PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

摘 要：食品中的微生物污染是影響食品安全的重要因素之一。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)具有靈敏、快速等特點(diǎn)，屬于一種特異檢測(cè)方法，被廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)。本文闡述PCR技術(shù)的特點(diǎn)及其在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用，探討當(dāng)前PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中存在的主要問(wèn)題，以期為PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供借鑒。

關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；食品微生物檢測(cè)；應(yīng)用

Research Progress on the Application of PCR Technology in Food Microbial Detection

YIN Juxiang

（Wuwei City Center for Disease Control and Prevention， Wuwei 733000， China）

Abstract： Microbial contamination in food is one of the important factors affecting food safety. The polymerase chain reaction （PCR） is a specific detection method with the characteristics of sensitivity and speed， and is widely used in the detection of food microorganisms. This paper describes the characteristics of PCR technology， the application of PCR technology in food microbial detection， and discusses the main problems existing in the current PCR technology in food microbial detection， in order to provide reference for the application of PCR technology in the field of food microbial detection.

Keywords： PCR technology; food microbial detection; application

食品作為人們生存和發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，事關(guān)人們的身體健康及生命安全，而微生物污染是食源性疾病的重要原因之一。因此，對(duì)食品開(kāi)展快速、準(zhǔn)確的微生物檢測(cè)至關(guān)重要。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法如培養(yǎng)法、生化鑒定法等，雖然具有一定的準(zhǔn)確性，但存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作煩瑣、靈敏度低等缺點(diǎn)[1]。PCR是一種分子生物學(xué)技術(shù)，具有靈敏、快速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)。

1 PCR技術(shù)的特點(diǎn)

1.1 高靈敏度

PCR技術(shù)能對(duì)極微量的微生物DNA進(jìn)行檢測(cè)和分析，可將皮克量級(jí)擴(kuò)增到微克水平，能夠從大量的食品樣本中檢測(cè)出痕量的特定微生物，這對(duì)于檢測(cè)那些含量極低但可能對(duì)食品安全構(gòu)成威脅的微生物極其重要[2]。

1.2 高特異性

PCR技術(shù)遵循堿基配對(duì)原則，以引物與模板DNA特異性結(jié)合、Taq聚合酶合成反應(yīng)及靶基因的保守性與特異性為基準(zhǔn)，特異性強(qiáng)，堿基錯(cuò)配率低。PCR技術(shù)通過(guò)選擇特異性的引物，能精準(zhǔn)地?cái)U(kuò)增目標(biāo)微生物的特定DNA片段，從而準(zhǔn)確識(shí)別出目標(biāo)微生物，有效避免對(duì)其他非目標(biāo)微生物的誤檢[3]。

1.3 快速且簡(jiǎn)便

PCR技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)便，只需要一次性將反應(yīng)液加好后，就可以進(jìn)行擴(kuò)增，一般在數(shù)小時(shí)（通常2～4 h）內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測(cè)方法相比，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，能夠及時(shí)為食品生產(chǎn)、加工、流通等環(huán)節(jié)提供檢測(cè)結(jié)果，有助于快速采取相應(yīng)的措施。

1.4 對(duì)樣品要求較低且重現(xiàn)性較好

PCR技術(shù)不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)等復(fù)雜的前處理步驟，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板，能夠適應(yīng)各種不同類型的食品樣本。同時(shí)，只要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑濃度等，PCR反應(yīng)具有較好的重現(xiàn)性，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性，這對(duì)于大規(guī)模的食品微生物檢測(cè)以及不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的比較和驗(yàn)證非常重要。

1.5 可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等可以對(duì)微生物的DNA進(jìn)行定量分析，能夠確定食品中微生物的數(shù)量，為評(píng)估食品微生物污染的程度提供更精確的數(shù)據(jù)，對(duì)于判斷食品的安全性和質(zhì)量具有重要意義[4]。

1.6 適用范圍較廣，可同時(shí)檢測(cè)多種微生物

PCR技術(shù)可檢測(cè)多種食品中的微生物，如細(xì)菌、病毒、真菌等，并且針對(duì)不同的微生物可以設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行特異性檢測(cè)。此外，借助多重PCR技術(shù)，將多對(duì)引物加入同一反應(yīng)體系，可以擴(kuò)增出多條微生物核酸片段，實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)微生物的同時(shí)檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間，降低了成本，提高了檢測(cè)效率。

