健康與患根腐病三七根際和根內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性研究

摘要 ［目的］研究三七健康植株和根腐病植株根內(nèi)及根際土的微生物群落結(jié)構(gòu)，探究其與三七根腐病發(fā)生的相關(guān)性。［方法］利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)云南文山連作3年的健康植株根內(nèi)及其根際土壤、根腐病植株根內(nèi)及其根際土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析。［結(jié)果］健康植株及其根際土壤與根腐病植株及其根際土壤中微生物群落的豐富度存在顯著差異。黃腐植株根際土中的優(yōu)勢(shì)微生物為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、毛殼菌屬（Chaetomium）和周刺座霉屬（Volutella），綠腐植株根際土中的優(yōu)勢(shì)微生物為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）。黃腐植株根內(nèi)優(yōu)勢(shì)微生物為被孢霉屬（Mortierella）和木霉屬（Trichoderma），綠腐植株根內(nèi)優(yōu)勢(shì)微生物為假單胞菌屬（Pseudomonas）、土赤殼菌屬（Ilyonectria）和小不整球殼屬（Plectosphaerella）。［結(jié)論］三七根腐病的發(fā)生與植株根際及根內(nèi)微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞 三七；根腐?。桓H微生物；高通量測(cè)序；群落結(jié)構(gòu)；微生物多樣性

中圖分類號(hào) X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）19-0151-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.033

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Microbial Community Structure and Diversity in Rhizosphere and Roots of Healthy and Root Rot Panax notoginseng

DING Zi-yuan^1，2， ZHAO Xue-qiang³， LI Ning⁴ et al

（1. Nutrition & Health Research Institute， COFCO Corporation， Beijing 102209; 2. Beijing Key Laboratory of Nutrition， Health and Food Safety， Beijing 102209; 3. North China Pharmaceutical Group Aino Co.， Ltd.， Shijiazhuang，Hebei 052165; 4. New Drug Research & Development Company of NCPC， Shijiazhuang，Hebei 050000）

Abstract ［Objective］To study the microbial community structure in the root and rhizosphere soil of healthy and root rot infected plants of Panax notoginseng， and explore the correlation between microbial diversity with root rot of P. notoginseng.［Method］The microbial community composition and diversity of the roots and rhizosphere soil of healthy and root rot plants in Wenshan， Yunnan Province， which had been continuously cultivated for 3 years were analyzed by using Illumina high-throughput sequencing system.［Result］The richness of microbial communities in healthy plants roots and rhizosphere soil was significantly different from that in root rot plants roots and rhizosphere soil. The dominant microorganisms in the rhizosphere soil of yellow rot plants were Arthrobacter， Chaetomium and Volutella， and that of the rhizosphere soil of green rot plant were Arthrobacter and Trichocladium. The dominant microorganisms in roots of yellow rot plants were Mortierella and Trichoderma， while the dominant microorganisms in roots of green rot plants were Pseudomonas， Ilyoectria and Plectosphaerella.［Conclusion］The occurrence of root rot in Panax notoginseng is closely related to the diversity and community structure of microorganisms in the rhizosphere and roots of plants.

Key words Panax notoginseng;Root rot;Rhizosphere microbe;High-throughput sequencing;Community structure;Microbial diversity

基金項(xiàng)目 河北省重大科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（20282901Z）。

