YY1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響及其分子機(jī)制

［摘要］目的探討轉(zhuǎn)錄因子陰陽(yáng)1（YY1）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響及其分子機(jī)制。

方法體外培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87，對(duì)細(xì)胞過(guò)表達(dá)或敲低YY1后，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低YY1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87遷移的影響；通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（GTRD）預(yù)測(cè)YY1下游靶基因，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YY1下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶15（MMP15）mRNA及其蛋白的表達(dá)情況；利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YY1與MMP15啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HA-YY1的同時(shí)敲低MMP15對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87遷移的影響。

結(jié)果Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與未過(guò)表達(dá)HA-YY1的對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)HA-YY1組U251和U87細(xì)胞的遷移能力顯著提高（t=13.300、5.847，P<0.05）；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HA-YY1組U251和U87細(xì)胞的劃痕間距較對(duì)照組明顯變?。╰=9.698、7.215，P<0.05）；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HA-YY1組U251和U87細(xì)胞的克隆形成能力較對(duì)照組顯著提高（t=5.871、5.095，P<0.05）；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，YY1能夠直接結(jié)合到MMP15的啟動(dòng)子區(qū)域，并促進(jìn)MMP15的表達(dá)；而敲低MMP15可以抑制由于YY1過(guò)表達(dá)而促進(jìn)的細(xì)胞遷移。

結(jié)論YY1通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活MMP15促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移。

［關(guān)鍵詞］膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；YY1轉(zhuǎn)錄因子；基質(zhì)金屬蛋白酶15；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

［中圖分類(lèi)號(hào)］R34

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］2096-5532（2024）04-0501-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.134

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20240927.1331.001;2024-09-2909：18：45

Effect of Yin Yang 1 on the migration ability of gliomacells and its molecular mechanismXIE Ranran， LUZhimin， ZHAO Gao-xiang

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of the transcription factor Yin Yang 1 （YY1） on the migration of glioma cells and its molecular mechanism.

MethodsHuman glioma U251 and U87 cells were cultured in vitro， and after the overexpression or knockdown of YY1， Transwell assay， cell scratch assay， and colony formation assay were used to observe the effect of YY1 overexpression or knockdown on the migration of glioma U251 and U87 cells. The Gene Transcription Regulation Database was used to predict the downstream targetgenes of YY1， and quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of matrix metalloproteinase 15 （MMP15）， a downstream target gene of YY1. Dual-luciferase reporter assay was used to investigate the binding region between YY1 and MMP15 promoter.Transwell assay， cell scratch assay， and colony formation assay were used to investigate the effect of HA-YY1 overexpression and MMP15 knockdown on the migration of glioma U251 and U87 cells.

ResultsTranswell assay showed that compared with the control group without HA-YY1 overexpression， the HA-YY1 overexpression group had a significant increase in the migration ability of U251 and U87 cells （t=13.300，5.847;P<0.05）. Cell scratch assay showed that the HA-YY1 overexpression group had a significant reduction in scratch spacing （t=9.698，7.215;P<0.05）. Colony formation assay showed significant increases in the colony formation ability of U251 and U87 cells with HA-YY1 overexpression （t=5.871，5.095;P<0.05）. Dual-luciferase reporter assay showed that YY1 could directly bind to the promoter region of MMP15 and promote the expression of MMP15， while knockdown of MMP15 could inhibit cell migration promoted by YY1 overexpression.

ConclusionYY1 promotes the migration of glioma cells through transcriptional activation of MMP15.

［Key words］glioblastoma; YY1 transcription factor; matrix metalloproteinase 15; cell movement

