骨髓增生性腫瘤病人JAK-2和CALR基因表達及其與預(yù)后關(guān)系

［摘要］目的探討骨髓增生性腫瘤（MPN）病人JAK-2和CALR基因表達及其與預(yù)后的關(guān)系。

方法選取2018年7月—2022年7月石家莊市人民醫(yī)院收治的38例MPN病人納入研究組，另選取本院無血液系統(tǒng)疾病志愿者40例納入對照組，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測兩組骨髓液JAK-2與CALR基因表達。根據(jù)預(yù)后評價標(biāo)準(zhǔn)將研究組再分為低危組、中危組及高危組3個亞組，比較各亞組病人JAK-2與CALR基因表達，并采用Spearman相關(guān)性分析兩基因表達與預(yù)后的關(guān)系。

結(jié)果相較于對照組，MPN各亞組JAK-2與CALR基因表達顯著升高（F=278.674、615.206，P<0.05），其中以原發(fā)性血小板增多癥的兩基因表達最高。隨著預(yù)后評定級別由低危組到高危組轉(zhuǎn)變，MPN病人兩基因表達逐漸升高，且Spearman相關(guān)性分析顯示，兩基因表達均與病人預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)（r=－0.491、－0.503，P<0.01）。

結(jié)論MPN病人JAK-2與CALR基因表達異常升高，且其表達水平與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，臨床可據(jù)此評估MPN病人的療效及預(yù)后。

［關(guān)鍵詞］骨髓腫瘤；原發(fā)性骨髓纖維化；真性紅細胞增多癥；血小板增多，原發(fā)性；Janus激酶2；鈣網(wǎng)蛋白；基因表達；預(yù)后

［中圖分類號］R733.3;R394.3

［文獻標(biāo)志碼］A

［文章編號］2096-5532（2024）04-0561-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.115

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240829.1446.007;2024-08-3019：15：24

The expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with myeloproliferative neoplasms and their association with prognosis

LI Suxin， WANG Youjun， FENG Liqian， WANG Miao， LI Dongliang， WEN Wen

（Department of Hematology， Shijiazhuang People’s Hospital，Shijiazhuang 050000， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with myeloproliferative neoplasms （MPN） and their association with prognosis.

MethodsA total of 38 patients with MPN who were admitted to Shijia-

zhuang People’s Hospital from July 2018 to July 2022 were enrolled as study group， and 40 volunteers without hematological diseases in our hospital were enrolled as control group. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression levels of the JAK-2 and CALR genes in bone marrow fluid. According to the criteria for prognostic evaluation， the patients in the study group were further divided into low-risk subgroup， intermediate-risk subgroup， and high-risk subgroup. The expression levels of the JAK-2 and CALR genes were compared between the three subgroups， and a Spearman correlation analysis was used to investigate the correlation of the expression levels of the JAK-2 and CALR genes with prognosis.

ResultsCompared with the control group， each subgroup of the MPN group had significant increases in the expression levels of the JAK-2 and CALR genes （F=278.674，615.206;P<0.05）， with the highest expression levels of the two genes in patients with essential thrombocythemia. For the patients with MPN， there were gradual increases in the expression levels of the JAK-2 and CALR genes from the low-risk group to the high-risk group， and the Spearman correlation analysis showed that the expression levels of the JAK-2 and CALR genes were significantly negatively correlated with the prognosis of patients （r=-0.491，-0.503;P<0.01）.

ConclusionThere are abnormal increases in the expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with MPN， and the expression levels of the two genes are negatively correlated with prognosis. Therefore， they can be used to assess the treatment outcome and prognosis of MPN patients in clinical practice.

［Key words］bone marrow neoplasms; primary myelofibrosis; polycythemia vera; thrombocythemia， essential; janus kinase 2; calreticulin; gene expression; prognosis

骨髓增生性腫瘤（MPN）是一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)疾病，包括骨髓纖維化（MF）、真性紅細胞增多癥（PV）和原發(fā)性血小板增多癥（ET）[1-3]。其中，PV和ET在臨床上還具有較高的合并血栓出血性并發(fā)癥風(fēng)險[4]。此外，MPN的發(fā)病機制比較復(fù)雜，多種基因突變可能影響病人的預(yù)后[5]。近年來國內(nèi)外研究顯示，Janus激酶2（JAK-2）和鈣網(wǎng)蛋白（CALR）等基因突變可作為MPN發(fā)病的“驅(qū)動”突變，而相應(yīng)的基因靶向藥物治療可有效改善病人臨床癥狀和生活質(zhì)量[6-8]。然而，關(guān)于JAK-2和CALR基因表達與MPN病人預(yù)后相關(guān)性的研究相對較少。因此，本研究采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測不同風(fēng)險以及不同類型MPN病人JAK-2及CALR基因表達，旨在探討二者表達與病人預(yù)后相關(guān)性?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1資料與方法

