基于細胞膜色譜技術(shù)的鹿角膠肽段篩選及鑒定

摘要：利用細胞膜色譜/超高相液相色譜-質(zhì)譜（CMC/UPLC-MS）方法對中藥飲片鹿角膠中的有效成分進行篩選，結(jié)合Maxquant軟件、Perseus軟件以及Uniprot數(shù)據(jù)庫對所得譜圖進行數(shù)據(jù)分析，使用Protein Data Bank對分析結(jié)果進行結(jié)構(gòu)鑒定，同時采用生物信息學平臺對這些肽段的生物活性、不良反應、相對分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定指數(shù)等基本分子特性進行預測。鑒定肽段活性概率為0.09，無毒，無溶血性，有致敏性，相對分子質(zhì)量為1 541.68，肽鏈長度為14，親水性為良好，等電點值為3.92，不穩(wěn)定性指數(shù)為34.39。該方法為快速篩選鑒定具有藥理作用的多肽和蛋白質(zhì)等活性成分提供了一條可行的研究思路。

關(guān)鍵詞：鹿角膠；細胞膜色譜；骨髓間充質(zhì)干細胞；白細胞介素-1β

中圖分類號：R284文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2024）05-0001-09

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

To explore the pharmacodynamic substance basis of Cervi Cornus Colla

based on cell membrane chromatography

SUN Tiefeng1， ZHAO Yu2，WANG Ping1*，DING Xianglong3，DING Lijun4，WANG Jinguo

4

（1.Shandong Academic of Chinese Medicine， Jinan 250014，China； 2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，

Jinan 250355，China； 3.Huangdao District Second Hospital of Traditional Chinese Medicine，Qingdao 266400，China；

4.Rizhao Traditional Chinese Medicine Hospital，Rizhao 276800，China）

Abstract∶Cell membrane chromatography/ultrahigh-phase liquid chromatography-mass spectrometry （CMC/UPLC-MS） was used to screen the active ingredients， i.e.， peptides， in the traditional Chinese medicine tablet Cervi cornus Colla， and the obtained spectra were analyzed using Maxquant software， Perseus software， and Uniprot database. Structures of these peptides were identified using Protein Data Bank， and their molecular properties such as their biological activity， adverse reactions， relative molecular mass， isoelectric point， and stability index were predicted using a bioinformatics platform. With an activity probability of 0.09， the peptides were identified as nontoxic， nonhemolytic， sensitizing， and highly hydrophilic， with a relative molecular mass of 1 541.68， a peptide chain length of 14， an isoelectric point of 3.92， and an instability index of 34.39.This method provides a feasible research approach for rapidly screening and identifying active ingredients（e.g.， peptides and proteins） that exhibit pharmacological effects.

Key words∶Cervi Cornus Colla；cell membrane chromatography；bone marrow mesenchymal stem cells；interleukin-1β

骨質(zhì)疏松（ostcoporosis，OP）是一種全身性骨病，其病理學主要特征為骨代謝失衡導致的骨過度吸收。根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會在2018年發(fā)布的中國骨質(zhì)疏松癥流行病學調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國40～49歲人群低骨量率達到32.9%［1］。因此找到一種有效促進軟骨重建、修復受損軟骨和恢復關(guān)節(jié)功能的治療方案已經(jīng)成為治療OP亟待解決的問題。近年來，隨著對骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的深入研究，許多學者發(fā)現(xiàn)BMSCs在軟骨重建、修復受損軟骨和恢復關(guān)節(jié)功能上發(fā)揮了重要作用［2］。

在中醫(yī)的藏象理論中，腎主骨生髓，腎藏精，精生髓，髓充骨，故目前多認為骨質(zhì)疏松的中醫(yī)核心病機為“腎精虧虛”。鹿角膠始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘、咸，性溫，主歸肝、腎經(jīng)，具有補氣血、益精髓、強筋骨等作用，可以用于治療跌打損傷、腎氣不足、虛勞羸瘦、腰痛等疾病。目前，針對鹿角膠有效成分分離純化方法的研究主要集中在像離子交換色譜、凝膠色譜等分離純化速度較慢的多維色譜上，而對能夠直接篩選純化中藥活性成分的細胞膜色譜技術(shù)［3］的研究尚有欠缺，仍需研究人員深入探索。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，利用鹿角膠及其酶解產(chǎn)物可有效誘導BMSCs向成骨細胞分化［4-5］。因此本實驗選取鹿角膠和BMSCs應用細胞膜色譜法，以期對鹿角膠促成骨化的藥效物質(zhì)進行快速篩選分離純化鑒定。

