基于轉(zhuǎn)錄組測序的紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定及分析

摘 要： bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量較大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物的生長發(fā)育、次級代謝調(diào)控、激素響應等方面發(fā)揮著重要作用。紅樹莓果實中含有豐富的樹莓酮，為了深入探究bHLH轉(zhuǎn)錄因子在紅樹莓生長發(fā)育及樹莓酮合成過程中的作用，該研究基于‘波爾卡’和‘橙色傳奇’2種紅樹莓果實的轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了紅樹莓bHLH基因家族成員，并對這些基因進行生物信息學分析。結(jié)果表明：（1）紅樹莓果實中共鑒定到95個bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員。（2）紅樹莓的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員多數(shù)為不穩(wěn)定蛋白；超過半數(shù)成員定位于細胞核。（3）bHLH轉(zhuǎn)錄因子N端包含保守的His5-Glu9-Arg13序列，C端包含保守的Leu序列。（4）系統(tǒng)發(fā)育樹將該家族成員分為20個亞家族，其中R亞家族成員最多，有12個。（5）表達模式圖表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子在青果期表達量較高，成熟期表達量較低。該研究結(jié)果為篩選與樹莓酮含量變化一致的bHLH轉(zhuǎn)錄因子提供了依據(jù)，為進一步探究紅樹莓bHLH家族的功能提供了參考。

關鍵詞： 紅樹莓， 轉(zhuǎn)錄組測序， bHLH轉(zhuǎn)錄因子， 基因家族， 樹莓酮

中圖分類號： Q943

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2024）09-1669-09

Identification and analysis of bHLH transcription

factor family in red raspberry based

on transcriptome sequencing

Abstract： bHLH transcription factors are a large family of transcription factors in plants， which play important roles in plant growth and development， secondary metabolism regulation， and hormone response. Red raspberry fruit is rich in raspberry ketone. To investigate the role of bHLH transcription factor in the growth and development of red raspberry and the synthesis of raspberry ketone， members of the red raspberry bHLH gene family were identified and bioinformatics analysis of these genes were performed based on transcriptome sequencing of two red raspberry fruits， ‘Polka’ and ‘Orange Legend’. The results were as follows： （1） A total of 95 bHLH transcription factor family members were identified in red raspberry fruits. （2） Most of the bHLH transcription factor family members were unstable hydrophobic proteins; and more than half of them were localized in the nucleus. （3） bHLH transcription factor N-terminal contained the conserved His5-Glu9-Arg13 sequence and C-terminal contained the conserved Leu sequence. （4） The phylogenetic tree divided the family members into 20 subfamilies， of which the R subfamily had the most members with 12. （5） The expression pattern map indicated that the bHLH transcription factor was expressed at a higher level during the green fruit stage and at a lower level during the ripening stage. The results provide a basis for screening bHLH transcription factors that are consistent with changes in raspberry ketone content and provide a reference for further exploring the function of red raspberry bHLH family.

Key words： red raspberry （Rubus idaeus）， transcriptome sequencing， bHLH transcription factors， gene family， raspberry ketone

bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中僅次于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的第二大家族成員，因含有bHLH結(jié)構(gòu)域而得名（Guo et al.， 2008）。bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域一般由50～60個氨基酸組成，包括N端能與DNA序列順式作用元件結(jié)合的堿性氨基酸區(qū)和C端能形成二聚化的螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)（Atchley et al.， 1997）。bHLH轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于高等植物中，Murre等（1989）首次在動物細胞中發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員，Ludwing等（1989）首次在植物中發(fā)現(xiàn)該家族成員，并表明玉米R基因中bHLH轉(zhuǎn)錄因子能夠參與調(diào)控花青素的生物合成。Liu等（2014）研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達bHLH122能顯著增強植物的抗逆性，使植株表現(xiàn)出較強的抗干旱能力。Xu等（2017）研究發(fā)現(xiàn)MdbHLH33參與調(diào)控蘋果次生代謝物的生物合成。目前，擬南芥中鑒定出162個bHLH轉(zhuǎn)錄因子（Toledo-Ortiz et al.， 2003），水稻中鑒定出167個bHLH轉(zhuǎn)錄因子（Li et al.， 2006），蘋果中鑒定出175個bHLH轉(zhuǎn)錄因子（楊金華，2017）。bHLH轉(zhuǎn)錄因子不僅分布較廣，而且在植物生長發(fā)育的各個階段均發(fā)揮著重要作用，但在紅樹莓中bHLH轉(zhuǎn)錄因子尚未被鑒定。

