高尿酸血癥小鼠模型構(gòu)建及其對(duì)腸屏障損傷的影響

［摘要］目的構(gòu)建穩(wěn)定的腸屏障損傷高尿酸血癥小鼠模型。

方法采用不同濃度腺嘌呤（Ade）和氧嗪酸鉀（PO）灌胃小鼠，分別在第3、7、14和21天檢測(cè)血清尿酸、尿素氮、肌酐水平和腸滲透性，檢測(cè)空腸、回腸和結(jié)腸中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)。

結(jié)果高濃度的Ade和PO導(dǎo)致小鼠尿酸升高（F=25.453～518.039，P<0.01）、體質(zhì)量降低（F=6.900～43.724，P<0.05）。50 mg/kg Ade和125 mg/kg PO連續(xù)灌胃7 d導(dǎo)致小鼠尿酸升高（P<0.05），可持續(xù)升高至21 d（P<0.05），同時(shí)腸滲透性升高（F=28.563～185.808，P<0.05）并與尿酸水平呈正相關(guān)性（r=0.876 9，P<0.05）。與正常小鼠相比，Occludin和ZO-1在高尿酸血癥小鼠回腸和結(jié)腸中表達(dá)降低（t=3.164、3.678，P<0.05），Claudin-1在空腸中表達(dá)降低（t=2.670，P<0.05）。

結(jié)論采用50 mg/kg Ade和125 mg/kg PO連續(xù)灌胃7 d可構(gòu)建腸屏障損傷的高尿酸血癥小鼠模型。

［關(guān)鍵詞］高尿酸血癥；腸；容積滲克分子濃度；疾病模型，動(dòng)物

［中圖分類(lèi)號(hào)］R589.9；R322.45

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］2096-5532（2024）04-0508-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.121

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240829.1158.003;2024-08-3107：00：03

Establishment of a mouse model of hyperuricemia with intestinal barrier injury

ZHU Xianju， LUQiulan， HU Heming（Laboratory Department of Qingdao Eighth People’s Hospital， Qingdao 266000， China） ; ［Abstract］ObjectiveTo establish a stable mouse model of intestinal barrier injury induced by hyperuricemia.

Methods

The mice were given different concentrations of adenine （Ade） and potassium oxazinate （PO） by gavage， and serum uric acid， urea nitrogen， creatinine， and intestinal permeability were measured on days 3， 7， 14， and 21. The expression levels of tight junction proteins Occludin， ZO-1， and Claudin-1 in the jejunum， ileum， and colon were measured.

ResultsThe high concentrations of Ade and PO induced a significant increase in uric acid （F=25.453-518.039，P<0.01） and a significant reduction in body weight （F=6.900-43.724，P<0.05）. Administration of 50 mg/kg Ade and 125 mg/kg PO by gavage for 7 consecutive days induced a significant increase in uric acid （P<0.05）， which continued to rise until day 21 （P<0.05）， and there was also a significant increase in intestinal permeability （F=28.563-185.808，P<0.05）， which was positively correlated with the level of uric acid （r=0.876 9，P<0.05）. Compared with normal mice， the mice with hyperuricemia had significant reductions in the expression levels of Occludin and ZO-1 in the ileum and the colon （t=3.164，3.678;P<0.05）， as well as a significant reduction in the expression level of Claudin-1 in the jejunum （t=2.670，P<0.05）.

ConclusionAdministration of 50 mg/kg Ade and 125 mg/kg PO by gavage for 7 consecutive days can establish a mouse model of hyperuricemia with intestinal barrier injury.