1材料和方法

1.1材料

（1）細胞：骨髓間充質(zhì)干細胞（賽業(yè)生物科技）。

（2）藥材及主要試劑見表1。

（3）主要儀器見表2。

（4）研究涉及的數(shù)據(jù)庫和軟件見表3。

2方法

2.1樣品制備

鹿角膠是將鹿角片加水煎煮、濃縮制成的固體狀可食用膠。本研究鹿角片購于國藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究室林慧彬研究員鑒定為正品，制備方法和鑒別方法按照2020年版《中華人民共和國藥典》［6］“鹿角膠”項下進行。把鹿角片放在圓底燒瓶中，加入水煎煮兩次，合并膠汁，用50 ℃真空減壓濃縮，冷卻到室溫即為鹿角膠，采用輻射滅菌，4 ℃保存。取前期實驗制備好的鹿角膠置高速萬能粉碎機粉碎，過120目篩。精密稱定鹿角膠粉末50 mg，放置25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容后，用超聲提取15 min，蒸餾水補足失重［7］，即得鹿角膠水溶液（2 mg/mL）。

精密量取鹿角膠水溶液5 mL，用0.22 μm微孔濾膜濾過，緩慢上樣，依次用10 mL水和10 mL乙腈洗脫［8］，收集洗脫液置于錐形瓶中。將洗脫液減壓濃縮，分別用水和乙腈定容于5 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得樣品。

2.2BMSCs細胞膜色譜固定相的制備

用PBS把BMSCs（細胞濃度為4×107/mL）洗滌3次，而后在-20 ℃反復凍融3次，加10 mL PBS，用1 000 r/min離心10 min，得到細胞懸浮液，棄去沉淀。上清液在4 ℃下使用10 000 r/min離心20 min。把沉淀與5 mL PBS混合（1 mg/mL）后，渦旋5 min，成為細胞膜懸液。將5 mL細胞膜混懸液緩慢加入6 mL的C18固相萃取柱中，于4 ℃下孵育12 h后，混合物用5 mL PBS洗滌3次，即為CMC固定相［9］。對照組固定相為以5 mL PBS溶液緩緩加入C18色譜柱中，于4 ℃孵育12 h后，用5 mL PBS洗滌3次得到的混合物。

2.3UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS實驗條件

2.3.1色譜條件

Water ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，95%B；3 min，95%B；9 min，50%B；28 min，5%B；28.1 min，95%B；31 min，0%B），流速0.3 mL/min，進樣量40 μL，柱溫35 ℃。

2.3.2質(zhì)譜條件

離子源為加熱電噴霧離子源（HESI），掃描模式為一級質(zhì)譜全掃描結(jié)合自動觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描模式（FullMS/dd-MS2），掃描范圍m/z 80～1 500，一級質(zhì)譜分辨率70 000，二級質(zhì)譜分辨率17 500，正離子模式毛細管電壓3.8 kV，負離子模式毛細管電壓3 kV，毛細管溫度和氣化溫度均為350 ℃，鞘氣和輔助氣均為N2，鞘氣流速和輔助氣流速分別為45 arb和15 arb，高壓環(huán)形離子導入裝置電壓（S-LensRFLevel）為55。階梯碰撞能量20、40、60 eV。

2.4鹿角膠中肽段的鑒定

2.4.1軟件分析

利用Xcalibur4.3（Thermo Fisher Scientific，USA）軟件進行譜圖分析。

2.4.2Maxquant參數(shù)設置

將Xcalibur產(chǎn)生的RAW原始數(shù)據(jù)使用Maxquant軟件（版本2.4.0.0）搜庫。以Uniprot數(shù)據(jù)庫收錄至馬鹿和梅花鹿蛋白庫Red deer（reviewed，32條序列，2023-05-05下載，全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1）和Sika deer（reviewed，14條序列，2023-05-05下載，全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表2）為檢索數(shù)據(jù)庫，實驗參數(shù)設置為No Fraction和Label free quantification，其他參數(shù)均為默認值［10］。

