丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚麻醉效果及肝臟生理生化指標(biāo)的影響

摘 要：為提高細(xì)點(diǎn)石斑魚（Epinephelus cyanopodus）在運(yùn)輸、分苗和增殖放流標(biāo)記中的成活率，明確麻醉運(yùn)輸?shù)臐舛?，測(cè)定了不同質(zhì)量濃度丁香酚對(duì)體質(zhì)量為（27.84±6.91）g的細(xì)點(diǎn)石斑魚的麻醉效果，以及丁香酚質(zhì)量濃度分別為5 mg/L和9 mg/L時(shí)對(duì)魚體肝臟生理生化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：在（29.5±0.3）℃條件下，當(dāng)丁香酚濃度為5 mg/L和10 mg/L時(shí)，細(xì)點(diǎn)石斑魚最終麻醉狀態(tài)分別為深度鎮(zhèn)靜期和輕度麻醉期，并在4 min內(nèi)恢復(fù)正常。在麻醉與復(fù)蘇試驗(yàn)中，5 mg/L組細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟生化指標(biāo)與對(duì)照組沒有顯著差異，9 mg/L組麻醉6 h肝臟SOD、CAT、ALT和AST顯著低于對(duì)照組，經(jīng)12 h清水復(fù)蘇后酶活性恢復(fù)至正常，證明其影響是可逆的。因此，可選質(zhì)量濃度為5 mg/L的丁香酚用于12 h的麻醉運(yùn)輸。

關(guān)鍵詞：細(xì)點(diǎn)石斑魚（Epinephelus cyanopodus）；丁香酚；麻醉；生化指標(biāo)

作者簡介：黃瓊?cè)~（1990.11-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)病害。E-mail：huangqiongye@qq.com。

通訊作者：張建明（1984.08-），男，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖。 E-mail：15960507635@163.com。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.10.005

細(xì)點(diǎn)石斑魚（Epinephelus cyanopodus）隸屬鱸形目（Perciformes），鮨科（Sarranidae），石斑魚屬（Epinephelus），為暖水礁棲肉食性魚類，分布于熱帶、亞熱帶海域，是珊瑚礁的重要魚類，也是重要的海洋經(jīng)濟(jì)名貴食用魚類。

水產(chǎn)養(yǎng)殖操作經(jīng)常將魚暴露于各種急性應(yīng)激環(huán)境中，這些脅迫應(yīng)激可能對(duì)魚類的生存、生長等產(chǎn)生不良的影響。麻醉劑可以緩解魚類的疼痛、誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜從而降低操作給魚體帶來的應(yīng)激反應(yīng)，有效減少魚體傷害，進(jìn)而提高成活率。因此，麻醉劑被廣泛用于魚類形態(tài)學(xué)測(cè)量、捕撈、運(yùn)輸和標(biāo)記放流等研究工作中。但麻醉劑自身也是一種應(yīng)激源，如何安全有效地使用漁用麻醉劑引起人們的廣泛關(guān)注。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的麻醉劑有丁香酚、MS-222等，丁香酚作為一種植物提取物，具有麻醉鎮(zhèn)痛的作用，且安全高效、價(jià)格低廉、實(shí)用性好。關(guān)于丁香酚用于魚類麻醉研究已有大量報(bào)道，如斑馬魚、俄羅斯鱘、鯽、羅非魚、大黃魚等魚類。但丁香酚用于細(xì)點(diǎn)石斑魚麻醉研究未見報(bào)道，為了提高細(xì)點(diǎn)石斑魚在運(yùn)輸、分苗和增殖放流標(biāo)記中的成活率，明確麻醉運(yùn)輸?shù)臐舛?，本試?yàn)進(jìn)行了細(xì)點(diǎn)石斑魚的丁香酚麻醉試驗(yàn)，并分析了丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚抗氧化酶、堿性磷酸酶（AKP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用細(xì)點(diǎn)石斑魚來自福建省寶森水產(chǎn)科技有限公司，挑選健康活力強(qiáng)的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)魚體長為（11.69±0.94）cm，體質(zhì)量為（27.84±6.91）g，試驗(yàn)前禁食24 h，將魚暫養(yǎng)于50 L相同塑料圓桶中，試驗(yàn)期間不投餌。水溫（29.5±0.3）℃，鹽度（31.5±0.5）‰，試驗(yàn)期間保持微充氣。