［Key words］hyperuricemia; intestines; osmolar concentration; disease models， animal

高尿酸血癥是一種常見(jiàn)的代謝性疾病，除導(dǎo)致痛風(fēng)外，高尿酸血癥還被認(rèn)為是代謝綜合征和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一[1-2]。基因敲除技術(shù)是構(gòu)建高尿酸血癥模型的一種重要手段，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除與尿酸代謝或尿酸排泄相關(guān)的基因（如尿酸酶UOX基因、尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC2A9基因等）可構(gòu)建穩(wěn)定的高尿酸血癥模型[3-5]。但基因敲除構(gòu)建的高尿酸血癥小鼠模型常存在不易繁殖、死亡率高等問(wèn)題。藥物誘導(dǎo)主要采用一些尿酸合成酶抑制劑或尿酸排泄抑制劑例如氧嗪酸鉀（PO）等藥物構(gòu)建高尿酸血癥模型，飲食誘導(dǎo)主要采用提供高嘌呤飲食或補(bǔ)充尿酸前體物[6]。單一的藥物或者飲食可以快速升高尿酸水平，但不能長(zhǎng)期維持。目前常聯(lián)合使用PO和腺嘌呤（Ade）構(gòu)建高尿酸血癥模型[7-8]。但目前大部分研究構(gòu)建的高尿酸血癥模型為大鼠模型，采用藥物誘導(dǎo)構(gòu)建高尿酸血癥小鼠模型的研究較少。腸道在維持體內(nèi)代謝平衡和免疫系統(tǒng)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[9]。腸屏障損傷被認(rèn)為與多種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[10-12]。建立一種穩(wěn)定的高尿酸血癥小鼠模型，并研究其腸屏障的變化及機(jī)制對(duì)于研究高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制和尋找潛在的治療途徑具有重要意義。本研究構(gòu)建一種穩(wěn)定的腸屏障損傷的高尿酸血癥小鼠模型，研究腸道與高尿酸血癥之間的關(guān)系，為未來(lái)該病的治療開(kāi)辟新的道路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J品系雄性小鼠（6周齡左右）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠被飼養(yǎng)在青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的SPF級(jí)動(dòng)物房中，可自由獲取水和食物。在適應(yīng)性飼養(yǎng)（正常飲食和正常飲水）1周后，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求，并且獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（AHQU-MAL2018-079）。

1.2高尿酸血癥小鼠模型構(gòu)建

采用Ade和PO灌胃的方式構(gòu)建高尿酸血癥小鼠模型。將小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，分別接受以下處理。正常組（Con組）：C57BL/6J小鼠接受正常標(biāo)準(zhǔn)飲食，并灌胃同實(shí)驗(yàn)組等體積的5 g/L羧甲基纖維素鈉；高尿酸血癥第1組（100 mg/kg Ade+500 mg/kg PO）：每天灌胃100 mg/kg Ade和500 mg/kg PO；高尿酸血癥第2組（50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO）：每天灌胃50 mg/kg Ade和250 mg/kg PO；高尿酸血癥第3組（50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO （2 d））：每2 d灌胃1次，每次灌胃50 mg/kg Ade和250 mg/kg PO；高尿酸血癥第4組（25 mg/kg Ade+125 mg/kg PO）：每天灌胃25 mg/kg Ade和125 mg/kg PO；高尿酸血癥第5組（50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO）：每天灌胃50 mg/kg Ade和125 mg/kg PO。PO溶解于5 g/L羧甲基纖維素鈉中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，相對(duì)于正常組，當(dāng)小鼠體質(zhì)量下降了10%～15%時(shí)，終止實(shí)驗(yàn)。21 d后，小鼠被安樂(lè)處死，收集血清及空腸、回腸和結(jié)腸組織，保存于-80 ℃低溫冰箱中。

1.3尿酸、肌酐和尿素氮的檢測(cè)

分別于灌胃后的第3、7、14和21天，小鼠禁食過(guò)夜，采集其血液，以3 500 r/min離心5 min，收集血清。使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中尿酸、肌酐和尿素氮水平。

1.4小鼠腸滲透性檢測(cè)

使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖（FD4）測(cè)定小鼠的腸道通透性。所有小鼠禁水4 h以后，灌胃400 mg/kg體質(zhì)量的FD4，并在4 h后采集其血液。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量血清中FD4的熒光強(qiáng)度，檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出FD4濃度，F(xiàn)D4濃度代表腸滲透性的大小。

