TLR4基因多態(tài)性與小兒反復(fù)呼吸道感染的關(guān)系

［摘要］目的探究Toll樣受體4（TLR4）基因多態(tài)性與小兒反復(fù)呼吸道感染（RRTI）的關(guān)系。

方法選擇107例RRTI病兒作為觀察組，另選103例體檢健康兒童作為對(duì)照組（近1年未出現(xiàn)RRTI），采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)分析兩組TLR4基因rs2737190位點(diǎn)多態(tài)性，比較不同病情嚴(yán)重程度病兒TLR4基因多態(tài)性的差異，并分析不同TLR4基因多態(tài)性病兒臨床特征的差異。

結(jié)果觀察組TLR4基因rs2737190位點(diǎn)AG基因型、G等位基因頻率均明顯高于對(duì)照組，AA基因型頻率明顯低于對(duì)照組（χ2=4.129～8.564，P<0.05）；中重度RRTI病兒GG基因型、G等位基因頻率明顯高于輕度病兒，AA基因型頻率顯著低于輕度病兒（χ2=9.233～13.357，P<0.05）；AA基因型病兒年發(fā)作次數(shù)、合并呼吸困難比例，以及C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、γ-干擾素和丙二醛等指標(biāo)均顯著低于AG和GG基因型病兒，超氧化物歧化酶則顯著高于AG和GG基因型病兒（χ2=7.573，F(xiàn)=4.668～24.317，P<0.05）。

結(jié)論TLR4基因 rs2737190位點(diǎn)AG基因型、G等位基因頻率會(huì)增加小兒RRTI易感性，并促進(jìn)其炎癥反應(yīng)升高和病情進(jìn)展。

［關(guān)鍵詞］呼吸道感染；再感染；兒童；Toll樣受體4；多態(tài)性，限制性片段長度；病人病情

［中圖分類號(hào)］R517.6;R392.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］2096-5532（2024）04-0587-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.114

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20240829.1446.006;2024-09-0211：50：26

Association of Toll-like receptor 4 gene polymorphism with recurrent respiratory tract infection in children

ZHAO Shujing， MA Zhiping， ZHANG Jinbiao， FU Feng， FENG Nana

（First Division of Pediatric Department， Cangzhou Hospital of Integrated TCM-WM， Cangzhou 061000， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the association of Toll-like receptor 4 （TLR4） gene polymorphism with recurrent respiratory tract infection （RRTI） in children.

MethodsA total of 107 children with RRTI were enrolled as RRTI group， and 103 children who underwent physical examination and did not experience RRTI in the past year were enrolled control group. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism was used to analyze the rs2737190 polymorphism of the TLR4 gene in each group. TLR4 gene polymorphism was compared between children with different severities， and clinical features were compared between children with different TLR4 gene polymorphisms.

ResultsCompared with the control group， the observation group had significantly higher frequencies of AG genotype and G allele and a significantly lower frequency of AA genotype at TLR4 rs2737190 locus （χ2=4.129-8.564，P<0.05）. Compared with the children with mild RRTI， the children with moderate-to-severe RRTI had significantly higher frequencies of GG genotype and G allele and a significantly lower frequency of AA genotype （χ2=9.233-13.357，P<0.05）. Compared with the children with AG genotype or GG genotype， the children with AA genotype had significantly lower number of annual attacks and proportion of children with dyspnea， significantly lower serum levels of C-reactive protein， interleukin-6， interferon-γ， and malondialdehyde， and a significantly higher level of superoxide dismutase （χ2=7.573，F(xiàn)=4.668-24.317， P<0.05）.

ConclusionThe frequency of AG genotype and G allele at TLR4 rs2737190 locus may increase the susceptibility to RRTI and promote inflammation response and disease progression in children.

［Key words］respiratory tract infections; reinfection; child; Toll-like receptor 4; polymorphism， restriction fragment length; patient acuity