作者簡(jiǎn)介 丁子元（1984—），男，安徽安慶人，高級(jí)工程師，博士，從事環(huán)境微生物研究。

*通信作者，高級(jí)工程師，碩士，從事環(huán)境微生物研究。

收稿日期 2023-08-02

三七又名田七、金不換，屬于五加科人參屬多年生草本植物，是我國(guó)名貴的藥食同源中藥材，兼具營(yíng)養(yǎng)和藥用雙重價(jià)值，具有良好的抗凝血、抗血栓、緩解疼痛等作用，對(duì)預(yù)防和治療心腦血管疾病具有顯著療效^［1］，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。因?yàn)槿哌m宜冬暖夏涼的氣候，且喜潮濕和半陰的生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致其分布范圍很小，僅局限于23.5°N附近的中高海拔區(qū)域，道地產(chǎn)地為云南省文山市及周邊地區(qū)。云南文山種植三七的歷史悠久，三七種植產(chǎn)業(yè)得到了政府的大力支持，其三七種植產(chǎn)量達(dá)到全國(guó)總產(chǎn)量的98%以上。三七的需求量日益增長(zhǎng)，由于其種植范圍非常狹窄，促進(jìn)了我國(guó)的三七種植逐漸向集約化、規(guī)?；N植發(fā)展。由于連年進(jìn)行大面積的單一化種植，且三七喜陰、生長(zhǎng)環(huán)境溫暖濕潤(rùn)，易被圓斑病、根腐病等侵染，導(dǎo)致三七連作障礙問題日益嚴(yán)重^［2］。

根腐病是對(duì)三七危害最嚴(yán)重的病害之一，占三七各種病害的70%以上，可以導(dǎo)致三七產(chǎn)量降低5%～70%甚至絕收，且種植土壤往往需要間隔10年以上才能再次種植^［3］，該病害已嚴(yán)重阻礙了三七產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)產(chǎn)，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。三七根腐病分為黃腐型、急性青枯型、干裂型、髓爛型、莖基干枯型、濕腐型等，最常見的為黃腐型和急性青枯型^［4］。黃腐型表現(xiàn)為地上部分植株矮小，葉片逐漸變黃，根部逐漸干腐，發(fā)病持續(xù)時(shí)間為60～120 d。急性青枯型又稱綠腐型，常見于2～3年生三七，發(fā)病時(shí)地上植株葉片綠色下垂，根部常有滲出的滴狀膿液，一般從地上部分出現(xiàn)表征到死亡僅7 d左右。

三七根腐病是典型的土傳性病害，長(zhǎng)時(shí)間高密度單一化的種植使得土壤微生物多樣性降低、病原菌積累，從而導(dǎo)致根腐病的發(fā)生^［5］。相關(guān)報(bào)道表明，病原真菌、病原細(xì)菌及病原動(dòng)物均能導(dǎo)致三七根腐病的發(fā)生。羅文富等^［6］報(bào)道假單胞細(xì)菌（Pseudomonas）、茄病鐮孢菌（Fusarium solani）、細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuis）和小桿線蟲（Rhabditis elegans）是導(dǎo)致三七根腐病的致病原?？娮髑宓?sup>［7^］研究表明引起三七根腐病的真菌種類主要包括毀壞柱孢霉（Cylindrocarpon destructans）、茄腐皮鐮孢菌（F.solani）、尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、三七黃腐病菌（Cylindrocarpon didynum）、草莖點(diǎn)霉（Phoma herbarum）、惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等。文增葉等^［8］從三七根腐病幼苗中分離得到一株尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum），將病原菌回接后發(fā)現(xiàn)其有很強(qiáng)的致病性。張晉豪等^［9］從患病三七中分離并鑒定吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indoloqenes）為根腐病病原細(xì)菌，為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道可引起三七根腐病。以上研究中，病原真菌的種類比較多，主要包括鏈格孢菌屬（Alternaria）、柱孢菌屬（Cylindrocarpon）、鐮刀菌屬（Fusarium）、疫霉菌（Phytophthora）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）等，病原細(xì)菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas）和吲哚金黃桿菌。

高通量測(cè)序技術(shù)也稱為深度測(cè)序或“下一代測(cè)序技術(shù)”，具有測(cè)序通量高、能定量和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)^［10］，相較于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，通過擴(kuò)增和測(cè)序能夠同時(shí)檢測(cè)可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物，能夠更深入挖掘樣品中微生物的種類，目前被廣泛應(yīng)用于食品^［11-12］、環(huán)境^［13-14］等的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析。

近年來(lái)，科研人員對(duì)三七根腐病的研究主要集中在根腐病病原菌分離^［6-9］、根腐病生物防治^［15-16］、根腐病與三七種植過程中的營(yíng)養(yǎng)因子或抗菌劑等相關(guān)性方面的研究^［17-18］，而針對(duì)三七根際土壤及內(nèi)生微生物菌群變化及其與三七根腐病害發(fā)生的相關(guān)性研究報(bào)道較少。該研究通過Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)根腐病植株（包括黃腐型和綠腐型）及健康植株根內(nèi)生和根際土壤中微生物進(jìn)行測(cè)序分析，比較不同樣品的多樣性與對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢(shì)微生物種群，并進(jìn)一步探討導(dǎo)致三七根腐病的病原菌種類，對(duì)通過微生態(tài)制劑進(jìn)行土壤恢復(fù)和消除連作障礙具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。

