氫嗎啡酮對脂多糖誘導小鼠肺泡巨噬細胞高爾基體應激影響

［摘要］目的探討氫嗎啡酮（HM）對脂多糖（LPS）誘導的小鼠肺泡巨噬細胞高爾基體應激的影響及其機制。

方法以10 mg/L LPS處理小鼠肺泡巨噬細胞系MH-S，構建肺泡巨噬細胞高爾基體應激模型。將細胞隨機分為Control組（A組，正常培養(yǎng)）、LPS組（B組，給予10 mg/L的LPS）、LPS+HM組（C組，給予1 μmol/L HM和10 mg/L LPS）、Nrf2 siRNA+LPS+HM組（D組，Nrf2 siRNA轉染后給予1 μmol/L HM和10 mg/L LPS）和NC siRNA+LPS+HM組（E組，NC siRNA轉染后給予1 μmol/L HM和10 mg/L LPS）。采用ELISA法檢測細胞上清液白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素6（IL-6）含量；檢測丙二醛（MDA）含量與超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用Western blot法檢測核因子E2相關因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、高爾基體基質蛋白130（GM130）、高爾基體蛋白97（Golgin-97）、甘露糖苷酶Ⅱ（Mannosidase Ⅱ）、鈣轉運ATP酶2C型成員1（ATP2C1）蛋白表達水平；透射電鏡下觀察細胞高爾基體形態(tài)學改變。

結果與A組比較，B組IL-1β、IL-6、MDA含量顯著升高及Nrf2、HO-1蛋白表達上調，SOD活性顯著降低及GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白的表達下調（F=2.33～47.61，P＜0.05）；與B組比較，C組IL-1β、IL-6、MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高及Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達上調（P＜0.05）；與C組比較，D組IL-1β、IL-6、MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低及Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達下調（P＜0.05）。透射電鏡顯示，C組細胞高爾基體損傷、空泡化與碎片化較B組減輕；D組細胞高爾基體損傷、空泡化與碎片化較C組加重。

結論HM通過調控Nrf2/HO-1信號通路抑制LPS誘導的肺泡巨噬細胞高爾基體應激，減輕細胞炎癥與氧化應激反應。

［關鍵詞］氫嗎啡酮；脂多糖類；巨噬細胞，肺泡；高爾基體；氧化性應激；血紅素加氧酶-1；小鼠

［中圖分類號］R965

［文獻標志碼］A

［文章編號］2096-5532（2024）04-0523-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.135

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240927.1331.002;2024-09-2908：36：49

Effect of hydromorphone on Golgi stress in lipopolysaccharide-attacked mouse alveolar macrophages

LI Shaona， JIA Changxin， WU Xiuyun， ZHU Youzhuang， ZHAO Qin， XU Yexiang

（Department of Anesthesiology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266000， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of hydromorphone （HM） on Golgi stress in lipopolysaccharide （LPS）-attacked mouse alveolar macrophages and its mechanism.

MethodsThe mouse alveolar macrophage cell line MH-S was attacked with 10 mg/L LPS to establish a model of Golgi stress， and then the cells were randomly divided into control group （group A， normal culture）， LPS group （group B treated with 10 mg/L LPS）， LPS+HM group （group C treated with 1 μmol/L HM and 10 mg/L LPS）， Nrf2 siRNA+LPS+HM group （group D treated with 1 μmol/L HM and 10 mg/L LPS after Nrf2 siRNA transfection）， and NC siRNA+LPS+HM group （group E treated with 1 μmol/L HM and 10 mg/L LPS after NC siRNA transfection）. ELISA was used to measure the content of interleukin 1β （IL-1β） and interleukin 6 （IL-6） in cell supernatant; the content of malondialdehyde （MDA） and the activity of superoxide dismutase （SOD） were measured; Western blot was used to measure the protein expression levels of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase-1 （HO-1）， Golgi Matrix Protein of 130 （GM130）， Golgin-97， Mannosidase Ⅱ， and ATP2C1; transmission electron microscopy was used to observe the morphological changes of Golgi apparatus.