1.5RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

加入總RNA抽提試劑Trizol后，將結(jié)腸組織研磨成勻漿液，加入氯仿，混勻，離心取上清液，加入同體積異丙醇，離心，棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇洗滌3次，沉淀為總RNA。使用QuickDrop超微量紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄體系：All-In-One 5×RT Master Mix 4 μL，總 RNA 5 μL，無(wú)核酶水11 μL。以上反應(yīng)體系混合均勻，于37 ℃ 15 min、60 ℃ 10 min、95 ℃ 3 min條件下反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為cDNA。

1.6熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系：BlasTaq 2×qPCR MM 10.0 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，cDNA 2.0 μL，無(wú)核酶水17.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本比較的t檢驗(yàn)；多組均數(shù)隨時(shí)間變化比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Ade和PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠的體質(zhì)量變化當(dāng)采用100 mg/kg Ade+500 mg/kg PO和

50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO誘導(dǎo)時(shí)，分別在第3、7天時(shí)小鼠體質(zhì)量減少量低于正常小鼠體質(zhì)量的20%，終止該組實(shí)驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量的方差分析顯示，F(xiàn)濃度=12.723，P＜0.001；F時(shí)間=8.375，P＜0.001；F濃度*時(shí)間=9.071，P＜0.001。灌胃之前和灌胃第3、7天時(shí)，各組小鼠體質(zhì)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.037～2.245，P＞0.05）。第14天時(shí)，不同濃度處理組小鼠體質(zhì)量之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.901，P＜0.05），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠體質(zhì)量顯著低于正常組（P<0.01）。建模第21天時(shí)，不同濃度處理組小鼠體質(zhì)量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=43.724，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠體質(zhì)量顯著低于正常組（P<0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2Ade和PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠尿酸變化

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)濃度=159.443，P＜0.001；F時(shí)間=107.273，P＜0.001；F濃度*時(shí)間=99.518，P＜0.001。灌胃第3天時(shí)，各組小鼠的尿酸差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.034，P>0.05）。第7天時(shí)，各組小鼠的尿酸水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.453，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠尿酸水平顯著高于正常組（P<0.01）。在第14天時(shí)，各組小鼠的尿酸水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=518.039，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠尿酸水平高于正常組（P<0.01）。第21天時(shí)，各組小鼠的尿酸水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=232.211，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠尿酸水平高于正常組（P<0.01）。100 mg/kg Ade+500 mg/kg PO組和50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO組小鼠尿酸水平從第3天開(kāi)始高于正常組小鼠（P<0.01）。見(jiàn)圖2。

2.3Ade和PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠尿素氮和肌酐的變化

重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，肌酐、尿素氮F濃度=123.244、97.092，P＜0.001；F時(shí)間=64.808、36.101，P＜0.001；F濃度*時(shí)間=11.924、13.130，P＜0.001。第3天時(shí)，正常組、50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO（2 d）、 50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO及25 mg/kg Ade+125 mg/kg PO各組小鼠的肌酐、尿素氮差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.2390、1.569，P>0.05）。采用100 mg/kg Ade+500 mg/kg PO及50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO灌胃誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血清肌酐、尿素氮水平在第3天時(shí)均高于正常組小鼠（P<0.01）。在第7天時(shí)，各組小鼠肌酐、尿素氮的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=77.675、47.127，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠肌酐和尿素氮顯著高于正常小鼠（P<0.01）。第14天時(shí)，各組小鼠肌酐、尿素氮比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.469、44.953，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠肌酐和尿素氮高于正常小鼠（P<0.01）。第21天時(shí)，各組小鼠肌酐、尿素氮的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.872、80.966，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠肌酐、尿素氮水平高于正常小鼠（P<0.01）。見(jiàn)圖3A、B。

A：不同濃度Ade和PO灌胃第3、7、14和21天時(shí)小鼠血清肌酐變化；B：不同濃度Ade和PO灌胃第3、7、14和21天時(shí)小鼠血清尿素氮變化。與正常組比較，**P<0.01。