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最常見(jiàn)的具有高度侵襲性的原發(fā)性惡性腦腫瘤 [1-3]，其具有的強(qiáng)大的血管生成能力、抗輻射性和侵襲性使其成為最致命的癌癥之一[4]。轉(zhuǎn)錄因子陰陽(yáng)1（YY1）是一種在進(jìn)化上非常保守的含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的雙功能轉(zhuǎn)錄因子[5-7]，在人類(lèi)組織中廣泛表達(dá)，并參與控制多種細(xì)胞機(jī)制，其中最顯著的是YY1在細(xì)胞中分別以轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子來(lái)發(fā)揮作用[7-8]。越來(lái)越多的研究表明，YY1在腦膠質(zhì)瘤等許多癌癥細(xì)胞中高度表達(dá)，并對(duì)癌癥進(jìn)展起著至關(guān)重要的作用[9-10]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一個(gè)與Zn2+結(jié)合并具有Ga2+依賴性的蛋白酶家族[11]，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和分化，并在細(xì)胞凋亡、血管生成、組織修復(fù)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]?；|(zhì)金屬蛋白酶15（MMP15）屬于膜錨定MMPs（MT-MMP），可能與功能調(diào)節(jié)或定位相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用[13]。本研究探討YY1促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1資料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251（ATCC），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（Gibco），鏈霉素和青霉素（Gibco），質(zhì)粒pcDNA3.1-HA-YY1、PLKO-shMMP15、PLKO-shYY1均為自己構(gòu)建，轉(zhuǎn)染試劑H4000（英格恩生物公司Engreen Biosystem Co，Ltd.），Trizol試劑（思科捷），逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（碧云天），BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（諾唯贊），MMP15抗體（ABclonal），YY1（Santa Cruz），β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin）抗體（美國(guó)CST公司），二抗（美國(guó)CST公司），ECL試劑盒（雅酶生物）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 kU/L青霉素的DMEM培養(yǎng)液，在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建分子克隆構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-HA-YY1、PLKO-shMMP15、PLKO-shYY1及其相應(yīng)的陰性對(duì)照質(zhì)粒。所用引物及其序列見(jiàn)表1。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染在細(xì)胞培養(yǎng)密度至70%～80%時(shí)用轉(zhuǎn)染試劑H4000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后8 h換液，48 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4基因的過(guò)表達(dá)與敲除在細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%～80%時(shí)使用H4000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的質(zhì)粒pcDNA3.1-HA-YY1轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中使其表達(dá)（過(guò)表達(dá)）；將PLKO-shYY1、PLKO-shMMP15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞使其表達(dá)（相關(guān)基因被敲低），以轉(zhuǎn)染PLKO.1質(zhì)粒作為對(duì)照。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法從細(xì)胞中收集總蛋白，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，然后用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用50 g/L 脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入抗MMP15、YY1、β-actin抗體4 ℃孵育過(guò)夜，然后將膜與相應(yīng)種屬的二抗在室溫共同孵育1 h，最后用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。

1.2.6細(xì)胞計(jì)數(shù)將培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞用胰酶消化，離心，用1 mL DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并吹打混勻，取10 μL細(xì)胞懸液加入90 μL的1×PBS溶液吹打混合均勻，然后加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L。隨后取180 μL細(xì)胞懸液加入涂有基質(zhì)膠的小室中，在下室中加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液600 μL，將小室放入下室中，一起放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨后取出小室擦掉內(nèi)層基質(zhì)膠，1×PBS溶液清洗后用40 g/L多聚甲醛固定1 h，再用結(jié)晶紫染色20 min，最后在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞侵襲能力。

1.2.8細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長(zhǎng)至100%之后，用20 μL槍頭垂直在細(xì)胞表層劃線形成劃痕，隨后用無(wú)菌1×PBS溶液清洗劃下的細(xì)胞，使留下的劃痕肉眼清晰可見(jiàn)，然后更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、48 h時(shí)顯微鏡下拍照并測(cè)量劃痕寬度。

1.2.9平板克隆形成實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后取300個(gè)細(xì)胞接種于含有DMEM培養(yǎng)液的6孔板中，培養(yǎng)10～14 d，直至6孔板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)。倒掉培養(yǎng)液，用1×PBS溶液洗2遍；隨后用40 g/L多聚甲醛固定1 h，1×PBS洗3次；結(jié)晶紫染色20 min，1×PBS溶液洗3次。最后計(jì)數(shù)形成的克隆。

1.2.10實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）用Trizol試劑提取總RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其作為模板行qRT-PCR檢測(cè)MMP15 mRNA表達(dá)。用β-Actin作為內(nèi)參基因，采用比較閾值法進(jìn)行結(jié)果分析，結(jié)果以2-△△CT表示。所用引物及其序列見(jiàn)表2。