丁香酚為分析純，購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，為淡黃色液體，難溶于水，使用前用無水乙醇（1∶9，V∶V）配制成母液后再溶于水，為保障丁香酚溶液的有效性，使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 麻醉試驗(yàn) 為確定細(xì)點(diǎn)石斑魚的有效麻醉濃度，將丁香酚配制成濃度為5、10、15、20、25 mg/L 5個(gè)濃度梯度組，每個(gè)梯度組設(shè)置6尾魚，每尾魚單獨(dú)觀察活動(dòng)情況，用秒表記錄麻醉和復(fù)蘇的時(shí)間并只使用一次。結(jié)合在麻醉劑作用下細(xì)點(diǎn)石斑魚表現(xiàn)出的行為變化，參照劉長琳等、Cooke等的分類標(biāo)準(zhǔn)，將麻醉過程分為6個(gè)階段，完全復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)為行為完全恢復(fù)（表1）。

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集 按照麻醉試驗(yàn)獲得的麻醉劑質(zhì)量濃度，設(shè)置對(duì)照組、5 mg/L組、9 mg/L組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾魚，分別置于50 L相同塑料圓桶中。開展12 h靜水麻醉試驗(yàn)，麻醉12 h后在清水中復(fù)蘇12 h（記為24 h），分別在麻醉及復(fù)蘇的第6、12、24 h取樣，每個(gè)重復(fù)組取2尾，經(jīng)75%酒精體表消毒后，冰盤上剖取肝臟組織，置于5 mL離心管中，-20 ℃冰箱保存，用于酶學(xué)分析。

1.2.2.2 肝臟生化指標(biāo)測(cè)定 樣品用預(yù)冷生理鹽水漂洗去除組織液，濾紙拭干，稱質(zhì)量后加入9倍體積的生理鹽水，經(jīng)均質(zhì)機(jī)低溫研磨制成10%組織勻漿液，再在4 ℃下2 000 r/min離心15 min，取上清液用于總蛋白（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的測(cè)定，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，按照說明書方法進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，經(jīng)SPSS 27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)方差同質(zhì)性檢驗(yàn)后，使用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚的麻醉及復(fù)蘇效果

不同質(zhì)量濃度的丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚的麻醉及復(fù)蘇效果見表2。由表2可知，隨著丁香酚質(zhì)量濃度的增加，魚體的最終麻醉時(shí)間逐漸縮短。當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，魚體可以進(jìn)入深度鎮(zhèn)靜期（A2）；當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為10、15 mg/L時(shí)，魚體最終麻醉狀態(tài)可分別達(dá)到輕度麻醉期（A3）、麻醉期（A4）；當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為20 mg/L和15 mg/L時(shí)，魚體均可進(jìn)入深度麻醉期（A5）。當(dāng)丁香酚濃度為5～15 mg/L時(shí)，復(fù)蘇時(shí)間呈遞增趨勢(shì)，丁香酚濃度為15～25 mg/L時(shí)，復(fù)蘇時(shí)間則逐漸縮短，且恢復(fù)時(shí)間均在4 min內(nèi)。

2.2 丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟SOD酶活性的影響

從圖1中可看出5 mg/L麻醉組與對(duì)照組相比，6 h、12 h肝臟SOD活力沒有顯著差異，24 h肝臟SOD活力顯著低于對(duì)照組；9 mg/L麻醉組與對(duì)照組相比，6 h肝臟SOD活力顯著低于對(duì)照組，12 h與對(duì)照組肝臟SOD活力沒有顯著差異，24 h肝臟SOD活力顯著高于對(duì)照組。

2.3 丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟CAT酶活性的影響

從圖2中可看出5 mg/L麻醉組與對(duì)照組相比，6 h、12 h肝臟CAT活力沒有顯著差異，24 h肝臟CAT活力顯著低于對(duì)照組；9 mg/L麻醉組與對(duì)照組相比，6 h肝臟CAT活力顯著低于對(duì)照組，12 h、24 h與對(duì)照組肝臟CAT活力沒有顯著差異。

2.4 丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟AKP酶活性的影響

從圖3中可看出5 mg/L麻醉組與對(duì)照組相比，6 h、12 h、24 h肝臟AKP活力沒有顯著差異；9 mg/L麻醉組與對(duì)照組和5 mg/L麻醉組相比，6 h、12 h肝臟AKP活力略高于其他2組但差異不顯著，24 h肝臟AKP活力顯著高于對(duì)照組和5 mg/L麻醉組。

2.5 丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟 ALT酶活性的影響

從圖4中可看出5 mg/L麻醉組與對(duì)照組相比，6 h肝臟ALT活力顯著低于對(duì)照組，12 h、24 h肝臟AST活力沒有顯著差異；9 mg/L麻醉組與對(duì)照組和5 mg/L麻醉組相比，6 h肝臟AST活力顯著低于其他2組，12 h、24 h肝臟AST活力沒有顯著差異。

2.6 丁香酚對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟AST酶活性的影響

從圖5中可看出5 mg/L麻醉組與對(duì)照組相比，6 h、12 h、24 h肝臟AST活力沒有顯著差異；9 mg/L麻醉組與對(duì)照組和5 mg/L麻醉組相比，6 h肝臟AST活力顯著低于其他2組，12 h、24 h肝臟AST活力沒有顯著差異。