2.4.3Perseus參數(shù)設置

將Maxquant產(chǎn)生的proteinGroups.txt和peptides.txt數(shù)據(jù)使用Perseus軟件（版本2.0.10.0）處理。過濾污染蛋白（potential contamiant）和unique peptide>1的蛋白，以期得到獨立肽段［11］。

2.5鹿角膠肽段生物信息學分析

2.5.1鹿角膠肽段生物活性與不良反應預測

對具有潛在藥理作用的多肽類和蛋白類藥物進行生物活性與毒性預測，可以為研究節(jié)省時間和實驗成本。通過在線網(wǎng)站PeptideRanker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）可以預測肽段的生物活性概率［12］。通過在線網(wǎng)站ToxIBTL（https：//server.wei-group.net/ToxIBTL/ProcessServlet）可以預測肽段毒性［13］。利用在線網(wǎng)站Hemopred（http：//codes.bio/hemopred/）可以對肽段進行溶血性預測［14］，利用在線網(wǎng)站Algpred2.0（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred/submission.html）可以對肽段進行致敏性預測［15］。

2.5.2鹿角膠肽段基本分子特性預測

對具有潛在藥理作用的肽段進行基本分子特性預測，可以為樣品的提取分離純化等實驗研究提供可靠的參考意見。通過在線預測網(wǎng)站（https：//pepcalc.com-Peptide calculator）可以預測鑒定得到的肽段的水溶性。利用Expasy ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam）可以預測肽段的不穩(wěn)定性指數(shù)及PI值［16］，還可以得到肽段的化學分子式。不穩(wěn)定指數(shù)可以初步判斷肽段在實驗中穩(wěn)定與否，結(jié)果小于40為穩(wěn)定，結(jié)果大于40則可能不穩(wěn)定。

3結(jié)果與分析

3.1鹿角膠中促成骨化活性成分的篩選和鑒定

3.1.1鹿角膠水溶液和乙腈溶液中肽段的鑒定

在正負離子模式下，鹿角膠水溶液和乙腈溶液的總離子流圖見圖1、圖2，利用Maxquant鑒定譜圖中的肽段，Maxquant鑒定所得肽段具體見表4。

使用Perseus去除常見Potential contaminant以及unique peptide>1的肽段后［17］，得到肽段GDTPTLQLEEVDPK，F(xiàn)DR在1%以下，鑒定可信度良好。經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)過人工核驗的馬鹿和梅花鹿蛋白序列庫鑒定該肽段屬于蛋白P51745序列的一部分。除此之外，在未經(jīng)過人工驗證的馬鹿和梅花鹿蛋白序列庫中還發(fā)現(xiàn)了另一擁有該肽段的蛋白，其Protein ID為D5KXX5。肽段GDTPTLQLEEVDPK在蛋白P51745和D5KXX5上的序列信息見表5～6。經(jīng)PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫鑒定P51745為白細胞介素-1β，而D5KXX5未得到鑒定結(jié)果。Perseus得到的肽段質(zhì)譜圖見圖3。

3.2鹿角膠肽段生物信息學分析

3.2.1鹿角膠肽段生物活性、不良反應預測

鹿角膠肽段生物學信息見圖4所示。通常情況下，在Peptide Ranker中得到的生物活性預測結(jié)果大于0.5時，表明該活性肽段具有生物活性的概率較高。鑒定得到的鹿角膠肽段的活性概率為0.09，毒性預測結(jié)果為non-toxic，溶血性預測結(jié)果為non-hemolytic，致敏性預測及結(jié)果為ALLERGEN。通過肽的生物活性預測結(jié)果可知該活性肽段的生物活性偏低，因此在研究鹿角膠肽段的藥理作用時，可以通過氨基酸突變、修飾等方式提高該活性肽段的活性。不良反應預測結(jié)果則為鹿角膠肽段實驗研究過程中的突發(fā)情況提供了參考。