三七根際土與植株樣品采集自云南文山科技示范園（23°49′N、104°06′E，海拔1 631 m），樣品信息如表1所示。

1.1.2 試劑。真菌DNA提取試劑盒，AU3111，無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司；磁珠組織DNA提取試劑盒，AU20011，無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備。

SQ810C立式壓力蒸汽滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；生物安全柜，ESCO新加坡藝思高科技有限公司；ME104型萬(wàn)分之一電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；BioTeke全自動(dòng)核酸提取儀，無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司；BioDrop-μLite微量核酸蛋白分析儀，英國(guó)Biochrom有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集。

隨機(jī)選取10株健康三七植株、10株患黃腐病三七植株和10株患綠腐病三七植株，將植株輕輕拔起，并收集2～3 cm的根際土，混合均勻后分成3份，放入無(wú)菌自封袋，在12 h內(nèi)用冰盒保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取采集完根際土后的植株根部，利用無(wú)菌水進(jìn)行沖洗，將根部表面的土壤沖洗干凈，并用5%次氯酸鈉溶液消毒1 min，然后用75%乙醇溶液消毒1 min，再用無(wú)菌水沖洗3～5次，無(wú)菌條件下干燥后放入無(wú)菌自封袋，同樣于12 h內(nèi)用冰盒保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取。

將上述土壤樣品和植株樣品用液氮充分研磨，利用百泰克磁珠組織DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組總DNA的提取，使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA提取質(zhì)量的檢測(cè)，使用NanoDrop2000進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測(cè)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增。

使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì)ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循RihhHqjwaihJ0tSpMZo2Dg==環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 Illumina Miseq 測(cè)序。

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Quantus^TM Fluorometer（Promega，USA）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX^? Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Illumina Miseq測(cè)序得到雙端序列數(shù)據(jù)后，通過質(zhì)控得到有效序列，校正序列方向即為優(yōu)化后的數(shù)據(jù)，得到的數(shù)據(jù)使用UPARSE軟件在97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，細(xì)菌16S rRNA比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為Silva（Release132 http：//www.arbsilva.de），真菌數(shù)據(jù)庫(kù)為Unite（Release 7.2 http：//unite.ut.ee/index.php），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。采用美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七根際微生物高通量測(cè)序結(jié)果分析

Illumina Miseq高通量測(cè)序采用真菌引物ITS1F、ITS2R檢測(cè)后共得到1 108 939條有效序列，在97%相似水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析共得到2 263個(gè)OTU。采用細(xì)菌引物338F、806R檢測(cè)后共得到900 309條有效序列，在97%相似水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析共得到6 340個(gè)OTU。采用稀釋曲線進(jìn)行樣本間物種豐度和數(shù)據(jù)合理性檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可見，各樣本的Shannon指數(shù)的稀釋曲線平緩，即測(cè)序深度能夠覆蓋樣品中的絕大多數(shù)物種，測(cè)序數(shù)量足以反映樣本中的物種多樣性。

2.2 三七根際微生物群落的α多樣性分析

在97%序列相似度水平下進(jìn)行OTU聚類分析，分析植株組（HFZZ、LFZZ、JKZZ）和根際土組（HFGJT、LFGJT、JKGJT）的α多樣性，并對(duì)各組的微生物多樣性指數(shù)包括Shannon、Simpson、ACE、Chao指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，Shannon和Simpson指數(shù)能夠反映樣品中的微生物物種多樣性，指數(shù)越高說明群落多樣性越豐富；Chao是用Chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，ACE用來(lái)估算群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，這2個(gè)指數(shù)能夠反映樣品中的物種豐度，數(shù)值越大豐度越高。從表2、3可以看出，真菌群落多樣性較高的組為JKZZ、HFZZ、JKGJT和LFGJT（Shannon指數(shù)較高），而LFZZ和HFGJT的真菌群落多樣性顯著低于前者（P<0.05）；細(xì)菌群落多樣性較高的組為HFZZ、JKZZ和JKGJT，而LFZZ、HFGJT、LFGJT的細(xì)菌群落多樣性顯著低于前者（P<0.05）。真菌物種總數(shù)較高的組為JKZZ和JKGJT（Chao指數(shù)較高），物種總數(shù)較低的組為L(zhǎng)FZZ，兩者之間差異顯著（P<0.05）；細(xì)菌物種總數(shù)較高的組為HFZZ和JKGJT，LFZZ組的細(xì)菌物種總數(shù)顯著低于前者（P<0.05）。