ResultsCompared with group A， group B had significant increases in the content of IL-1β， IL-6， and MDA and the protein expression levels of Nrf2 and HO-1 and significant reductions in the activity of SOD and the protein expression levels of GM130， Golgin-97， Mannosidase Ⅱ， and ATP2C1 （F=2.33-47.61，P<0.05）. Compared with group B， group C had significant reductions in the content of IL-1β， IL-6， and MDA and significant increases in the activity of SOD and the protein

expression levels of Nrf2， HO-1， GM130， Golgin-97， Mannosidase

Ⅱ， and ATP2C1 （P<0.05）. Compared with group C， group D had significant increases in the content of IL-1β， IL-6， and MDA and significant reductions in the activity of SOD and the protein expression levels of Nrf2， HO-1， GM130， Golgin-97， Mannosidase Ⅱ， and ATP2C1 （P<0.05）. Transmission electron microscopy showed that compared with group B， group C had alleviation of 76S6jeEz77S5xcTvvFmbFA==the damage， vacuolization， and fragmentation of Golgi apparatus， and compared with group C， group D had aggravation of the da-

mage， vacuolization， and fragmentation of Golgi apparatus.

ConclusionHM inhibits Golgi stress in LPS-attacked alveolar macrophages by regulating the Nrf2/HO-1 signaling pathway， thereby alleviating cellular inflammation and oxidative stress response.

［Key words］hydromorphone; lipopolysaccharides; macrophages， alveolar; Golgi apparatus; oxidative stress; heme oxyge-

nase-1; mice

內毒素急性肺損傷（ALI）是一種由膿毒癥誘發(fā)的嚴重且難以控制的肺部炎癥反應，目前尚無特效的臨床治療方法，是重癥監(jiān)護室病人死亡的主要原因之一[1]。肺泡巨噬細胞作為肺組織抵御致病微生物和外源性顆粒的第一道防線，在維持機體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和調控炎癥反應方面發(fā)揮著至關重要的作用[2]。高爾基體是肺泡巨噬細胞內的一個細胞器，主要參與脂質和蛋白質等物質的細胞內運輸。高爾基體應激反應可影響肺組織細胞的功能狀態(tài)，從而對ALI的發(fā)病和病程產生重要影響[3]。作為機體重要的內源性保護機制之一，核因子E2相關因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）信號通路的激活可抑制過度的高爾基體應激反應，從而為ALI提供保護[4]。氫嗎啡酮（HM）是嗎啡的衍生物，由于其作用強于嗎啡且起效快，近年來被廣泛用于各種急慢性疼痛的綜合治療。研究證實，HM對ALI有保護作用[5]，但其作用機制尚不清楚。本研究旨在探討HM是否能通過調控Nrf2/HO-1信號通路減輕肺泡巨噬細胞的高爾基體應激反應，從而為ALI的臨床治療提供新的依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞株本實驗所用小鼠肺泡巨噬細胞系MH-S，購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.1.2藥品與試劑鹽酸HM注射液（宜昌人福藥業(yè)有限公司）；脂多糖（LPS，Sigma公司）；白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素6（IL-6）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒與超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Nrf2抗體和高爾基體基質蛋白130（GM130）抗體（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）；HO-1抗體和高爾基體蛋白97（Golgin-97）抗體（北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司）；鈣轉運ATP酶2C型成員1（ATP2C1）和甘露糖苷酶Ⅱ（Mannosidase Ⅱ）抗體（上海拓然生物科技有限公司）；Nrf2 siRNA、Negative Control siRNA（NC siRNA，上海吉瑪制藥技術有限公司）；Lipofectamine 3000轉染試劑盒（美國Invitrogen公司）。

1.1.3儀器電泳儀和轉膜槽（北京六一生物科技有限公司）；全自動化學/熒光/凝膠成像分析系統(tǒng)（中國雪科電器有限公司）；H-7500型透射電鏡（日本HITACHI公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和建模根據文獻方法[6]，用MH-S細胞培養(yǎng)液在37 ℃、體積分數0.05 CO2條件下培養(yǎng)MH-S細胞。選擇生長狀態(tài)良好的MH-S細胞，用10 mg/L LPS處理細胞，構建LPS誘導小鼠肺泡巨噬細胞模型。