紅樹莓（Rubus idaeus），又名覆盆子、木莓等，是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）半灌木植物（房琳琳和趙余慶，2014），果實香甜、美味可口。紅樹莓中含有豐富的營養(yǎng)活性成分，如花青素、樹莓酮、鞣花酸、水楊酸和維生素A等，具有較高的營養(yǎng)價值，被譽為“黃金水果”（劉建華等，2004）。紅樹莓不僅被用于鮮食，還被用于加工果酒、果汁等（延海熒等，2018）。紅樹莓中的樹莓酮作為天然抗氧化活性物質(zhì)，因可以很好地分解脂肪而受到人們的廣泛喜愛。此外，樹莓酮在抗癌、抗炎、預防心腦血管和糖尿病等方面也具有很大的應用潛力（王豐和明哲，2010）。孟憲軍等（2012）通過體外消化實驗證明紅樹莓中所含有的樹莓酮具有調(diào)節(jié)高血脂癥大鼠血脂的作用，并且能有效改善高血脂癥低度炎癥狀態(tài)。Park等（2015）研究發(fā)現(xiàn)樹莓酮能促進成熟的脂肪細胞基因轉(zhuǎn)錄，表明樹莓酮能促進脂解和氧化途徑。

本課題組前期通過高效液相色譜已經(jīng)探究了2種紅樹莓不同果期的樹莓酮含量，為了深入挖掘紅樹莓中與樹莓酮調(diào)控相關的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，本研究以紅樹莓果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為依據(jù)，以擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子為參照，采用生物信息學手段，通過對理化性質(zhì)、亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)基序以及表達模式進行分析，擬探討以下問題：（1）紅樹莓果實中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員數(shù)量；（2）bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)基序、系統(tǒng)進化和表達模式等；（3）篩選與紅樹莓中樹莓酮合成相關的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。本研究旨在篩選紅樹莓中與樹莓酮調(diào)控相關的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，以期為進一步研究bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 紅樹莓果實實驗材料

用于轉(zhuǎn)錄組測序的2種紅樹莓‘波爾卡’和‘橙色傳奇’果實均由中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所董鳳祥教授提供。選擇‘波爾卡’‘橙色傳奇’青果（BEK-qing和CSCQ-qing，15 d）、成熟果（BEK-hong和CSCQ-hong，34 d）為材料（閆?；玫?，2020）。摘取大小相似、無病蟲害的果實，每個時期摘取15顆果實，放入蒸餾水中浸泡1 min，將果實泥土、污漬沖洗干凈，用濾紙擦干，錫紙包好放入液氮中速凍，部分樣品放于超低溫冰箱中-80 ℃保存。

1.2 紅樹莓果實RNA的提取、質(zhì)量檢測

采用艾德萊植物總RNA提取試劑盒（RN53）提取紅樹莓果實總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用Nanodrop-2000微量紫外分光光度計定量檢測RNA樣品的濃度和純度。

1.3 紅樹莓果實轉(zhuǎn)錄組測序和組裝

合格樣品交由百邁客公司進行Illumina HiSeq高通量測序。以黑莓基因組為參考基因（https：//www.rosaceae.org/species/rubus_occidentalis/genome_v1.1）。過濾原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的序列之后使用軟件TopHat2將測序reads比對到參考基因組上。基于各樣品Reads與參考序列的TopHat2比對結(jié)果，使用軟件Cufflinks進行轉(zhuǎn)錄本的拼接和表達定量。