1.1研究對象

按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，將2018年7月—2022年7月石家莊市人民醫(yī)院收治的38例MPN病人納入研究組，其中男性21例、女性17例，年齡41～65歲，平均（51.33±5.74）歲。按照相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)將MPN病人分為PV組、ET組和MF組等3個亞組，其中PV組16例、ET組17例、MF組5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO及NCCN制定的MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]；②了解本研究內(nèi)容并接受相關(guān)檢查者；③無認(rèn)知障礙及精神疾??；④自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并骨髓增生異常綜合征（MDS）、慢性髓系白血?。–ML）、凝血-纖溶障礙等其他血液系統(tǒng)疾病；②臨床資料不全及不配合相應(yīng)檢查者；③合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能障礙者。同時，按照年齡±2歲和男女構(gòu)成比±5%的標(biāo)準(zhǔn)選取本院無血液系統(tǒng)疾病志愿者40例納入對照組。兩組研究對象體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、合并基礎(chǔ)疾病等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核通過。

1.2研究方法

1.2.1JAK-2和CALR基因表達的RT-PCR檢測

全部受試者均于髂后上棘行骨髓穿刺術(shù)采集骨髓液2 mL，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，置于4 ℃低溫保存。按GenBank登錄的JAK-2（NM_214113.1）和CALR（NM_004343.3）的序列，應(yīng)用DNA Star、Primer 5.0軟件設(shè)計相應(yīng)的特異性引物。JAK-2和CALR引物及其序列見表2。引物由哈爾濱賽拓生物技術(shù)有限公司合成。骨髓液在分離單個核細胞、提取DNA片段后采用RT-PCR檢測JAK-2和CALR基因初始拷貝數(shù)（即表達量）。所有檢測均由本院檢驗科完成。

1.2.2MPN預(yù)后分組方法根據(jù)MPN病人的預(yù)后評價標(biāo)準(zhǔn)分為低危組、中危組和高危組3個亞組。根據(jù)PV、ET和MF包含基因突變特征的國際預(yù)后評價系統(tǒng)（MIPSS）[11-12]標(biāo)準(zhǔn)進行預(yù)后判斷。PV：①低危（0～1分），②中危（2～5分），③高危（≥6分）；ET：①低危（0～1分），②中危（2～3分），③高危（≥4分）；MF（MIPSS-70）[12]：①低危（0～1分），②中危（2～4分），③高危（≥5分）。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料數(shù)據(jù)以±s形式表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料數(shù)據(jù)以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman秩相關(guān)分析JAK-2和CALR基因表達與MPN預(yù)后的相關(guān)性。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組JAK-2及CALR基因表達比較

相較于對照組，MPN各亞組JAK-2和CALR基因表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=278.674、615.206，P<0.001）。此外，采用Bonferroni法比較MPN各亞組JAK-2和CALR基因表達的結(jié)果顯示，ET組JAK-2和CALR基因表達水平均明顯高于PV組及MF組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.098～11.877，P<0.05）。提示JAK-2和CALR基因異常表達與MPN發(fā)病相關(guān)。見表3。

2.2不同預(yù)后病人JAK-2及CALR表達比較

依據(jù)PV、ET和MF預(yù)后評價標(biāo)準(zhǔn)，將MPN病人分為低危組19例、中危組10例和高危組9例。隨著MPN病人預(yù)后危險度升級，JAK-2及CALR基因表達均逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=65.294、55.950，P<0.05）。此外，采用Bonferroni法比較MPN不同預(yù)后各亞組JAK-2和CALR基因表達的結(jié)果顯示，高危組JAK-2和CALR基因表達均明顯高于低危組及中危組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.762～6.278，P<0.05）。提示MPN病人JAK-2和CALR基因表達與其預(yù)后相關(guān)。見表4。