1.2.11雙熒光素酶活性檢測(cè)使用JASPER（jaspar.elixir.no）網(wǎng)站預(yù)測(cè)YY1和 MMP15 的啟動(dòng)子之間的結(jié)合位點(diǎn)，將擴(kuò)增的MMP15基因啟動(dòng)子片段插入pGL3-basic載體中以構(gòu)建野生型（WT）質(zhì)粒pMMP15-WT，并將MMP15基因啟動(dòng)子突變序列（CTTGGCAATCTG）插入到pGL3-basic 載體中以構(gòu)建突變型（MUT）質(zhì)粒pMMP15-MUT。再使用H4000將構(gòu)建的野生型質(zhì)粒pMMP15-WT和突變型質(zhì)粒pMMP15-MUT分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染HA-YY1質(zhì)粒并以轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1質(zhì)粒的細(xì)胞作對(duì)照，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后報(bào)告基因的活性，同時(shí)參考海腎螢光素酶活性進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1YY1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，U251、U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染HA-YY1以及shYY1可分別有效過(guò)表達(dá)和敲除YY1（圖1A、B）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U251、U87細(xì)胞過(guò)表達(dá)HA-YY1組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量與未過(guò)表達(dá)HA-YY1的對(duì)照組相比明顯增多（t=13.300、5.847，P<0.05；圖1C）；而敲低細(xì)胞中的YY1后，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量與未敲低YY1的對(duì)照組相比則明顯減少（t=13.970、5.284，P<0.05；圖1D）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HA-YY1后，U251、U87細(xì)胞的遷移速度與未過(guò)表達(dá)HA-YY1的對(duì)照組相比變快（t=9.698、7.215，P<0.05；圖1E）；而敲低YY1后，U251、U87細(xì)胞的遷移速度則明顯變慢（t=7.137、15.220，P<0.05；圖1F）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HA-YY1組形成的細(xì)胞克隆數(shù)量與未過(guò)表達(dá)HA-YY1的對(duì)照組相比較明顯增多（t=5.871、5.095，P<0.05；圖1G）；而YY1敲除組細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯較對(duì)照組減少（t=4.349、8.786，P<0.05；圖1H）。

2.2YY1對(duì)MMP15表達(dá)影響

通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（GTRD數(shù)據(jù)庫(kù)）預(yù)測(cè)出YY1可能的下游靶基因?yàn)镋GFR、Wnt6、BCAT1、ATG4D、MMP15、FKBP3。qRT-PCR方法驗(yàn)證顯示，過(guò)表達(dá)HA-YY1的U251和U87細(xì)胞中MMP15的表達(dá)明顯上調(diào)（t=4.605、3.354，P<0.05；圖2A），而敲除YY1則會(huì)顯著下調(diào)U251和U87細(xì)胞中MMP15 mRNA的表達(dá)（t=12.630、9.235，P<0.05；圖2B）；蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U251和U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1導(dǎo)致MMP15表達(dá)量上升（圖2C），而敲除YY1則會(huì)導(dǎo)致MMP15表達(dá)量下降（圖2D）。

2.3YY1結(jié)合MMP15的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)MP15轉(zhuǎn)錄的影響

雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與同時(shí)轉(zhuǎn)染了pMMP15-MUT質(zhì)粒和HA-YY1質(zhì)粒的對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染了pMMP15-WT質(zhì)粒和HA-YY1質(zhì)粒的細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性有顯著提高（t=14.610、40.490，P<0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4YY1上調(diào)MMP15表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

在U251和U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1的同時(shí)敲低MMP15，蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，YY1明顯過(guò)表達(dá)而MMP15明顯被敲低（圖4A）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HA-YY1而敲低MMP15后穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量較過(guò)表達(dá)HA-YY1而未敲低MMP15組有明顯減少（t=7.279、28.020，P<0.05；圖4B）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HA-YY1而敲低MMP15能夠顯著地抑制細(xì)胞的遷移（t=7.063、5.261，P<0.05；圖4C）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與僅過(guò)表達(dá)HA-YY1組相比較，過(guò)表達(dá)HA-YY1而敲低MMP15組的克隆形成能力明顯減弱（t=3.189、4.461，P<0.05；圖4D）。

3討論

GBM為惡性腦腫瘤，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[14]。目前已經(jīng)有很多關(guān)于膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及影響因素的研究。XU等[15]研究顯示，Slit2/Lobo1信號(hào)能夠通過(guò)Cdc42 GTP的失活抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；CHAO等[16]研究結(jié)果顯示，Sry相關(guān)基因（Sox）家族轉(zhuǎn)錄因子Sox9能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。LI等[17]研究結(jié)果表明，LncRNA有望成為膠質(zhì)瘤治療的生物標(biāo)志物。