反復(fù)呼吸道感染（RRTI）可反復(fù)發(fā)作且病因較為復(fù)雜，若未及時(shí)進(jìn)行有效治療，容易出現(xiàn)多種并發(fā)癥[1-2]。此外，RRTI在長期反復(fù)治療過程中藥物對(duì)肝損傷風(fēng)險(xiǎn)也大。相關(guān)研究結(jié)果顯示，不同個(gè)體之間疾病易感性和臨床表現(xiàn)多樣與單核苷酸基因多態(tài)性（SNP）密切相關(guān)[3]。Toll樣受體4（TLR4）作為TLRs家族成員，是一種能通過識(shí)別病原微生物的跨膜蛋白來抑制病原體侵襲的炎癥激活蛋白[4]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其基因多態(tài)性與哮喘[5]、慢性阻塞性肺疾病[6]、肺癌[7]等多種呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)，但關(guān)于它與RRTI關(guān)系的研究并不多見。本研究采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)檢測(cè)RRTI病兒TLR4基因多態(tài)性并探討二者的關(guān)系，旨在為臨床治療RRTI提供新的靶點(diǎn)和方向。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取2022年1月—2023年4月河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的107例RRTI病兒作為觀察組，另選103例同期體檢健康兒童作為對(duì)照組（近1年未出現(xiàn)RRTI）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①RRTI符合《兒童反復(fù)呼吸道感染臨床診療路徑（2022版）》[8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡3～12周歲；③采血前4周內(nèi)未使用抗感染藥物、免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素等治療；④病兒家長簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前已經(jīng)存在驚厥；②合并先天性呼吸系統(tǒng)畸形、先天性心臟??；③合并顱內(nèi)感染、腦血管病者；④合并免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、肝腎脾等重要臟器功能障礙。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、貧血史等一般資料比較差異均無顯著性（P>0.05），具有可比性。見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2研究方法

1.2.1TLR4基因rs2737190位點(diǎn)PCR-RFLP測(cè)定采集受試者外周靜脈血（EDTA抗凝）2 mL，使用DNA提取試劑盒提取外周血DNA，并以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：94 ℃、10 min，94 ℃、30 s，64 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用內(nèi)切酶進(jìn)行處理，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。在SNP基因庫中查詢到TLR4-2381A/G位點(diǎn)引物序列（上游5′-TGGAAAATC-

ACCGTCATCCT-3′，下游5′-GCTGCCTCTAGTGCCCTGTA-3′）。采用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并委托北京擎科生物公司合成引物，采用美國ABI公司3730XL型基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分型。

1.2.2TLR4基因rs2737190位點(diǎn)多態(tài)性與病情及臨床特征關(guān)系病兒入院后采集空腹靜脈血4 mL，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)，ELISA法檢測(cè)C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、γ-干擾素（IFN-γ）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）等指標(biāo)，所有操作均按照試劑盒（上海酶聯(lián)免疫生物公司）說明書步驟進(jìn)行。將RRTI病兒按肺部感染嚴(yán)重程度分為輕度組和中重度組，比較兩組TLR4基因rs2737190位點(diǎn)基因型分布特征。并統(tǒng)計(jì)分析不同基因型病兒性別、年齡、病程、家族史、年發(fā)作次數(shù)、合并呼吸困難、入院后體溫，以及血常規(guī)、血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果等的差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布者以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)以頻數(shù)和百分率表示，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果選取Pearson卡方檢驗(yàn)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1TLR4 rs2737190位點(diǎn)基因多態(tài)性與發(fā)病關(guān)系

觀察組和對(duì)照組TLR4基因rs2737190位點(diǎn)基因型分布經(jīng)Hard-Weinberg檢驗(yàn)符合遺傳平衡，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與對(duì)照組比較，觀察組TLR4基因rs2737190位點(diǎn)AG基因型、G等位基因頻率高于對(duì)照組，AA基因型頻率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.129～8.564，P<0.05）。提示TLR4基因rs2737190位點(diǎn)基因突變可能與本地區(qū)兒童RRTI易感性有關(guān)。見表2。

2.2TLR4 rs2737190位點(diǎn)基因多態(tài)性與病情關(guān)系

與RRTI病情輕度組病兒比較，中重度組GG基因型、G等位基因頻率明顯升高，AA基因型頻率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.233～12.373，P<0.05）。提示TLR4基因rs2737190位點(diǎn)基因多態(tài)性與RRTI病情進(jìn)展有關(guān)，其中GG基因型病兒病情嚴(yán)重的風(fēng)險(xiǎn)更高。見表3。

2.3TLR4rs2737190位點(diǎn)基因型與臨床特征關(guān)系

AA基因型RRTI病兒的年發(fā)作次數(shù)、合并呼

吸困難比例，以及CRP、IL-6、IFN-γ和MDA水平

均明顯低于AG和GG基因型，而SOD水平明顯高于AG和GG基因型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.573，F(xiàn)=4.668～24.317，P<0.05）。不同基因型病兒性別、年齡和體溫比較，差異均無顯著性（P>0.05）。提示TLR4基因rs2737190位點(diǎn)AG和GG基因型的RRTI病兒可能具有更嚴(yán)重的全身免疫炎癥反應(yīng)和病情。見表4。