2.3JAK-2和CALR表達與MPN預(yù)后相關(guān)性

將MPN預(yù)后3個亞組中的低危組賦值為0、中危組為1、高危組為2，對病人預(yù)后與JAK-2和CALR基因表達進行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，MPN病人預(yù)后與JAK-2和CALR基因表達均呈負(fù)相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（r=－0.491、－0.503，P<0.05）。提示MPN病人JAK-2和CALR基因表達越高其預(yù)后越差。

3討論

既往國內(nèi)外的研究表明，多種基因突變參與了MPN疾病的發(fā)生與發(fā)展，其中以JAKs及CLAR基因最為常見[4，12-14]。JAK作為蛋白絡(luò)氨酸激酶，共包含JAK-1、JAK-2、JAK-3和JAK-4等4種，其活性調(diào)節(jié)主要依靠自身磷酸化及與作用蛋白相結(jié)合，其中JAK-2突變多會影響骨髓造血細胞的信號通道，以JAK2-V617F基因突變率最高，會引起血脂檢查異常，促進血栓形成、繼發(fā)骨髓纖維化等；CALR基因常由于第9外顯子體細胞發(fā)生突變，影響細胞糖蛋白合成，導(dǎo)致糖蛋白折疊異常、鈣離子動態(tài)失衡，進而誘導(dǎo)細胞異常增殖、分化及凋亡[15-19]。當(dāng)前關(guān)于JAK-2及CALR基因與MPN病人預(yù)后關(guān)系的研究主要集中在有無突變本身，而鮮有研究報道MPN病人JAK-2及CALR基因表達與其預(yù)后的關(guān)系。因此，本研究旨在探討MPN病人骨髓液單個核細胞中JAK-2及CALR基因的總體表達及其與預(yù)后之間的關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，與對照組相比較，MPN病人JAK-2及CALR基因表達水平顯著升高，且不同疾病類型其基因表達不同，其中ET病人JAK-2及CALR基因表達水平相較PV和MF病人更高，提示JAK-2及CALR基因異常表達可能更多地參與了ET的發(fā)生與發(fā)展，這一結(jié)果與外國相關(guān)研究結(jié)果相類似[20-22]。在機制上，有研究顯示MPN病人中性粒細胞和血小板中的JAK-2激酶是與細胞因子和生長因子受體結(jié)構(gòu)域關(guān)聯(lián)的酪氨酸激酶，它與血小板表面P-選擇蛋白和多形核白細胞表面活化標(biāo)記物的表達增加有關(guān)[23]。JAK-2表達量增加、功能過度活躍可使它與下游的髓樣細胞因子受體EPOR、G-CSFR等結(jié)合，誘導(dǎo)受體發(fā)生構(gòu)象改變；激活的JAK-2通過其受體磷酸化后作用于其他信號分子（如信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白），使后者發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)它們的同源或異源二聚化，并隨后運輸至細胞核，調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進細胞的生長[24-26]。而CALR作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，與ER中血小板生成素受體細胞外結(jié)構(gòu)域的N-糖基化殘基相結(jié)合，通過新的C末端及其正電荷加強，導(dǎo)致受體被激活，參與N-糖基化蛋白質(zhì)和鈣儲存的質(zhì)量控制，誘導(dǎo)單核細胞分泌細胞因子，促進細胞的生長[27]。本研究結(jié)果還顯示，JAK-2及CALR基因表達與MPN病人不同預(yù)后亞組均呈顯著負(fù)相關(guān)，即隨著病人預(yù)后分級由低危組向高危組轉(zhuǎn)變其基因表達隨之升高，提示早期針對JAK-2或CALR基因的干預(yù)性治療可能有效控制病人預(yù)后向高危轉(zhuǎn)化，這與相關(guān)治療學(xué)研究結(jié)論相一致[28-29]。

本研究尚存在一定局限性，主要是由于納入樣本單一且量有限，研究數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)可能存在偏差，對研究結(jié)果可靠性存在影響；選取JAK-2和CALR基因表達作為研究項目，兩者均與MPN密切相關(guān)，但尚未深入探究三者間聯(lián)系、機制等。因此，尚需進一步擴大樣本量及樣本來源、深入探究其作用機制，以得到更具有前瞻性、客觀性的結(jié)果。

綜上所述，MPN病人JAK-2和CALR基因表達異常升高，而且其表達與預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)，臨床可據(jù)此評估MPN病人的療效及預(yù)后。

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（本文編輯于國藝）