2.4Ade和PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腸滲透性變化

重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，F(xiàn)濃度=172.161，P＜0.001；F時(shí)間=49.938，P＜0.001；F濃度*時(shí)間=36.387，P＜0.001。在第3天時(shí)，兩組小鼠腸滲透性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.310，P>0.05）；第7、14、21天時(shí)，兩組小鼠腸滲透性的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.563～185.808，P<0.01）。見(jiàn)圖4A。腸滲透性與血清尿酸水平呈正相關(guān)性（r=0.876 9，P<0.01）。見(jiàn)圖4B。

2.5高尿酸血癥小鼠緊密連接蛋白表達(dá)變化

在空腸中，與正常組相比，50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠Claudin-1的表達(dá)量降低（t=2.670，P=0.016），見(jiàn)圖5A。在回腸中，50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠Occludin和ZO-1的表達(dá)量低于正常組（t=3.164、3.678，P<0.01）。見(jiàn)圖5B。在結(jié)腸中，50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠Occludin和ZO-1的表達(dá)量低于正常組（t=9.040、13.215，P<0.01）。見(jiàn)圖5C。

A：50 mg/kg Ade和125 mg/kg PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腸滲透性變化；B：血清尿酸水平與腸滲透性的相關(guān)性分析。與正常組比較，**P<0.01。

A：空腸組織Occludin、ZO-1、Claudin-1基因的表達(dá)；B：回腸組織Occludin、ZO-1、Claudin-1基因的表達(dá)；C：結(jié)腸組織Occludin、ZO-1、Claudin-1基因的表達(dá)。

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖5高尿酸血癥小鼠緊密連接蛋白表達(dá)變化

3討論

本研究結(jié)果顯示，50 mg/kg的Ade及125 mg/kg的PO連續(xù)灌胃7 d可成功構(gòu)建高尿酸血癥小鼠模型，高尿酸水平可持續(xù)至21 d。伴隨著尿酸的升高，腸滲透性也升高并與尿酸水平呈正相關(guān)。緊密連接蛋白Occludin和ZO-1在回腸和結(jié)腸中表達(dá)降低，Claudin-1在空腸中表達(dá)降低，表明緊密連接蛋白參與調(diào)控高尿酸血癥小鼠腸滲透性。高尿酸血癥是由于尿酸產(chǎn)生增多或排泄減少而引起的一種代謝性疾病，除了引起痛風(fēng)外，還與糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。構(gòu)建合適的高尿酸血癥模型對(duì)研究高尿酸血癥及相關(guān)的并發(fā)癥具有重要意義。目前，高尿酸血癥模型主要分為基因修飾和環(huán)境誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型。高尿酸血癥大鼠模型構(gòu)建的研究較多[7，14-16]，但對(duì)高尿酸血癥小鼠模型構(gòu)建的研究較少。且在不同的研究中，不同的抑制劑用量、誘導(dǎo)期、給藥方法導(dǎo)致所得模型實(shí)際上無(wú)法進(jìn)行比較[17-19]。

腸屏障損傷被認(rèn)為與多種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[20]。建立一種腸屏障損傷的高尿酸血癥小鼠模型對(duì)于深入研究高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制和尋找潛在的治療途徑具有重要的意義。本研究結(jié)果顯示，隨著尿酸濃度的升高，模型小鼠腸滲透性也不斷增高，腸滲透性和尿酸水平呈正相關(guān)，與鄒通等[21-22]研究的尿酸酶基因敲除的高尿酸血癥小鼠類(lèi)似，均現(xiàn)腸屏障損傷。腸屏障損傷可能是尿酸升高的重要影響因素[23]。腸滲透性增加可導(dǎo)致腸道

菌群及有害代謝產(chǎn)物通過(guò)腸屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而進(jìn)入各個(gè)靶器官，增加系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，引起各種代謝性疾病的發(fā)生[24]。緊密連接蛋白在維持腸屏障功能中起著重要的作用，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致腸屏障損傷、腸滲透性增加。

綜上所述，采用50 mg/kg Ade及125 mg/kg PO連續(xù)灌胃7d可構(gòu)建穩(wěn)定的高尿酸血癥小鼠模型，模型小鼠尿酸水平可持續(xù)升高至21 d，同時(shí)伴隨著腸屏障損傷，其腸滲透性與尿酸水平呈正相關(guān)。

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（本文編輯周曉彬）