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，將所得到的疾病基因合并去重后得到698個(gè)基因，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R4.1.1中繪制韋恩圖，見圖2。得到新加蓯蓉菟絲湯與“DOR/POI/POF”共有基因42個(gè)，即新加蓯蓉菟絲湯治療“DOR/POI/POF”潛在作用靶點(diǎn)有42個(gè)。

使用Pubchem、Drugbank、化源網(wǎng)對(duì)新加蓯蓉菟絲湯中所獲取的藥物成分進(jìn)行CAS號(hào)、相對(duì)分子質(zhì)量、分子式進(jìn)行補(bǔ)充，并結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行Precursor m/z與Reference m/z的補(bǔ)充，部分成分信息數(shù)據(jù)見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。

2.2.2PPI 網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

將所得到的疾病基因與藥物靶點(diǎn)取交集后輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，進(jìn)行蛋白互作用分析后，下載TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，使用軟件工具欄中的“Network Analyzer”功能，使度值越低的點(diǎn)、線越小越暗，度值越高的點(diǎn)、線越大越明亮，見圖3和表1。網(wǎng)絡(luò)圖中共包含40個(gè)節(jié)點(diǎn)，203條邊，圖中圓形節(jié)點(diǎn)代表每個(gè)基因蛋白，邊代表蛋白相互作用關(guān)系。使用“cytoHubba”對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行度值分析，得到蛋白互作關(guān)系排名前10的蛋白為COMT、HIF1A、AKT1、CHRNA4、VEGFA、MAOA、TNF、ESR2、ESR1、SLC6A3。

將篩選得到的基因輸入Cytoscape3.7.1中，選擇BisoGenet功能，繪制出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI，共得到2 200個(gè)節(jié)點(diǎn)，45 832條邊。使用CytoNCA插件對(duì)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，選擇DC模式，并選擇最小值61篩選得到網(wǎng)絡(luò)圖，篩選后共得到466個(gè)節(jié)點(diǎn)，16 623條邊。將所得到的網(wǎng)絡(luò)圖放大后選擇BC模式，最小值選擇600篩選得到網(wǎng)絡(luò)圖，篩選后共得到72個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 058條邊，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。

2.2.3疾病-靶點(diǎn)-成分作用機(jī)制

將所得到的藥物成分CAS號(hào)和疾病基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1繪制“疾病-靶點(diǎn)-成分”網(wǎng)絡(luò)圖，得到包括147個(gè)節(jié)點(diǎn)和153條邊，每條邊則表示化合物分子與靶點(diǎn)之間的潛在作用關(guān)系，見圖4。

2.2.4富集功能分析

通過(guò)R4.1.1對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集可視化。在GO功能富集過(guò)程中共得到1 272條結(jié)果，主要涉及BP（1 168項(xiàng)）、CC（45項(xiàng)）和MF（59項(xiàng)）。以pvalueCutoff=0.05， qvalueCutoff=0.05為篩選條件，獲得1 272個(gè)條目，篩選出涉及BP、CC和MF的前20條富集結(jié)果。在BP方面，主要涉及對(duì)活性氧代謝過(guò)程調(diào)控、對(duì)單胺轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控、對(duì)磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路的調(diào)控、對(duì)多巴胺代謝過(guò)程的調(diào)控等，見圖5（a）；在CC方面，主要涉及突觸后膜、突觸膜、線粒體、膜蛋白突觸后膜的固有成分、膜筏等，見圖5（c）；在MF方面，主要涉及兒茶酚胺結(jié)合、胺結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性等，見圖5（b）。KEGG通路富集顯示新加蓯蓉菟絲湯參與的通路有AGE-RAGE信號(hào)通路、Prolactin信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，Mitophagy-animal過(guò)程等，KEGG通路見圖5（d）。Mitophagy-animal過(guò)程中共富集了三個(gè)靶基因Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。其中PINK1作為線粒體去極化的傳感器，招募Parkin，然后泛素依賴性招募線粒體吞噬受體。Mitophagy-animal過(guò)程，見圖6。

2.3新加蓯蓉菟絲湯動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1中藥對(duì)大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡觀察下，與空白對(duì)照組（Control）相比，TP模型組（TP）卵巢組織病理改變程度顯著加重，可見卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡增多，顆粒層細(xì)胞排列紊亂、脫落、壞死、卵泡囊性擴(kuò)張和血管充血等病理改變。與TP組相比較，新加蓯蓉菟絲湯低劑量組（TP+XJCRTST-Low）卵巢組織病理改變程度相對(duì)略微減輕，新加蓯蓉菟絲湯中劑量組（TP+XJCRTST-Middle）組卵巢組織病理改變程度相對(duì)較輕，TP+XJCRTST-High組和西藥組（TP+EV）卵巢組織病理改變程度相對(duì)最輕。（詳見圖7）

2.3.2中藥對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中線粒體形態(tài)學(xué)的影響