1.2.2細胞的分組與處理將培養(yǎng)的MH-S肺泡巨噬細胞分為Control組（A組）、LPS組（B組）、LPS+HM組（C組）、Nrf2 siRNA+LPS+HM組（D組）和NC siRNA+LPS+HM組（E組）。A組細胞正常培養(yǎng)，C組在實驗前2 h加入1 μmol/L HM，D組和E組肺胞巨噬細胞在實驗前48 h分別轉染Nrf2 siRNA和NC siRNA，并在實驗前2 h加入1 μmol/L HM。B、C、D、E組分別在實驗0 h加入10 mg/L LPS建立LPS誘導MH-S細胞模型。經LPS作用24 h后，收集各組細胞及其上清液進行相關實驗檢測。

1.2.3ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6含量根據文獻方法[7]，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心15 min。采用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6的含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度（A）值，繪制標準曲線，計算IL-1β和IL-6的含量。

1.2.4細胞MDA含量與SOD活性檢測收集各組細胞，用PBS沖洗，1 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，留取細胞沉淀，加入等滲PBS制備細胞懸液，用二奎琳甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，應用MDA試劑盒和SOD試劑盒測定細胞中MDA含量和SOD活性，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5Western blot法測定蛋白表達將RIPA裂解液加入含有細胞的六孔板中，用刮刀輕輕刮掉細胞并吸入離心管內，置于冰上裂解15 min。將離心管上下混勻，置于離心機內低溫（4 ℃）12 000 r/min離心20 min，去上清液用BCA法測定蛋白濃度，計算上樣量。每份樣品取40 μg，95 ℃變性10 min，加入凝膠孔中，將電壓調至60 V進行電泳，然后轉移至PVDF膜上。將反應膜置于封閉液中，37 ℃封閉1 h，然后將反應膜分別放入稀釋后的一抗中，4 ℃反應過夜。用TBST洗滌3次以清除游離的一抗，每次洗滌10 min，再放入稀釋的二抗中緩慢搖動60 min，用TBST洗滌3次以清除游離的二抗。將反應膜浸于ECL發(fā)光液中，室溫下反應3 min。使用全自動化學/熒光/凝膠成像分析系統(tǒng)成像并用Image J軟件對條帶進行灰度值分析，計算目的蛋白灰度值與內參蛋白β-actin灰度值的比值，對各組目的蛋白的表達情況進行統(tǒng)計分析。

1.2.6透射電鏡觀察細胞高爾基體的形態(tài)學變化

根據文獻方法[8]，將各組細胞用刮刀刮下，置于離心機中1 000 r/min離心10 min，棄上清液，留取細胞沉淀，加入25 g/L戊二醛固定，將細胞制片，將切片浸入醋酸鈾中染色20 min，隨后浸入枸櫞酸鉛中繼續(xù)染色5 min，將染色后的切片置于單口銅網中，在透射電鏡下觀察細胞高爾基體形態(tài)學變化。

1.3統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所得計量資料數據以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組MH-S細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6含量比較

本文5組IL-1β和IL-6含量比較，差異均有顯著性（F=2.33、2.60，P＜0.05）。與A組比較，B組IL-1β和IL-6含量顯著增加（P＜0.05）；與B組比較，C組IL-1β和IL-6含量顯著降低（P＜0.05）；與C組比較，D組IL-1β和IL-6含量顯著增加（P＜0.05）；C組與E組比較，IL-1β和IL-6含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2各組MH-S細胞MDA含量和SOD活性比較

本文5組MDA含量和SOD活性比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F=2.57、3.25，P＜0.05）。與A組比較，B組細胞MDA含量顯著增加，SOD活性顯著下降（P＜0.05）；與B組比較，C組細胞MDA含量顯著降低，SOD活性顯著上升（P＜0.05）；與C組比較，D組細胞MDA含量顯著增加，SOD活性顯著下降（P＜0.05）；C組與E組比較，MDA含量與SOD活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3各組MH-S細胞Nrf2、HO-1及高爾基體應激相關蛋白表達比較