1.4 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定

以擬南芥的bHLH蛋白序列為參考序列，利用TBtools軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的所有蛋白序列進行搜索，去除重復序列后，篩選E-value≤1×10-5的序列為候選蛋白。同時利用PlantTFDB數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.gao-lab.org/）、NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Batch CD-Search工具和SMART數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對候選基因編碼蛋白進行結(jié)構(gòu)域預測，去除不含bHLH結(jié)構(gòu)域及重復的序列。最終確定可靠的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子下載于擬南芥數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopisis.org）。

1.5 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的理化性質(zhì)和亞細胞定位分析

利用在線軟件Expasy（http：//web.expasy.org/protparam）分析紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基本理化性。利用在線軟件ProtComp v9.0（http：//linux.softberry.com）對紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族亞細胞進行定位分析。利用在線軟件SOPMA（http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_sopma.html）分析紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)。利用在線軟件SignalP 5.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的信號肽。

1.6 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)基序分析

利用Clustal X軟件對紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白進行多序列比對，比對之后的保守結(jié)構(gòu)域用WebLogo 3（http：//weblogo.three-plusone.com/）進行繪圖。利用MEME在線程序（http：//memesuite.org/tools/meme）對紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守基序進行分析。

1.7 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用MEGA-X軟件并運用Neighbor-Joining鄰接法對紅樹莓和擬南芥的bHLH轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值設為1 000。

1.8 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族表達模式的分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件的log2（FPKM+1）計算并繪制紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的拼接和組裝

使用百邁克Illumina HiSeq高通量測序平臺對‘波爾卡’和‘橙色傳奇’2種紅樹莓果實的不同時期進行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)過嚴格的測序質(zhì)量控制，共獲得86.95 Gb Clean Data，各樣品的Q20堿基百分比均大于97.78%，各樣品的Q30堿基百分比均不小于94.02%。GC含量為46.42%～47.74%，說明測序質(zhì)量較高，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析（表1）。

以黑莓作為參考基因組，紅樹莓轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)匹配到參考基因組數(shù)據(jù)庫的比例為81.47%～86.16%，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可用于后續(xù)基因分析（表1）。

2.2 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的篩選和理化性質(zhì)分析

經(jīng)過綜合比對， 在紅樹莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到95個bHLH轉(zhuǎn)錄因子， 分別命名為RinbHLH1-RinbHLH95。根據(jù)Expasy預測顯示，紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白序列相差較大，蛋白質(zhì)數(shù)目位于82 bp（RinbHLH65）～1 238 bp（RinbHLH84）之間；相對分子質(zhì)量介于9 kDa（RinbHLH65）～137 kDa（RinbHLH84）之間；等電點大于7的蛋白有29個，大多數(shù)紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子呈弱酸性，能與堿性物質(zhì)結(jié)合；不穩(wěn)定指數(shù)為36.39～91.23，平均集中在55，說明紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白較不穩(wěn)定；脂肪系數(shù)大多集中于70左右；總平均疏水性均為負值，表明紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白均為親水性蛋白，并且RinbHLH7的親水性最好，為-0.849。

利用在線軟件SOPMA分析紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)多為α-螺旋和無規(guī)卷曲。其中，77個bHLH轉(zhuǎn)錄因子中無規(guī)卷曲所占的比例最大，16個bHLH轉(zhuǎn)錄因子中α-螺旋所占的比例最大。

利用在線軟件ProtComp v9.0分析紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的亞細胞定位，預測結(jié)果顯示，超過半數(shù)的轉(zhuǎn)錄因子位于細胞核，僅有2個轉(zhuǎn)錄因子位于細胞質(zhì)中。利用在線軟件SignalP 5.0 Server 預測紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的信號肽，結(jié)果顯示95個bHLH轉(zhuǎn)錄因子均不含信號肽。