Control組：電鏡下見卵巢顆粒細(xì)胞其細(xì)胞核呈不規(guī)則多邊形，染色質(zhì)分布均勻，以常染色質(zhì)為主，核膜清晰完整；胞漿中可見線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細(xì)胞器且結(jié)構(gòu)完整清晰。TP組：卵巢顆粒細(xì)胞中見大量腫脹的線粒體，其嵴斷裂、溶解甚至消失，偶見有線粒體自噬。TP+EV組：卵巢顆粒細(xì)胞中多數(shù)線粒體已發(fā)生輕度腫脹，亦可見多量線粒體自噬。TP+XJCRTST-High組：卵巢顆粒細(xì)胞中多數(shù)線粒體已發(fā)生輕度腫脹，亦可見多量線粒體自噬。TP+XJCRTST-Middle組：卵巢顆粒細(xì)胞中多數(shù)線粒體已發(fā)生輕度腫脹，可見有少量線粒體自噬。TP+XJCRTST-Low組：卵巢顆粒細(xì)胞中多數(shù)線粒體已發(fā)生腫脹，嵴斷裂、溶解甚至消失，偶見有線粒體自噬。（見圖8）

3討論

卵巢功能減退是指卵巢內(nèi)可募集卵泡數(shù)量和質(zhì)量降低，并伴隨低雌激素及高促性腺激素，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂或閉經(jīng)，生育力降低或不孕。根據(jù)中醫(yī)學(xué)腎藏精、主生殖和精血同源的基本理論，認(rèn)為卵子屬腎中之精，精能生血，血可養(yǎng)精，卵泡發(fā)育賴于腎精充盛，卵子排出有賴腎氣鼓動(dòng)，因此，卵巢功能減退的核心病機(jī)是腎氣不足、精血虧虛，因虛致瘀，根本治法應(yīng)補(bǔ)腎益精、養(yǎng)血活血。課題組臨床運(yùn)用補(bǔ)腎養(yǎng)血活血中藥復(fù)方新加蓯蓉菟絲湯，治療卵巢功能減退類疾病療效肯定［4-7］。

本研究通過(guò)LC-MS技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，共篩選出補(bǔ)腎養(yǎng)血活血中藥復(fù)方新加蓯蓉菟絲湯中的有效成分252種，以黃酮類、有機(jī)酸類、生物堿類含量較為豐富；其治療卵巢功能減退類疾病潛在作用靶點(diǎn)有42個(gè)、得到COMT、HIF1A等蛋白是其核心靶點(diǎn)，參與通路主要涉及AGE-RAGE、Prolactin及TNF信號(hào)通路等，Mitophagy-animal過(guò)程中共富集了3個(gè)靶基因Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。本次篩選出新加蓯蓉菟絲湯中有效成分黃酮類物質(zhì)，也是本方君藥肉蓯蓉和菟絲子的主要活性成分，在以往研究中顯示［12-14］：菟絲子黃酮可減輕因雷公藤多苷造成的大鼠POF，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，其在大鼠體內(nèi)具有雌激素樣活性，通過(guò)影響動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)揮對(duì)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用；肉蓯蓉總黃酮抗氧化效果最佳，能提高線粒體抗氧化活性，改善線粒體功能。后續(xù)篩選出的富集靶基因Parkin/PINK1，是目前研究較多的、經(jīng)典的線粒體質(zhì)量控制信號(hào)通路， PINK1是具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的線粒體外膜蛋白， 作為分子感受器，接收受損線粒體的分子信號(hào); Parkin是具有E3泛素連接酶活性的蛋白， 主要有調(diào)節(jié)蛋白降解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用。PINK1位于Parkin上游， 兩者間協(xié)調(diào)控制各自表達(dá)水平， 誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生［15］。以上研究結(jié)果提示新加蓯蓉菟絲湯中黃酮類藥效成分可能是通過(guò)線粒體質(zhì)量控制信號(hào)通路發(fā)揮其治療作用。

進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：模型組大鼠卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡增多，顆粒層細(xì)胞脫落等病理改變，而中藥各組卵巢卵泡數(shù)量增加、顆粒細(xì)胞脫落等病理改變減輕。電鏡觀察表明，與模型組相比，經(jīng)中藥各組治療后，顆粒細(xì)胞線粒體腫脹減輕，其嵴斷裂、溶解、消失均未明顯見到，同時(shí)線粒體自噬現(xiàn)象增多，表明新加蓯蓉菟絲湯可能通過(guò)改善線粒體病理狀態(tài)、修復(fù)線粒體功能的同時(shí)，增加線粒體自噬水平從而起到修復(fù)顆粒細(xì)胞損傷的作用。以上研究結(jié)果初步表明新加蓯蓉菟絲湯可能通過(guò)線粒體自噬途徑促卵泡發(fā)育的分子機(jī)制。

本研究基于LC-MS、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后期驗(yàn)證，初步證實(shí)新加蓯蓉菟絲湯通過(guò)線粒體自噬途徑促卵泡發(fā)育的分子機(jī)制，這一結(jié)果為后期深入探討該方在治療卵巢功能減退類病癥的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為補(bǔ)腎養(yǎng)血活血類中藥復(fù)方通過(guò)顆粒細(xì)胞線粒體自噬促卵泡發(fā)育的研究提供了新方向。但本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處，如未將線粒體自噬通路相關(guān)蛋白做Western blot檢測(cè)。

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