黑漆實蠅線粒體基因組基因結(jié)構(gòu)分析

摘要 為探究黑漆實蠅線粒體基因組基因結(jié)構(gòu)，基于測定的黑漆實蠅的線粒體全基因組，采用DNAMAN V6 軟件測算線粒體全基因組13個蛋白編碼基因（PCGs），22個trnA基因AT skew =（A-T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）的值，分析黑漆實蠅核苷酸的偏移率；使用Win32 CodonW軟件分析蛋白質(zhì)基因密碼子的使用個數(shù)以及同義相對密碼子RSCU值的使用頻率；利用MITOS WebServer和tRNAscan-SE 2.0軟件對trnA的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為物種診斷、系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化生物學(xué)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黑漆實蠅；線粒體全基因組；相對密碼子使用頻率；trnA基因二級結(jié)構(gòu)

中圖分類號 S433 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）19-0077-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Mitochondrial Gene Structure Analysis of Bactrocera （Zeugodacus） scutellaris

HUANG Zhen¹，GUO Qiong-xia²

（1.Changle Airport Customs of Fuzhou，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350209;2.Fuzhou Customs Technology Center，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350001）

Abstract In order to explore the mitochondrial genome gene structure of Bactrocera（Zeugodacus）scutellaris，based on the measured mitochondrial whole genome of B.（Z.）scutellaris，the values of ATskew =（A-T）/（A+T）and GC skew =（G-C）/（G + C）of 13 protein-coding genes（PCGs）and 22 trnA genes in the whole mitochondrial genome were measured by DNAMAN V6 software.Win32 CodonW software was used to analyze the number of protein gene codons and the frequency of synonymous relative codon RSCU values.MITOS WebServer and trnAscan-SE 2.0 software were used to analyze the secondary structure of trnA，providing evidence for species diagnosis，phylogeny and evolutionary biology.

Key words Bactrocera （Zeugodacus） scutellaris;Mitochondrial whole genome;Relative codon usage frequency;Secondary structure of trnA gene

基金項目 福建省自然科學(xué)基金項目（2011J01066，2012JO1061）;福州海關(guān)科研項目（FK2022-09）。

作者簡介 黃振（1985—），男，福建莆田人，高級農(nóng)藝師，從事植物檢疫研究。*通信作者，研究員，從事植物檢疫研究。

收稿日期 2023-10-25

黑漆實蠅［Bactrocera（Z.）scutellaris Bezzi］屬雙翅目（Diptera）實蠅科（Tephritidae）果實蠅屬（Bactrocera）。果實蠅屬主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，主要危害果蔬，是危險性極高并可對果蔬生產(chǎn)與貿(mào)易造成巨大影響的有害生物之一，在果實蠅的自然分布或流行區(qū)，寄主作物果實被害率可達(dá) 10％～80％^［1］，是世界各個國家或地區(qū)農(nóng)業(yè)檢疫部門重點關(guān)注和阻截的危險性害蟲^［2］。近年來，果實蠅屬害蟲在口岸進(jìn)境果蔬物品檢疫中經(jīng)常被截獲，由于危害性大，形態(tài)相似，鑒定困難，是具有重要經(jīng)濟(jì)意義的危險性害蟲，因此果實蠅屬現(xiàn)已成為國際上許多國家的研究重點^［3-4］。線粒體基因組作大多數(shù)為環(huán)狀閉合雙鏈DNA，昆蟲線粒體基因組的組成包含從基本的分子序列到全部的基因組結(jié)構(gòu)，具有排列相對保守，基因結(jié)構(gòu)簡單，進(jìn)化速率快，高拷貝以及物種內(nèi)基因幾乎不發(fā)生重組的母系遺傳特點。線粒體具有自己的線粒體基因組^［5］，為完整的細(xì)胞器，基因組具有比核基因組更高的突變率，具有強(qiáng)大的遺傳功能^［6］。隨著DNA測序技術(shù)的快速發(fā)展，線粒體基因組成為研究動物起源進(jìn)化及群體遺傳分化的理想對象及一種重要的分子標(biāo)記技術(shù)手段^［7］，被用于不同分類水平的物種鑒定、生物遺傳進(jìn)化、分子標(biāo)記和系統(tǒng)發(fā)育研究，也是區(qū)別形態(tài)相似的近緣種的有用工具，目前被廣泛用于物種，尤其是同屬近緣種的分類鑒定、種間的分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系等研究^［8-9］。越來越多昆蟲種類的線粒體全基因組被測序^［10］。筆者基于線粒體全基因組測序技術(shù)，對具有重要經(jīng)濟(jì)意義的重要種類B.（Z.）scutellaris的線粒體全基因組進(jìn)行了測定與基因基本結(jié)構(gòu)、核苷酸含量、蛋白質(zhì)密碼子的使用頻率及trnA基因的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析^［11-13］，以期為黑漆實蠅的物種鑒定、生物遺傳進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育和分子鑒定提供更有價值的信息和依據(jù)。