2.3 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)基序分析

利用Clustal X軟件對紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白進行多序列比對，并用WebLogo 3進行作圖（圖1）。由圖1可知，紅樹莓的bHLH保守結(jié)構(gòu)域由50～60個氨基酸組成，含有N端的堿性保守區(qū)和C端的螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)。大部分bHLH轉(zhuǎn)錄因子在N端含有保守的His5-Glu9-Arg13序列，該區(qū)域?qū)HLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA上游啟動子區(qū)域至關重要，尤其是其中的Glu位點，用于與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的大溝結(jié)合（Garcia-Seco et al.，2015）。紅樹莓中有78個成員含有Glu9-Arg13位點，可識別并與DNA啟動子區(qū)的E-box（5′-CANNTG-3′）序列結(jié)合， 有58個成員含有His5-Glu9-Arg13序列，可以特異識別并與G-box（5′-CACCTG-3′）結(jié)合，有8個成員不含有Glu和Arg序列，無法與DNA序列相結(jié)合（Hytoneo et al.，2018）。C端的23位和54位的2個亮氨酸（Leu）高度保守，23位的亮氨酸保守性為99%，僅有1個bHLH轉(zhuǎn)錄因子（RinbHLH91）的23位為丙氨酸， 該序列對于同源和異源二聚化的形成必不可少。

利用MEME在線軟件對紅樹莓的95個bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員進行基序分析，并用TBtools軟件進行可視化 （圖2）。用不同的顏色表示紅樹莓bHLH家族中10種基序。其中，Motif 1（HSLAERRRREKINERLKALQSLVPNGSKM）和Motif 2 （DKASMLDAIEYVKELQKQVQ）是紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守基序，所有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子同時含有Motif 1和Motif 2，RinbHLH8/95/40所含有的基序最多（7個），RinbHLH92僅含有1個基序。

2.4 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子不同發(fā)育時期表達模式分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件對‘波爾卡’‘橙色傳奇’這2種紅樹莓果實的青果和成熟果的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行了表達模式分析。結(jié)果表明，95個bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達量大多是青果期高于成熟期。RinbHLH71、RinbHLH84、RinbHLH91、RinbHLH4、RinbHLH14、RinbHLH18、RinbHLH21、RinbHLH33、RinbHLH34、RinbHLH60、RinbHLH63、RinbHLH65、RinbHLH70這13個轉(zhuǎn)錄因子在2個紅樹莓品種的2個時期均不表達，推測這些轉(zhuǎn)錄因子與樹莓果實的生長發(fā)育關系較小。RinbHLH75、RinbHLH73、RinbHLH72、RinbHLH7、RinbHLH36、RinbHLH20、RinbHLH86、RinbHLH55這8個bHLH轉(zhuǎn)錄因子在‘波爾卡’紅樹莓中表達量較低，在‘橙色傳奇’紅樹莓青果時期表達量較高，成熟期表達量顯著下降。在‘波爾卡’紅樹莓中RinbHLH81、RinbHLH6、RinbHLH17、RinbHLH82在青果期表達量較高，成熟期表達量明顯降低。與擬南芥花青素合成有關聚為同一支的紅樹莓RinbHLH50、RinbHLH51、RinbHLH58，均是青果期表達量顯著高于成熟期（圖3）。

2.5 紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用MEGA-X軟件對95個紅樹莓和153個擬南芥的bHLH轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，紅樹莓中95個bHLH轉(zhuǎn)錄因子被分為20個亞家族，其中R家族的成員最多，含有12個成員。K、C、D亞家族成員最少，僅含有1個成員，此外，U家族沒有聚類到紅樹莓轉(zhuǎn)錄因子家族成員，只有擬南芥家族成員。推測是由于紅樹莓這一物種在進化過程中出現(xiàn)了基因缺失現(xiàn)象。根據(jù)聚類結(jié)果可知，氨基酸數(shù)量相似、功能相關的轉(zhuǎn)錄因子聚集在一起且同一分支的家族成員含有數(shù)量和結(jié)構(gòu)相同的基序（圖4）。