整體而言，JKZZ和JKGJT的微生物多樣性和物種總數(shù)高于患病植株組或者根腐病植株根際土組，研究表明土壤中較高的微生物多樣性可能使病原菌難以成為優(yōu)勢(shì)菌群，從而有利于防控三七根腐病的發(fā)生^［19］。致病微生物一旦繁殖，會(huì)造成物種多樣性和物種總數(shù)降低，微生態(tài)平衡遭到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致根腐病的發(fā)生。

2.3 三七根際微生物群落的β多樣性分析

真菌的PCoA分析結(jié)果（圖2A）表明，主成分PC1和主成分PC2共解釋了63.23%的微生物結(jié)構(gòu)差異，貢獻(xiàn)率分別是42.68%和20.55%；JKZZ和JKGJT這2個(gè)組的聚合度較高，說明這2個(gè)組的真菌群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，LFZZ、HFGJT和LFGJT這3個(gè)組在坐標(biāo)軸上有一定距離但是又彼此交叉，說明它們的真菌群落結(jié)構(gòu)既有相似又有差異，但是HFZZ組與其他各組有顯著的分離趨勢(shì)，表明該組的真菌群落結(jié)構(gòu)與其他組間有明顯的差異。進(jìn)一步采用非參數(shù)檢驗(yàn)法ANOSIM分析，R=0.67，P<0.05，表明樣品的真菌組間差異大于組內(nèi)差異，并且差異顯著。細(xì)菌的PCoA分析結(jié)果（圖2B）表明，主成分PC1和主成分PC2共解釋了49.24%的微生物結(jié)構(gòu)差異，貢獻(xiàn)率分別是33.78%和15.46%；JKZZ、JKGJT以及HFGJT、LFGJT組間的聚合度較高，說明它們的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，LFZZ和HFZZ兩組與其他各組有顯著的分離趨勢(shì)，表明該組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他組間有明顯的差異。進(jìn)一步采用非參數(shù)檢驗(yàn)法ANOSIM分析，R=0.92，P<0.05，表明樣品的細(xì)菌組間差異大于組內(nèi)差異，并且差異顯著。

綜上所述，JKZZ和JKGJT組的微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似，HFZZ組的微生物群落結(jié)構(gòu)與其他組間存在顯著差異，其他組間的微生物群落之間既相似又存在一定的差異。

2.4 三七根際微生物分類學(xué)組成分析

通過在97%序列相似度水平下對(duì)樣品進(jìn)行OTU聚類分析和對(duì)各組樣品進(jìn)行鑒定，共得到真菌14個(gè)門、53個(gè)綱、126個(gè)目、276個(gè)科、580個(gè)屬、976個(gè)種和2 263個(gè)OTU，細(xì)菌43個(gè)門、140個(gè)綱、340個(gè)目、547個(gè)科、1 057個(gè)屬和2 217個(gè)種。

微生物分類學(xué)組成的結(jié)果（表4）表明，HFZZ、LFZZ與JKZZ相比，其真菌數(shù)量降低，表現(xiàn)在門、綱、目、科、屬水平上均低于JKZZ，與之類似，HFGJT、LFGJT在門、綱、目、科、屬水平上也均低于JKGJT的真菌數(shù)量。相比之下，細(xì)菌數(shù)量的變化有所不同，表現(xiàn)為HFZZ的細(xì)菌數(shù)量在門、綱、目、科、屬水平上均高于JKZZ，LFZZ的細(xì)菌數(shù)量相比JKZZ有明顯的降低，HFGJT、LFGJT的細(xì)菌數(shù)量與JKGJT相比無(wú)明顯差異。