1 樣品與方法

1.1 供試的樣品

供試樣品為B.（Z.）scutellaris的線粒體序列，來自云南口岸，成蟲采用形態(tài)分類的方法進(jìn)行鑒定，樣品放置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 偏移率的測算。

利用已測定的黑漆實蠅全基因組序列，基于DNAMAN V6測算AT skew=（A- T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）的值，分析黑漆實蠅全基因組、蛋白質(zhì)、trnA基因核苷酸及其J和N編碼鏈核苷酸AT skew、GCskew的偏移。

1.2.2 蛋白質(zhì)密碼子的使用頻率。

使用Win32 CodonW對黑漆實蠅全基因組序列的13個蛋白質(zhì)基因密碼子的使用個數(shù)以及同義相對密碼子RSCU值的使用頻率進(jìn)行分析。

1.2.3 trnA的二級結(jié)構(gòu)。

采用MITOS WebServer和tRNAscan-SE 2.0對黑漆實蠅全基因組序列的22個trnA基因的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組序列核苷酸的偏移率

黑漆實蠅線粒體基因組總序列為15 919 bp（GenBank登錄號為：MW 892725），核苷酸A、C、G、T的含量分別為39.1%、16.2%、9.9%、34.3%，表現(xiàn)為A>T>C>G，線粒體基因組序列核苷酸A+T含量為73.4%，其中蛋白質(zhì)編碼基因PCGs、trnA基因、rRNA基因、非編碼控制區(qū)A+T的含量分別為71.8%、74.4%、78.0%和78.4%，存在A、T堿基偏向性^［14］。通過對黑漆實蠅全基因組核苷酸偏移率：AT skew =（A-T）/（A+T）、GC skew=（G-C）/（G+C）測算，黑漆實蠅線粒體基因組全序列的AT skew偏斜為正值（0.065），GC skew偏斜為負(fù)值（-0.241），表明基因組序列中A堿基和C堿基的百分比含量分別高于T堿基和G堿基，這種現(xiàn)象與大部分昆蟲的線粒體基因組 AT／GC偏斜一致^［15］；PCGs的 AT偏移率 J鏈為 -0.066，高于N鏈-0.277；GC Skew N鏈為0.344，高于J鏈 -0.195；trnA基因AT Skew J 鏈為 0.008，高于N鏈 -0.045，GC Skew N鏈為0.306，高于J鏈-0.008。因此，PCGs和trnA基因均存在AT向J鏈偏移，GC向N鏈偏移，與J鏈和N鏈堿基組成偏向性結(jié)果一致，這2條鏈之間存在核苷酸組成與AT偏斜、GC 偏斜，符合大多數(shù)昆蟲線粒體基因組基本的堿基規(guī)律。核苷酸組成不對稱性的現(xiàn)象表現(xiàn)了后生動物線粒體全基因組的顯著特征^［16］。黑漆實蠅線粒體全基因組核苷酸組成見表1。

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因

黑漆實蠅線粒體全基因組13個蛋白質(zhì)編碼基因序列總長11 301 bp，A+T總含量為71.8%，J編碼鏈為6 897 bp，N編碼鏈核苷酸為4 404 bp；13個蛋白質(zhì)編碼基因包含 3 754個密碼子，J鏈含有2 290個，N鏈含有1 464個，使用頻率最高的密碼子為：第 2位點為 U和第 3位點為U或A；相對同義密碼子RSCU值的使用頻率大于1的有28個，其中第 3位點均為U或 A；在所有22種氨基酸的密碼子中，UUA（L）的使用頻率 N及相對密碼子RSCU使用頻率均最高，分別為368和3.68，其次為AUU（I），N、RSCU分別為278、1.66，UUU（F），N、RSCU分別為239、1.44；密碼子組成前 4位的氨基酸占總量的39.00%，4種氨基酸含量分別為：亮氨酸（Leu）600個（15.98%）>異亮氨酸（Ile）335個（8.92%）>苯丙氨酸（Phe）333個（8.87%） >絲氨酸（Ser）226個（5.23%）；20種氨基酸中半胱氨酸（Cys）47個（2%），含量為最低。每種氨基酸使用頻繁的密碼子為NNA和NNU，反映核苷酸組成AT偏好性^［17］。黑漆實蠅線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因密碼子使用統(tǒng)計見表2。