3 討論

3.1 丁香酚濃度對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚麻醉和復(fù)蘇行為的影響

丁香酚作為天然的麻醉劑，國內(nèi)外學(xué)者已在多種魚類上進(jìn)行了丁香酚麻醉試驗(yàn)，均得到了較好的麻醉效果。從本試驗(yàn)結(jié)果看，丁香酚能讓魚體較快地達(dá)到麻醉和復(fù)蘇狀態(tài)，時(shí)效性較高。但是麻醉運(yùn)輸中麻醉劑量的選擇是重要的一環(huán)，麻醉劑濃度過高可能會(huì)使魚體出現(xiàn)窒息死亡，使成活率降低；而麻醉劑濃度過低則在運(yùn)輸過程中魚體較難處于鎮(zhèn)靜狀態(tài)。本試驗(yàn)中，當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為5～10 mg/L時(shí)，細(xì)點(diǎn)石斑魚均能在3 min內(nèi)進(jìn)入深度鎮(zhèn)靜期到輕度麻醉期之間，并在4 min內(nèi)恢復(fù)到正常狀態(tài)。因此，本試驗(yàn)在研究丁香酚濃度對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟生化指標(biāo)的影響中選擇了5 mg/L和9 mg/L。

3.2 丁香酚濃度對(duì)細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD，Superoxide Dismutase））和過氧化氫酶（CAT，Catalase）是魚體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶。它們參與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)平衡和應(yīng)對(duì)環(huán)境應(yīng)激具有重要作用。SOD主要通過中和超氧自由基，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2），從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。隨后，CAT將H2O2分解為H2O和氧氣，進(jìn)一步清除有害物質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。陳旭等使用9 mg/L濃度的丁香酚運(yùn)輸卵形鯧鲹魚苗8 h后，總超氧化物歧化酶（T-SOD）和CAT活性顯著降低。狄大可使用6 mg/L的丁香酚連續(xù)作用褐籃子魚4 h后，SOD和CAT活性顯著降低。本試驗(yàn)中，9 mg/L試驗(yàn)組在麻醉6 h后，細(xì)點(diǎn)石斑魚肝臟的SOD和CAT活性顯著低于對(duì)照組，與上述結(jié)果一致。丁香酚是一種具有抗氧化作用的化合物，可以阻止魚體內(nèi)自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而降低并清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。因此，低濃度的丁香酚可以增加SOD和CAT的活性，從而提高細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激引起的損傷，然而，過量的丁香酚可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常。本試驗(yàn)中，5 mg/L試驗(yàn)組6 h、12 h時(shí)與對(duì)照組均無差異，證明在該濃度下不會(huì)對(duì)SOD和CAT活性造成影響，但24 h肝臟內(nèi)丁香酚累積到一定量，此時(shí)抗氧化系統(tǒng)開始啟動(dòng)，導(dǎo)致顯著低于對(duì)照組。而9 mg/L試驗(yàn)組在麻醉6 h時(shí)由于丁香酚濃度過高，抑制了魚苗的抗氧化系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響，導(dǎo)致SOD和CAT活性顯著低于對(duì)照組。12 h時(shí)可能魚苗對(duì)丁香酚產(chǎn)生了一定的耐受力，體內(nèi)的SOD和CAT活性恢復(fù)至正常水平，24 h時(shí)體內(nèi)SOD經(jīng)進(jìn)一步誘導(dǎo)使得顯著高于對(duì)照組。