根據(jù)上述結(jié)果，推測(cè)根腐病的發(fā)生主要導(dǎo)致植株根際土以及植株內(nèi)生真菌數(shù)量的降低，但是對(duì)細(xì)菌數(shù)量的影響較為不同，對(duì)根際土的細(xì)菌數(shù)量影響不大，但是綠腐植株（LFZZ）內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量明顯降低。

2.5 三七根際微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)分析

從三七土壤樣品中的真菌微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)（圖3A）可以看出，JKZZ中的優(yōu)勢(shì)真菌種類為被孢霉屬（Mortierella）、鐮刀菌屬（Fusarium）、unclassified_f_Didymellaceae、青霉屬（Penicillium）和小不整球殼屬（Plectosphaerella），其相對(duì)豐度為3.80%～11.11%；JKGJT中的優(yōu)勢(shì)真菌種類為青霉屬（Penicillium）、被孢霉屬（Mortierella）、鐮孢菌屬（Fusarium）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）和曲霉屬（Aspergillus），其相對(duì)豐度為2.98%～16.23%；HFZZ中的優(yōu)勢(shì)真菌種類為被孢霉屬（Mortierella）、木霉屬（Trichoderma）、unclassified_k_Fungi、unclassified_p_Rozellomycota和毛殼菌屬（Chaetomium），其相對(duì)豐度為4.21%～27.43%；LFZZ中的優(yōu)勢(shì)真菌種類為土赤殼屬（Ilyonectria）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）、毛殼菌屬（Chaetomium）和盤菌屬（Tricharina），其相對(duì)豐度為5.65%～40.74%；HFGJT中的優(yōu)勢(shì)真菌種類為毛殼菌屬（Chaetomium）、周刺座霉屬（Volutella）、unclassified_k_Fungi、木霉屬（Trichoderma）和短梗蠕孢屬（Trichocladium），其相對(duì)豐度為8.19%～21.03%；LFGJT中的優(yōu)勢(shì)真菌種類為短梗蠕孢屬（Trichocladium）、unclassified_k_Fungi、木霉屬（Trichoderma）、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）、毛殼菌屬（Chaetomium）和土赤殼屬（Ilyonectria），其相對(duì)豐度為5.58%～26.24%。

整體而言，JKZZ和JKGJT屬水平的真菌群落結(jié)構(gòu)較為

相似，多樣性豐富且較均勻，而根腐病植株及其根際土組則正好相反，且健康植株及其根際土中相對(duì)豐度較少的物種在根腐病植株及其根際土中的相對(duì)豐度反而較高。LFZZ的真菌群落相對(duì)豐度與JKZZ相比明顯降低，而且土赤殼屬（Ilyonectria）成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度高達(dá)40%以上，小不整球殼屬（Plectosphaerella）的相對(duì)豐度約增加了11%。HFZZ中被孢霉屬（Mortierella）的相對(duì)豐度比JKZZ中增加了約16%，成為其中的優(yōu)勢(shì)真菌，而鐮孢菌屬（Fusarium）幾乎消失。HFGJT、LFGJT與JKGJT中的優(yōu)勢(shì)真菌種類完全不同，可見患病植株根際土中的真菌群落結(jié)構(gòu)同樣發(fā)生了較大的變化。HFZZ和HFGJT共有的優(yōu)勢(shì)真菌為木霉屬（Trichoderma）和unclassified_k_Fungi，LFZZ和LFGJT共有的優(yōu)勢(shì)真菌

為土赤殼屬（Ilyonectria）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）、毛殼菌屬（Chaetomium），推測(cè)植株根際土中的真菌侵染導(dǎo)致植株根腐病的發(fā)生。