2.3 trnA基因

黑漆實蠅線粒體全基因組共22個trnA基因，序列長度在63～72 bp，總長度1 471 bp，通過對黑漆實蠅線粒體全基因組trnA基因二級結(jié)構(gòu)分析，trnA基因二級結(jié)構(gòu)中，除精氨酸（R）和苯丙氨酸（F）缺少假尿嘧啶（T）環(huán)以及絲氨酸（S1）缺少二氫尿嘧啶（DHU）環(huán)外，其余 19個trnA基因均能折疊形成典型三葉草二級結(jié)構(gòu)圖。線粒體基因組 22個 trnA基因中，共存在20處堿基對錯配，錯配均為G-U，其中8處錯配分別位于trnA、trnC、trnE、trnF、trnP、trnS1的氨基酸接受臂，2處位于trnN、trnT的假尿嘧啶臂，10處位于trnD、trnQ、trnG、trnH、trnF、trnP、trnS1、trnY的二氫尿嘧啶臂^［18-19］。黑漆實蠅線粒體22個trnA的三葉草結(jié)構(gòu)見圖1。

3 小結(jié)與討論

黑漆實蠅線粒體全基因A+T含量為73.4%，PCGs 為71.8%，A、T堿基偏向性，AT偏斜為正值，GC偏斜多為負(fù)值。其中蛋白質(zhì)編碼基因PCGs、rRNA基因、trnA基因、非編碼控制區(qū)A+T的含量分別為71.8%、74.4%、78.0%和78.4%，黑漆實蠅均存在堿基AT 含量明顯高于GC，存在AT的偏向性，符合大多數(shù)線粒體基因組基本的堿基規(guī)律，這一特征與后生動物典型的線粒體基因組AT偏移相一致；通過偏移率計算，黑漆實蠅的線粒體基因組AT 為0.065，為正值，GC為-0.241，這一特征和其他實蠅線粒體基因組的序列具有相似性^［20］。

黑漆實蠅線粒體全基因包含13個蛋白質(zhì)基因，其蛋白質(zhì)基因共包含3 754個密碼子，J鏈含有2 290個，N鏈含有1 464個，從密碼子使用的個數(shù)和相對同義密碼子的使用頻率統(tǒng)計分析，每種氨基酸對應(yīng)有1～6 種不同的同義密碼子。盡管密碼子具有簡并性，但每種氨基酸密碼子第3位點的堿基組成較高的為A和T，相對同義密碼子的使用頻率RSCU大于 1的密碼子，其第3位點也均為 A或 T。這種偏好與A+T 較高和偏移相適應(yīng)，其可能是由于線粒體基因組A+T含量相對較高所造成的偏移的突變壓所引起，即在核苷酸水平上GC至AT的正向突變大于回復(fù)突變^［21］。

黑漆實蠅線粒體全基因組22個trnA中，trnA基因二級結(jié)構(gòu)中，除精氨酸（R）和苯丙氨酸（F）缺少假尿嘧啶（T）環(huán)以及絲氨酸（S1）缺少二氫尿嘧啶DHU環(huán)外，其余 19個trnA基因均能折疊形成典型三葉草二級結(jié)構(gòu)圖。線粒體基因組 22個 trnA基因中，共存在20處堿基對錯配，錯配均為G-U，這表明 G-U配對在線粒體基因組中很可能是一種正常的配對形式^［22］。

參考文獻(xiàn)

［1］汪興鑒.重要果蔬類有害實蠅概論（雙翅目：實蠅科）［J］.植物檢疫，1995（1）：11.

［2］吳佳教，梁帆，梁廣勤.實蠅類重要害蟲鑒定圖冊［M］.廣州：廣東科技出版社，2009.