3 討論與結(jié)論

隨著測序技術的逐漸成熟，轉(zhuǎn)錄組測序技術日益成為挖掘功能基因的常用手段?；谇捌趯嶒灒狙芯坎捎肐llumina HiSeq高通量測序平臺對‘波爾卡’和‘橙色傳奇’2種紅樹莓果實的不同時期進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了86.95 Gb Clean Data。經(jīng)組裝后獲得24 213個單基因。bHLH、 bZIP和MYB轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)被證實參與植物次生代謝物的合成（Nakata et al.， 2013）。近年來，隨著植物基因組測序的不斷完善，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員已經(jīng)在諸多模式生物中研究得較為透徹，但在其他物種中研究較少。

本研究共鑒定到95個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，該家族蛋白均不穩(wěn)定，等電點大多小于7，這與擬南芥（Toledo-Ortiz et al.， 2003）、水稻（Li et al.， 2006）的bHLH轉(zhuǎn)錄因子性質(zhì)相似。大多數(shù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子位于細胞核，可能是核定位信號將其定位于細胞核中，進一步激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄水平從而發(fā)揮功能。這與黑果枸杞的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族亞細胞定位結(jié)果相同（劉靜等，2020）。

轉(zhuǎn)錄因子通過轉(zhuǎn)錄水平與相關基因啟動子區(qū)結(jié)合進而調(diào)控基因的表達。bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域存在N端保守的His5-Glu9-Arg13序列區(qū)和C端高度保守的Leu序列區(qū)。N端保守的序列區(qū)可與DNA啟動子區(qū)的E-box或者G-box結(jié)合，起到調(diào)控作用。Leu區(qū)大多與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，形成同源或異源二聚化蛋白復合體。據(jù)報道，同樣的結(jié)果也在銀杏（馮磊等，2019）、白菜（唐文武等，2020）、草莓（鄭玲等，2022）等物種中發(fā)現(xiàn)。以上表明這2個保守區(qū)對于bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合特定的DNA序列至關重要。

根據(jù)bHLH結(jié)構(gòu)域特征，以擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族作為參考（Nakata et al.， 2013），可將紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為20個亞家族，其中R是最大的亞家族，包含12個成員。通過聚類分析可以初步判斷紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能。紅樹莓RinbHLH31、RinbHLH45、RinbHLH27與擬南芥AT1G03040、AT4G02590聚為同一支，推測其與植物非生物脅迫，與抗鹽、抗旱等有重要關系（Liu et al.， 2014），紅樹莓RinbHLH90、RinbHLH91、RinbHLH34與擬南芥AT5G37800、AT1G66470進化關系較近，推測其與植物根毛生長發(fā)育、伸長有關（Nesi et al.， 2000）。RinbHLH58、RinbHLH50、RinbHLH51和擬南芥AT1G63650、AT5G41315、AT4G09820聚為同一支，推測其參與植物花青素的生物合成（Qi et al.， 2014）。‘波爾卡’和‘橙色傳奇’這2個品種紅樹莓的bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達量大多是青果期高于成熟期，表明紅樹莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控樹莓酮的合成并非是在成熟期。RinbHLH75、RinbHLH73、RinbHLH72、RinbHLH7、RinbHLH36、RinbHLH20、RinbHLH86、RinbHLH55這8個bHLH轉(zhuǎn)錄因子在‘波爾卡’紅樹莓中表達量較低，在‘橙色傳奇’紅樹莓青果時期表達量較高，成熟期表達量顯著下降，猜測這些基因可能與‘橙色傳奇’紅樹莓果實獨特的黃色有關。此外，這2種紅樹莓青果期表達量較高的基因并不相同，說明調(diào)控紅樹莓不同顏色的基因有多個，不僅僅是單個基因的作用。這些基因可能是造成紅樹莓品種顏色差異的一大原因。

樹莓酮與花青素同來源于植物苯丙烷代謝途徑，調(diào)控花青素的轉(zhuǎn)錄因子很大程度上會調(diào)控樹莓酮的生物合成。RinbHLH58、RinbHLH50、RinbHLH51不僅聚類到花青素一支，而且在青果期和成熟果期表達量差異顯著。因此，篩選RinbHLH58、RinbHLH50、RinbHLH51候選為與樹莓酮調(diào)控相關的轉(zhuǎn)錄因子。后續(xù)將對其進行功能研究。

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