從三七土壤樣品中的細(xì)菌微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)（圖3B）可以看出，JKZZ中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為norank_f_norank_o_Gaiellales、norank_f_norank_o_norank_c_AD3、康奈斯氏桿菌屬（Conexibacter）、norank_f_norank_o_norank_c_TK10和鞘氨醇單孢菌屬（Sphingomonas），其相對(duì)豐度為3.10%～8.93%；JKGJT中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為norank_f_norank_o_Gaiellales、norank_f_norank_o_norank_c_TK10、鞘氨醇單孢菌屬（Sphingomonas）、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和norank_f_Gemmatimonadaceae，其相對(duì)豐度為2.65%～8.64%；HFZZ中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為norank_f_norank_o_Vicinamibacterales、norank_f_Vicinamibacteraceae、小單胞菌屬（Micromonospora）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和鞘氨醇單孢菌屬（Sphingomonas），其相對(duì)豐度為3.52%～4.69%；LFZZ中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhozobium-Rhizobium、假單胞菌屬（Pseudomonas）、norank_f_norank_o_Chloroplast、芽孢桿菌屬（Bacillus）和類八疊球菌屬（Paenisporosarcina），其相對(duì)豐度為2.93%～25.33%；HFGJT中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、類八疊球菌屬（Paenisporosarcina）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）和微桿菌屬（Microbacterium），其相對(duì)豐度為2.02%～39.78%；LFGJT中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、紅球菌屬（Rhodococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）和類八疊球菌屬（Paenisporosarcina），其相對(duì)豐度為2.52%～43.45%。

通過上述分析可知，JKZZ和JKGJT的細(xì)菌群落多樣性明顯高于根腐病植株及其根際土，而且各物種的相對(duì)豐度較均衡，與根腐病植株及其根際土中的優(yōu)勢(shì)菌種類也明顯不同。HFZZ與JKZZ相比優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類較為相似，且優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度并無(wú)明顯變化，LFZZ中根瘤菌屬（Rhizobium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）顯著富集。HFGJT與JKGJT的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類完全不同，其中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）相比JKGJT約增加了37%，為其中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，另外類八疊球菌屬（Paenisporosarcina）和芽孢桿菌屬（Bacillus）均有不同程度的增加。與HFGJT類似，LFGJT中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的相對(duì)豐度高達(dá)43.45%，也是其中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，其他優(yōu)勢(shì)菌包括紅球菌屬（Rhodococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）等。HFZZ和HFGJT、LFZZ和LFGJT中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類并不一致，推測(cè)根際土中細(xì)菌群落的改變不是導(dǎo)致植株患根腐病的直接因素。

3 討論與結(jié)論

植物根際和內(nèi)生微生物群落具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物免疫力和改善植物新陳代謝等重要作用，深入研究植物根際和共生微生物群落組成和功能具有重要意義，目前關(guān)于不同植物根際和內(nèi)生微生物群落組成、功能的認(rèn)識(shí)還十分有限。根際土是指靠近植物根部周圍的土壤，其中的微生物與植物及土壤構(gòu)成了有機(jī)的生態(tài)系統(tǒng)。研究表明，植物的根際微生物群落結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性和代表性，根際土和根內(nèi)生微生態(tài)系統(tǒng)的平衡對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用，微生態(tài)系統(tǒng)若失衡能夠?qū)е聡?yán)重的連作障礙^［20］。為解析三七根際土壤微生物與根腐病發(fā)生的相關(guān)性，該研究通過Illumina高通量測(cè)序研究根際土及植株根內(nèi)微生物多樣性，通過比較分析其中優(yōu)勢(shì)真菌和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的變化，探索導(dǎo)致根腐病發(fā)生的微生物種類，為防治三七根腐病和克服連作障礙提供理論依據(jù)。

健康植株和健康根際土中優(yōu)勢(shì)真菌種類包括被孢霉屬（Mortierella）、鐮孢菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）和曲霉屬（Aspergillus），相對(duì)豐度在2.98%～16.23%。喬新國(guó)^［21］研究發(fā)現(xiàn)健康三七根部的真菌隸屬125個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)種群為被孢霉屬（Mortierella）、鐮孢菌屬（Fusarium），分別占21.05%、3.90%。唐彬彬等^［22］對(duì)不同種植年限健康三七根際土的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)被孢霉屬（Mortierella）的相對(duì)豐度隨種植年限的增加而降低。該研究與上述研究共有的優(yōu)勢(shì)真菌包括被孢霉屬（Mortierella）和鐮孢菌屬，其中被孢霉屬為有益真菌^［23-24］，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到促進(jìn)作用，而鐮孢菌屬則是常見的根腐病致病真菌^［25］，能夠?qū)е露喾N植物根腐病的發(fā)生，該研究根腐病三七根內(nèi)并沒有顯著富集鐮孢菌屬。