YY1為雙功能轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)其啟動(dòng)子環(huán)境、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用蛋白的不同，可以作為激活子、抑制子或啟動(dòng)子結(jié)合蛋白發(fā)揮作用[18]。有研究表明，YY1在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、宮頸癌等癌癥的發(fā)展中主要起促進(jìn)作用[19-22]，在胰腺癌中A：蛋白印跡法檢測(cè)U251及U87細(xì)胞過(guò)表達(dá)HA-YY1轉(zhuǎn)染效率；B：蛋白印跡法檢測(cè)敲低U251及U87細(xì)胞中YY1轉(zhuǎn)染效率；C：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1對(duì)細(xì)胞遷移速率的影響；D：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中敲低YY1對(duì)細(xì)胞遷移速率的影響；E：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1對(duì)細(xì)胞遷移速率的影響；F：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中敲低YY1對(duì)細(xì)胞遷移速率的影響；G：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1對(duì)細(xì)胞遷移速率的影響；H：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中敲低YY1對(duì)細(xì)胞遷移速率的影響。*P<0.05。

A：qRT-PCR檢測(cè)U251和U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1后MMP15 mRNA的表達(dá)；B：qRT-PCR檢測(cè)U251和U87細(xì)胞中敲低YY1后MMP15 mRNA的表達(dá)；C：蛋白印跡法檢測(cè)U251和U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1后MMP15的表達(dá)；D：蛋白印跡法檢測(cè)U251和U87細(xì)胞中敲低YY1后MMP15的表達(dá)。*P<0.05。

A：熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建示意圖，序列為JASPER軟件預(yù)測(cè)YY1與MMP15的結(jié)合位點(diǎn)；B：在U251細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pMMP15野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染HA-YY1質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒為對(duì)照，qRT-PCR檢測(cè)熒光素酶活性；C：在U87細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pMMP15野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染HA-YY1質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒為對(duì)照，qRT-PCR檢測(cè)熒光素酶活性。*P<0.05。

主要起抑制作用[23]，而在乳癌、肺癌等少數(shù)癌癥中既起促進(jìn)的作用又起抑制的作用。目前，對(duì)于YY1促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤發(fā)展作用機(jī)制的研究更多地集中在miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）上，例如miR-218、lncRNA SNHG5、lncRNA SNHG17、lncRNA LINC00466、lncRNA KB-1460A1.5、Circular RNA circ_0001588以及NF-κB家族成員RelB等，都被發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中能夠與YY1發(fā)生相互作用進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[4，14，17，24-25]。而本研究發(fā)現(xiàn)，YY1能夠促進(jìn)MMPs家族成員MMP15的表達(dá)，進(jìn)

A：蛋白印跡檢測(cè)U251及U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1的同時(shí)敲低MMP15轉(zhuǎn)染效率；B：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HA-YY1的同時(shí)敲低MMP15對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；C：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HA-YY1的同時(shí)敲低MMP15對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；D：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HA-YY1的同時(shí)敲低MMP15對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。*P<0.05。

而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。

本研究首先在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87中過(guò)表達(dá)HA-YY1，然后應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HA-YY1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)HA-YY1能夠顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，而敲低YY1會(huì)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，表明YY1通過(guò)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展。那么YY1又是如何促進(jìn)細(xì)胞遷移的呢？本文通過(guò)GTRD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出YY1下游

靶基因?yàn)镋GFR、Wnt6、BCAT1、ATG4D、MMP15、FKBP3，由于MMPs能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和分化[12]，猜測(cè)YY1是通過(guò)調(diào)節(jié)MMP15來(lái)促進(jìn)細(xì)胞

遷移的。于是本研究通過(guò)qRT-PCR方法及蛋白質(zhì)

印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YY1是否會(huì)影響MMP15的表達(dá)，結(jié)果顯示，YY1能夠明顯上調(diào)MMP15的表達(dá)，提示MMP15可能是YY1的下游靶基因；進(jìn)一步研究顯示，YY1能夠作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與MMP15的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合進(jìn)而上調(diào)MMP15的表達(dá)。鑒于YY1既可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移又可以促進(jìn)MMP15表達(dá)，本文接下來(lái)探究MMP15敲低后是否會(huì)抑制YY1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。本文研究在U251和U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HA-YY1的同時(shí)敲低MMP15來(lái)驗(yàn)證YY1是否是通過(guò)調(diào)節(jié)MMP15的表達(dá)來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，結(jié)果顯示，敲低MMP15會(huì)抑制YY1過(guò)表達(dá)引起的促細(xì)胞遷移。

綜上所述，YY1能夠作為轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合到MMP15的啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)而上調(diào)MMP15的表達(dá)，最終促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。本研究發(fā)現(xiàn)了YY1促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的一種新的分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療提供了一個(gè)新的可能的方向。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）