3.2.2鹿角膠肽段基本分子特性預測

經(jīng)Expasy ProtParam tool預測可知，肽段相對分子質(zhì)量為1 541.68，肽鏈長度為14，與Maxquant分析結(jié)果基本一致。肽段親水性為Good water solubility，水溶性良好；PI值為3.92，不穩(wěn)定性指數(shù)為34.39。Gao等［18］人利用HPLC-MS/MS和MALDI-TOF MS在分子量和等電點方面鑒別了提取的416種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)分子量主要分布在10～200 kDa，PI分布在3.84～11.57之間的蛋白質(zhì)在水中穩(wěn)定性強，本實驗結(jié)果符合其檢測結(jié)論。因此在研究鹿角膠時，其潛在有效成分的提取可以采用超聲輔助水溶液提取。

4討論

動物藥是中藥的重要組成部分，其預防和治療疾病的歷史長達數(shù)千年。在治療骨骼類疾病方面，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)動物藥主要有效成分為蛋白質(zhì)類、多肽類和氨基酸等提取物［19-21］。關(guān)于動物藥的研究思路主要是把通過分離純化后得到的較為單一的成分進行鑒定和活性驗證的傳統(tǒng)研究思路。這種研究思路很大程度上忽視了中藥多組分多靶點協(xié)同作用的中藥藥理學機制［22］，對研究以多肽和氨基酸等為主要藥效物質(zhì)的動物藥來說，不僅耗時長而且實驗結(jié)果往往差強人意。而細胞膜色譜技術(shù)作為一種基于活性細胞膜可特異性結(jié)合中藥活性成分的技術(shù)，可以在體外動態(tài)的模擬藥物與體內(nèi)靶點之間的相互作用，非常貼合中藥多成分多靶點的作用機制［23-26］。

鹿角膠是一種具有廣泛藥理作用的動物類中藥。目前，在研究鹿角膠治療與骨相關(guān)疾病的作用機制上有著顯著的研究進展。有研究發(fā)現(xiàn)，它不僅能夠促進BMSCs的成骨相關(guān)基因COLI、integrin-α2、integrin-α5以及integrin-β1的表達，還能夠使其鈣化結(jié)節(jié)和分化為成骨細胞的數(shù)量顯著增加［27］。本研究以鹿角膠為例采用新的實驗方法建立了BMSCs細胞膜色譜模型，聯(lián)合超高效液相-質(zhì)譜從鹿角膠水溶液中篩選促成骨化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［28］，并通過Maxquant和Perseus軟件分析鑒定出其活性成分，同時采用生物學信息平臺預測實驗結(jié)果的生物活性、不良反應以及基本分子特性。證實鹿角膠中的多肽類活性成分與BMSCs細胞膜有親和靶點，并為動物藥中多肽類有效成分的篩選和進一步的開發(fā)研究提供一條可行的研究思路。最終鑒定得到的鹿角膠肽段數(shù)量相對太少，猜測原因可能與鹿角膠水溶液中的某些大分子蛋白和BMSCs細胞膜的生物親和性有限相關(guān)。

隨著動物藥的開采利用，其資源日益稀缺，而動物藥成分復雜多樣，傳統(tǒng)的分離純化方法需要適合蛋白質(zhì)、多糖、多肽等成分的理化性質(zhì)，這種分離純化方法耗費時間長、經(jīng)濟成本高且不能可靠地得到具有藥理作用的生物活性成分，因此亟需找到一種可靠的分離純化方法，加速動物藥藥效物質(zhì)的研究，開發(fā)合成新藥，從而緩解藥用資源的稀缺［29-34］。細胞膜色譜作為一種利用分子和受體特異性結(jié)合的性質(zhì)篩選具有藥理作用的生物活性成分的技術(shù)，不僅經(jīng)濟成本低廉，還能大大提高中藥有效成分篩選速度，并且對靶向性不明的動物藥提供了一種可行的實驗方案，也可促進中藥多靶點多組分治療作用機制深入闡釋。

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