該研究發(fā)現(xiàn)HFZZ中相對(duì)豐度最高的真菌微生物為被孢霉屬（Mortierella）和木霉屬（Trichoderma），其中木霉屬同樣為HFGJT中的優(yōu)勢(shì)真菌種類，HFZZ中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類與JKZZ中類似，且與HFGJT中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類完全不同，推測(cè)導(dǎo)致三七植株患根腐病的原因可能是有害微生物的大量增殖占據(jù)了優(yōu)勢(shì)生態(tài)位，造成微生物區(qū)系的失衡，進(jìn)而導(dǎo)致黃腐病的發(fā)生。喬新國(guó)^［21］研究表明云南文山黃腐型三七植株根部真菌主要由土赤殼屬（Ilyonectria）組成，所占比例為24%，健康三七根部不存在。苗翠蘋^［26］利用免培養(yǎng)的方法分析根腐病三七植株的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，馬塘黃腐型根際土中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的是Monographella和土赤殼屬（Ilyonectria）。土赤殼屬能夠引起多種植物的銹腐病和根腐病^［27］，該研究中土赤殼屬相對(duì)豐度僅為0.42%，可見能夠引起根腐病的病原微生物的種類多樣且差異明顯。

綠腐植株樣品中相對(duì)豐度較高的真菌為土赤殼屬（Ilyonectria）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）、短梗蠕孢屬（Trichocladium），相對(duì)豐度較高的細(xì)菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）和根瘤菌屬（Rhizobium）。綠腐植株根際土壤樣品中相對(duì)豐度較高的真菌為短梗蠕孢屬（Trichocladium）、木霉屬（Trichoderma）、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus），相對(duì)豐度較高的細(xì)菌為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和紅球菌屬（Rhodococcus）。與該研究類似，苗翠蘋^［26］從急性青枯性根腐病三七病灶部位分離到一株小不整球殼屬（Plectosphaerella）的黃瓜萎蔫病菌（Plectosphaerella cucumerina），致病力檢測(cè)試驗(yàn)證明其能夠?qū)е氯吒?，其他研究也表明Plectosphaerella與植物病害密切相關(guān)，且廣泛分布在水生及陸生生境中^［28］。除土赤殼屬（Ilyonectria）是常見的植物根腐病致病菌外，假單胞菌屬也被證實(shí)能夠?qū)е氯呋紘?yán)重的綠腐病^［7］。此外，崔尹贍^［29］研究表明患病植株中芽孢桿菌屬（Bacillus）和埃希氏菌屬（Escherichia）的相對(duì)豐度低于健康植株，而假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對(duì)豐度表現(xiàn)為患病植株高于健康植株。綜上，推測(cè)是土赤殼屬（Ilyonectria）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的共同侵染導(dǎo)致植株患綠腐病。值得注意的是，節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）在根腐植株根際土中顯著富集，推測(cè)其可能是土壤惡化的標(biāo)志細(xì)菌。

不同地區(qū)土壤的溫度、濕度、pH、氮素水平和施氮形態(tài)等環(huán)境因素塑造了不同的三七根際微生物群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致三七患根腐病的微生物種類存在明顯差異。楊建忠等^［30］研究表明氣候因素包括土壤溫濕度雖然不是引起三七根腐病的直接因素，但其與三七根腐病發(fā)病率存在顯著相關(guān)性，說明氣候因素通過影響土壤微生物種群變化，進(jìn)一步影響三七根腐病的發(fā)病率。因此，三七根腐病是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的多種因素共同作用下的結(jié)果，根腐病的防治也應(yīng)該充分考慮環(huán)境因素的改善。

該研究初步揭示了導(dǎo)致文山地區(qū)三七患根腐病的微生物種類，包括土赤殼屬（Ilyonectria）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）和假單胞菌屬（Pseudomonas），后續(xù)將分離致病微生物和篩選生防菌株，通過微生態(tài)制劑對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，有效緩解三七的連作障礙。

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