堿性磷酸酶（AKP，Alkaline Phosphatase）主要參與磷酸基團(tuán)的代謝和轉(zhuǎn)移，是維持魚類正常生理功能和健康狀態(tài)的重要調(diào)控酶。AKP還參與肝臟的解毒過程，幫助魚類代謝和排出體內(nèi)有害物質(zhì)，抵御環(huán)境中的有害化學(xué)物質(zhì)和污染物，維護(hù)其健康。有試驗(yàn)表明，使用33 mg/L丁香酚對(duì)鱸魚進(jìn)行10 min麻醉后，AKP活性顯著增加，24 h后AKP活性仍然顯著增加。羅相忠等研究表明，使用MS-222可以提高鰱魚肝臟組織中AKP的活性，對(duì)鰱魚有顯著的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中，5 mg/L試驗(yàn)組與對(duì)照組均無差異，證明在該濃度下不會(huì)對(duì)魚苗肝臟的AKP活性造成影響。9 mg/L試驗(yàn)組在6 h、12 h與對(duì)照組無顯著差異，但在24 h顯著高于對(duì)照組，使用丁香酚麻醉時(shí)魚體血漿、肌肉和肝臟中的丁香酚濃度以肝臟中的含量最高，肝臟作為藥物代謝的主要器官，與藥物的吸收、轉(zhuǎn)化、代謝和排泄密切相關(guān)。試驗(yàn)中，12 h內(nèi)丁香酚通過魚的鰓、口腔黏膜和皮膚吸收，然后進(jìn)入血液循環(huán)，分布在肌肉和肝臟中，此時(shí)肝臟的AKP活性高于對(duì)照組但不顯著；體內(nèi)的丁香酚最后主要還是通過肝臟代謝，影響魚體內(nèi)的生理代謝，導(dǎo)致24 h后AKP活性的增加。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，Alanine aminotransferase）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，Aspartate aminotransferase）主要存在于肝臟中，是兩種重要的肝功能指標(biāo)，可以反映肝臟的整體代謝和解毒功能，當(dāng)肝細(xì)胞因發(fā)炎、化學(xué)藥物而受損或壞死時(shí)濃度會(huì)上升，相反，如果肝細(xì)胞大量壞死，肝臟的功能受到了影響，ALT和AST的釋放量可能會(huì)減少，導(dǎo)致其水平降低。30 mg/L濃度的丁香酚麻醉10 min后，虹鱒魚的血漿生化指標(biāo)中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性在麻醉后和24 h后都顯著降低，也有試驗(yàn)表明，丁香酚可以顯著降低小鼠肝臟AST和ALT水平；但丁香酚在大口黑鱸幼魚和斑點(diǎn)叉尾鮰麻醉過程中血清中AST和ALT水平顯著升高。丁香酚作為魚類麻醉劑，其濃度、水溫、魚體規(guī)格以及運(yùn)輸方式、密度會(huì)影響魚類的代謝率和生理指標(biāo)。本試驗(yàn)中，9 mg/L試驗(yàn)組ALT、AST及5 mg/L試驗(yàn)組ALT在6 h均顯著低于對(duì)照組，但在12 h、24 h與對(duì)照無顯著差異，6 h顯著低于對(duì)照組可能是丁香酚前期會(huì)影響ALT和AST的合成或代謝，導(dǎo)致這些酶的合成能力下降，從而使其水平顯著偏低，隨著時(shí)間增長，魚體對(duì)丁香酚產(chǎn)生了一定的耐受力，因此12 h、24 h時(shí)體內(nèi)ALT、AST活性均能恢復(fù)至正常水平，說明肝臟沒有受到損傷。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)表明，丁香酚質(zhì)量濃度為5～10 mg/L時(shí)，細(xì)點(diǎn)石斑魚均能在3 min內(nèi)進(jìn)入深度鎮(zhèn)靜期到輕度麻醉期之間，并在4 min內(nèi)恢復(fù)到正常狀態(tài)。5 mg/L組麻醉與復(fù)蘇過程細(xì)點(diǎn)石斑魚幼魚肝臟生化指標(biāo)與對(duì)照組沒有顯著差異，9 mg/L麻醉6 h細(xì)點(diǎn)石斑魚幼魚肝臟SOD、CAT、ALT和AST顯著低于對(duì)照組，經(jīng)12 h清水復(fù)蘇后幼魚體內(nèi)生化酶活性恢復(fù)至正常，證明其影響是可逆的；12 h的麻醉運(yùn)輸可選用質(zhì)量濃度為5 mg/L丁香酚。

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HUANG Qiongye，ZHANG Jianming，ZHU Youfang，XU Qiulong

（Putian Municipal Institute of Fishery Science，Putian 351100，China）

Abstract：In order to improve the survival rate of Epinephelus cyanopodus in transport，seedling grading and marking in enhancement release，and determine the concentration of eugenol in anesthesia transport， the anesthetic effects of different mass concentrations of eugenol were determined on E. cyanopodus with body weight of （27.84±6.91） g. The effects of mass concentrations of eugenol at 5 mg/L and 9 mg/L on the physiological and biochemical indexes of liver were also determined. The results showed thc2f07eb07d089d58d98984168778111c83ec0eba02c5cddbdce77342c9d99789at under the temperature of （29.5±0.3） ℃，when the concentration of eugenol was 5 mg/L and 10 mg/L，the final anesthetic state of the fish was deep sedation and mild anesthesia，respectively，and the normal state was recovered within 4 minutes. In the anesthesia and resuscitation tests，there was no significant difference in liver biochemical indexes between the 5 mg/L group and the control group，while SOD，CAT，ALT and AST in liver of the fish of the 9 mg/L group were significantly lower than those of the control group at 6 h after anesthesia，and the enzyme activities returned to normal after 12 h of resuscitation in clear water，which proved that the effects were reversible. Therefore，eugenol with a mass concentration of 5 mg/L is optional for 12 h anesthetic transport.

Key words：Epinephelus cyanopodus; eugenol; anesthetic; biochemical indexes

（收稿日期：2024-08-29）