［3］黃振，郭瓊霞，陳韻萍.應(yīng)用SS-PCR技術(shù)設(shè)計種特異性引物快速鑒定瓜實蠅［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（6）：83-86，96.

［4］WANG X J，CHEN X L.A revision of the genus Dacus Fabricius from China（Diptera：Tephritidae）［J］.Acta zootaxonomica sinica，2002，27（3）：631-636.

［5］NASS S，NASS M M.Intramitochondrial fibers with DNA characteristics，Ⅲ.Enzymatic and other hydrolytic treatments［J］.J Cell Biol，1963，19（3）：613-629.

［6］薛清，杜虹銳，薛會英，等.苜蓿滑刃線蟲線粒體基因組及其系統(tǒng)發(fā)育研究［J］.生物技術(shù)通報，2021，37（7）：98-106.

［7］VIGILANT L，STONEKING M，HARPENDING H，et al.African populations and the evolution of human mitochondrial DNA［J］.Science，1991，253（5027）：1503-1507.

［8］KIM J S，PARK J S，KIM M J，et al.Complete nucleotide sequence and organization of the mitochondrial genome of eri-silkworm，Samia cynthia ricini（Lepidoptera：Saturniidae）［J］.J Asia Pac Entomol，2012，15（1）：162-173.

［9］黃振，侯有明，郭瓊霞，等.利用物種特異性 PCR 技術(shù)快速鑒定南瓜實蠅［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2021，36（2）：215-220.

［10］孫錚，張吉，王榮，等.昆蟲線粒體基因的研究進(jìn)展［J］.檢驗檢疫學(xué)刊，2010，20（3）：69-73.

［11］YONG H S，SONG S L，LIM P E，et al.Complete mitochondrial genome of Bactrocera arecae（Insecta：Tephritidae）by next-generation sequencing and molecular phylogeny of Dacini tribe［J］.Sci Rep，2015，5：1-9.

［12］YONG H S，LIM P E，TAN J，et al.Multigene phylogeography of Bactrocera caudata（Insecta：Tephritidae）：Distinct genetic Lineages in Northern and Southern Hemispheres［J］.PLoS One，2015，10（6）：1-13.

［13］YONG H S，SONG S L，EAMSOBHANA P，et al.Mitochondrial genome supports sibling species of Angiostrongylus costaricensis （Nematoda：Angiostrongylidae）［J］.PLoS One，2015，10（7）：1-14.

［14］KROSCH M N，SCHUTZE M K，ARMSTRONG K F，et al.A molecular phylogeny for the Tribe Dacini（Diptera：Tephritidae）：Systematic and biogeographic implications［J］.Mol Phylogenet Evol，2012，64（3）：513-523.

［15］李旭東，陳斌.騷擾阿蚊線粒體全基因組序列測定和分析［J］.昆蟲學(xué)報，2018，61（1）：114-121.

［16］PERNA N T，KOCHER T D.Patterns of nucleotide composition at fourfold egenerate sites of animal mitochondrial genomes［J］.J Mol Evol，1995，41（3）：353-358.

［17］林愛麗，李欣欣，趙新成，等.黑毛皮蠹線粒體基因組分析及皮蠹科系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.昆蟲學(xué)報，2018，61（4）：477-487.

［18］趙亞男，李朝品.甜果螨全線粒體基因組測序與分析［J］.昆蟲學(xué)報，2020，63（3）：354-364.

［19］ZHOU Z J，HUANG Y，SHI F M.The mitochondrial genome of Ruspolia dubia（Orthoptera：Conocephalidae）contains a short A+T-rich region of 70 bp in length［J］.Genome，2007，50（9）：855-866.

［20］CLARY D O，WOLSTENHOLME D R.The mitochondrial DNA molecular of Drosophila yakuba：Nucleotide sequence，gene organization，and genetic code［J］.J Mol Evol，1985，22（3）：252-271.

［21］鐘健，劉增虎，楊偉克，等.琥珀蠶線粒體全基因組測序及序列分析［J］.昆蟲學(xué)報，2017，60（8）：936-949.

［22］夏靖，胡靜，朱國萍，等.大衛(wèi)絹蛺蝶線粒體基因組全序列測定和分析勝［J］.昆蟲學(xué)報，2011，54（5）：555-565.