2 PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 細(xì)菌檢測(cè)

食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因之一，如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等，而PCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)這些致病菌，為食品安全監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。艾鵬飛等[5]針對(duì)傳統(tǒng)食源性細(xì)菌檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)、靈敏度較低等問(wèn)題，以單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7、蠟樣芽孢桿菌為研究對(duì)象，通過(guò)實(shí)驗(yàn)成功建立了同時(shí)檢測(cè)以上3種細(xì)菌的TaqMan多重實(shí)時(shí)定量PCR方法。該方法通過(guò)對(duì)單增李斯特菌mpl基因、大腸桿菌O157：H7 tir基因、蠟樣芽孢桿菌entFM基因的保守序列分別設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，并在建立的多重qPCR反應(yīng)體系下，實(shí)現(xiàn)對(duì)3種細(xì)菌的特異性檢測(cè)，最低檢出限可低至12 CFU·mL-1，陽(yáng)性檢出率為100%，檢測(cè)周期為6 h，可實(shí)現(xiàn)大批量樣品快速檢測(cè)。劉艷等[6]針對(duì)包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測(cè)周期長(zhǎng)、準(zhǔn)確性較低等問(wèn)題，建立了針對(duì)包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速定量檢測(cè)的ddPCR方法。該方法的檢出限為10 CFU·mL-1，靈敏度較好，能夠滿足包裝飲用水中銅綠假單胞菌的實(shí)際檢測(cè)需求。

2.2 病毒檢測(cè)

一些病毒如諾如病毒、甲型肝炎病毒等，具有高度傳染性、快速傳播性等特點(diǎn)，能夠通過(guò)食品、水等媒介對(duì)人們的健康造成嚴(yán)重危害。利用PCR技術(shù)可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)這些致病性病毒，為食品安全監(jiān)管、疾病防控提供重要的技術(shù)支持。陳波等[7]成功建立了檢測(cè)諾如病毒的TaqMan熒光定量PCR方法。研究結(jié)果顯示，40 min內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果，方法的靈敏度較高，最低檢測(cè)限為1.2 copies·μL-1，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于低濃度樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)，避免了假陰性樣品的出現(xiàn)。經(jīng)數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后進(jìn)一步表明該方法的可行性和科學(xué)性，為準(zhǔn)確檢測(cè)諾如病毒及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了有效的技術(shù)支持。嚴(yán)禮等[8]為準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)豬肉及其制品中非洲豬瘟病毒，針對(duì)非洲豬瘟病毒核酸的VP72和K205基因設(shè)計(jì)并合成3對(duì)引物及探針，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，最終建立了非洲豬瘟病毒微滴數(shù)字PCR的檢測(cè)方法。該方法可有效減少與豬肉中其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較高的特異性，有助于在豬肉及其肉制品加工生產(chǎn)過(guò)程中及時(shí)發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒，防范食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 真菌檢測(cè)

食品中存在的產(chǎn)毒真菌，一旦被人體攝入，可能會(huì)引起急性中毒反應(yīng)。同時(shí)，長(zhǎng)期低劑量攝入產(chǎn)毒真菌污染的食物，可導(dǎo)致慢性中毒，會(huì)對(duì)人體多個(gè)器官系統(tǒng)造成損害，尤其是肝臟和腎臟。因此，加強(qiáng)食品中真菌檢測(cè)，對(duì)于有效預(yù)防急性和慢性中毒事件發(fā)生十分必要。馮優(yōu)妍等[9]為了實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)糧食中的主要霉菌（寄生曲霉、黃曲霉），通過(guò)設(shè)計(jì)TaqMan?實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)引物及探針，對(duì)RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了糧食中黃曲霉、寄生曲霉的RT-PCR檢測(cè)方法。此方法具有較強(qiáng)的特異性，且通過(guò)10種霉菌模擬污染糧食模型驗(yàn)證，無(wú)假陽(yáng)性現(xiàn)象出現(xiàn)；最低檢測(cè)濃度可低至0.01 ng·μL-1，靈敏度高于普通PCR方法，可應(yīng)用于早期糧食霉變篩查，有效防止霉變糧食大面積污染，為保障我國(guó)糧食質(zhì)量安全提供了技術(shù)支撐。張慶等[10]使用多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，建立了4種產(chǎn)毒真菌檢測(cè)體系，可在2 h內(nèi)進(jìn)行快速檢測(cè)，對(duì)青霉的最低檢出限為1.53×104 拷貝/反應(yīng)，對(duì)產(chǎn)黃曲霉毒素的最低檢出限為3.37×104 拷貝/反應(yīng)，對(duì)鐮刀菌的最低檢出限為3.95×104 拷貝/反應(yīng)，對(duì)赭曲霉的最低檢出限為1.91×104 拷貝/反應(yīng)。該方法具有高靈敏度和強(qiáng)特異性的特點(diǎn)，可滿足大批量檢測(cè)需求，為及時(shí)發(fā)現(xiàn)食品中此類產(chǎn)毒真菌的存在提供了鑒別方法。