本文5組細胞Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=2.54～47.61，P＜0.05）。與A組比較，B組細胞Nrf2、HO-1蛋白的表達顯著上調，GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達顯著下調（P＜0.05）；與B組比較，C組細胞Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達顯著上調（P＜0.05）；與C組相比較，D組細胞Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達水平顯著下調（P＜0.05）；C組與E組比較，Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

2.4各組MH-S細胞高爾基體形態(tài)學變化比較

A組細胞高爾基體形態(tài)學正常，排列致密；其余

4組均可見不同程度的高爾基體損傷、空泡化與碎片化。與B組比較，C組細胞高爾基體損傷減輕，空泡化與碎片化減輕；與C組比較，D組細胞高爾基體損傷程度加重，空泡化與碎片化均加重；C組與E組細胞高爾基體損傷程度類似。見圖2。

3討論

肺泡巨噬細胞是肺內主要的抗原反應細胞，在受到內毒素等炎癥介質刺激后，會迅速激活一系列信號通路，包括Nrf2/HO-1信號通路、核因子κB和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路，進而引發(fā)一系列生化反應[9]。高爾基體應激是指當細胞在受到外界刺激時，高爾基體功能紊亂，產生大量未折疊蛋白而引發(fā)的細胞應激反應[10]。其主要特點包括刺激源多樣、反應迅速、涉及多種信號通路等[11]。適當的高爾基體應激可通過增加抗氧化酶活性、增加細胞壁厚度、激活細胞自噬與凋亡等機制保護細胞免受內毒素損傷，但是過度的高爾基體應激會導致細胞蛋白質合成和降解失衡、物質運輸障礙，甚至細胞死亡，因此對高爾基體應激的調控至關重要[12]。

GM130是位于高爾基體順面的一種基質蛋白[13]；Golgin-97是高爾基體特異性連接蛋白，主要位于高爾基體反面[14]；Mannosidase Ⅱ位于高爾基體中間體，參與糖蛋白的合成[15]；ATP2C1是一種高爾基體特異性Ca2+/Mn2+ATP酶，對維持高爾基體功能至關重要[16]。因此，本研究選擇GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1作為高爾基體應激的標志物。本文研究結果顯示，給予MH-S肺泡巨噬細胞10 mg/L LPS刺激24 h后，LPS組細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-1β和IL-6的表達水平顯著升高，細胞MDA含量增加，SOD活性降低，高爾基體應激相關蛋白GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ和ATP2C1表達下調。

Nrf2/HO-1信號通路激活是生物體內重要的內源性防御機制，有助于細胞抵抗氧化應激損傷。Nrf2是一種轉錄因子，當細胞受到氧化應激等刺激時，Nrf2從細胞質轉移至細胞核，并與DNA上的啟動子區(qū)域結合，促進HO-1等抗氧化基因的表達，進而生成一氧化碳、膽綠素和亞鐵離子，發(fā)揮清除氧自由基等抗氧化作用[17]。HM是一種阿片類鎮(zhèn)痛藥，通過作用于阿片受體和抑制疼痛信號傳遞發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[18]。此外，HM還具有抗炎作用，其機制

可能與抑制炎癥因子和前列腺素合成、調節(jié)免疫細胞活化和增殖有關，但具體作用機制尚未研究清楚[19]。本文研究結果顯示，HM抑制了LPS誘導的MH-S細胞的高爾基體應激反應，上調了Nrf2和HO-1的蛋白表達，減輕了細胞的炎癥與氧化應激反應。當應用siRNA技術敲減Nrf2基因后，HM對肺泡巨噬細胞的保護作用被部分逆轉，并伴隨著細胞Nrf2和HO-1蛋白表達的下調。

綜上所述，HM通過調控Nrf2/HO-1信號通路減輕高爾基體應激反應，從而減輕LPS誘導的MH-S肺DoZsDd57xKN584Sbug+J8zoeR/uPfaEtzOqF1Xx4akk=泡巨噬細胞的炎癥與氧化應激反應。本實驗的局限性在于HM對肺泡巨噬細胞的作用機制僅在離體細胞水平得到驗證，尚需進一步的動物實驗和臨床試驗研究，從而為HM的臨床應用提供理論依據。

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（本文編輯牛兆山）