3討論

RRTI是指每年發(fā)生上下呼吸道感染超過一定范圍的呼吸系統(tǒng)疾病，約占兒科門診就診病例1/3，隨著人們生活方式及居住環(huán)境變化，其發(fā)病率有逐年升高趨勢(shì)[9]。目前認(rèn)為免疫功能缺陷[10]、營養(yǎng)不良[11]、病原體感染[12]等因素可能是引發(fā)RRTI的重要機(jī)制，其中以免疫炎癥反應(yīng)與RRTI關(guān)系最為密切。TLR4信號(hào)通路及相關(guān)炎癥細(xì)胞因子與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，其表達(dá)水平能在一定程度上反映機(jī)體免疫水平[13-15]。因此，探究TLR4信號(hào)及炎癥因子表達(dá)與RRTI關(guān)系具有一定臨床意義。

TLR4是一種非催化性的跨膜蛋白，能通過識(shí)別異常病原微生物的內(nèi)毒素、脂多糖、壞死細(xì)胞釋放的熱休克蛋白來刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答[16]。TLR4能在這些獲得性免疫識(shí)別作用下促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞活化，而后者活化后可分泌IL-6、IFN-γ等細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)[17-19]。相關(guān)研究顯示，在肺部感染病人中血清TLR4 mRNA表達(dá)高于正常人群，提示TLR4 mRNA表達(dá)升高可能增加下呼吸道感染風(fēng)險(xiǎn)[20]。還有研究結(jié)果顯示，在幽門螺桿菌感染胃部過程中，TLR4被發(fā)現(xiàn)能通過靶向下游蛋白調(diào)控機(jī)體對(duì)幽門螺桿菌的抗感染免疫[21]。近年來多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，遺傳因素也是引發(fā)不同兒童個(gè)體對(duì)RRTI易感性的重要因素之一[22]。TLR4基因Asp299Gly位點(diǎn)多態(tài)性在國外研究中較多，但在國內(nèi)研究較少。相關(guān)基因測(cè)序機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，rs2737190基因位點(diǎn)是漢族人群中較為常見的SNP多態(tài)性位點(diǎn)[23]。rs2737190位點(diǎn)在TLR4基因啟動(dòng)子區(qū)域，能直接影響TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[24]。本文研究結(jié)果顯示，觀察組TLR4基因rs2737190位點(diǎn)的AG基因型、G等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組，野生純合AA基因型頻率則顯著低于對(duì)照組，提示TLR4基因rs2737190位點(diǎn)基因突變可能與本地區(qū)兒童RRTI易感性有關(guān)。已有研究結(jié)果顯示，新生兒氣管插管后呼吸道感染病兒rs2737190位點(diǎn)AA基因型頻率明顯低于未發(fā)生感染病兒，提示TLR4基因rs2737190位點(diǎn)AA基因型可能是呼吸道感染的保護(hù)因素[25]。相關(guān)研究結(jié)果還顯示，TLR4基因rs2737190位點(diǎn)GG基因型慢性阻塞性肺疾病病人TLR4表達(dá)更高[21]，提示GG基因型可能更具有病原體易感性。本研究結(jié)果表明，中重度RRTI病兒GG基因型、G等位基因頻率均顯著高于輕度病兒，AA基因型頻率顯著低于輕度病兒，提示TLR4基因rs2737190位點(diǎn)基因多態(tài)性與RRTI病情進(jìn)展有關(guān)，其中GG基因型病兒病情嚴(yán)重的風(fēng)險(xiǎn)更高。還有研究認(rèn)為，基因多態(tài)性可以影響RRTI易感性及進(jìn)展，還可能對(duì)預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值[26-28]。本研究也顯示，AA基因型病兒年發(fā)作次數(shù)、合并呼吸困難比例，以及CRP、IL-6、IFN-γ、MDA等指標(biāo)均顯著低于AG和GG基因型病兒，SOD則顯著高于AG和GG基因型病兒，提示該位點(diǎn)AG和GG基因型病兒可能具有更嚴(yán)重的全身免疫炎癥反應(yīng)，因此病情更為嚴(yán)重。因此，臨床針對(duì)該位點(diǎn)GG基因型病兒可增加其隨訪頻率，并在發(fā)病后盡快明確病情和及時(shí)治療。

綜上所述，TLR4基因rs2737190位點(diǎn)AG基因型、G等位基因頻率會(huì)增加小兒RRTI易感性，并促進(jìn)其病情進(jìn)展，臨床可針對(duì)此類病兒予以針對(duì)性的預(yù)防。但本研究尚有不足之處：一是TLR4基因存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，本次僅納入了rs2737190位點(diǎn)，其他可能影響RRTI易感性的位點(diǎn)有待研究，且不同位點(diǎn)之間也可能存在交叉效應(yīng)；二是本次納入樣本數(shù)較少，對(duì)于rs2737190位點(diǎn)與疾病病因及病原學(xué)之間關(guān)系尚不明確，需進(jìn)一步分析其臨床價(jià)值，具體機(jī)制有待后續(xù)研究、論證和完善。

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（本文編輯于國藝）