3 當(dāng)前PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中存在的主要問(wèn)題

3.1 假陽(yáng)性問(wèn)題

3.1.1 污染導(dǎo)致假陽(yáng)性

在PCR檢測(cè)過(guò)程中，極微量的污染就可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，如實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的氣溶膠污染、操作過(guò)程中樣本間的交叉污染等。如果實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)系統(tǒng)不完善，或者操作人員未能嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，則容易使空氣中的污染物進(jìn)入反應(yīng)體系，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象。同時(shí)，試劑污染也是常見(jiàn)的導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的原因之一。PCR試劑中的各種成分，如引物、酶等，如果在生產(chǎn)或儲(chǔ)存過(guò)程中受到污染，也可能在檢測(cè)中引入外源DNA，進(jìn)而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。

3.1.2 引物設(shè)計(jì)不合理導(dǎo)致假陽(yáng)性

引物的特異性較低也是產(chǎn)生假陽(yáng)性的重要因素之一。如果引物與非目標(biāo)微生物的DNA序列有一定相似性，就可能在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增出非目標(biāo)產(chǎn)物，造成假陽(yáng)性。例如，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，如果沒(méi)有充分考慮到食品中可能存在的其他微生物的基因組序列，易導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。

3.2 假陰性問(wèn)題

3.2.1 樣本中抑制物的存在

食品樣本中可能存在各種抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、酚類和重金屬離子等。這些抑制物可能與PCR反應(yīng)中的酶、引物或模板DNA結(jié)合，從而影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，不同的食品基質(zhì)對(duì)PCR的抑制程度也不同。例如，肉類、奶制品等高蛋白食品中的蛋白質(zhì)可能會(huì)與酶結(jié)合，抑制酶的活性；而植物性食品中的多糖可能會(huì)干擾DNA的提取和純化過(guò)程。

3.2.2 目標(biāo)微生物數(shù)量過(guò)少

如果食品中的目標(biāo)微生物數(shù)量極少，可能低于PCR檢測(cè)靈敏度的下限，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。在實(shí)際檢測(cè)中，由于食品加工、儲(chǔ)存等過(guò)程中目標(biāo)微生物在食品中分布不均勻，可能使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

3.3 定量問(wèn)題

PCR技術(shù)雖然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的DNA片段的擴(kuò)增，但不能直接對(duì)微生物的數(shù)量進(jìn)行定量。目前，常用的定量方法如實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)雖然可實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的相對(duì)定量，但仍然存在一定程度的誤差。

3.4 技術(shù)要求高

PCR技術(shù)需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員進(jìn)行操作。操作人員需經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，熟悉PCR反應(yīng)的原理、操作步驟和注意事項(xiàng)，否則容易出現(xiàn)操作失誤，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如，在DNA提取、引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件優(yōu)化等環(huán)節(jié)，都需要一定的專業(yè)知識(shí)和技能。此外，PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的要求相對(duì)較高。PCR實(shí)驗(yàn)室需嚴(yán)格分區(qū)，避免交叉污染。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室的溫度、濕度等環(huán)境條件也需嚴(yán)格控制，以確保PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性[11]。

3.5 成本較高

PCR檢測(cè)需要使用昂貴的儀器設(shè)備和試劑，如PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、引物、酶等。這些設(shè)備和試劑的成本相對(duì)較高，因此PCR檢測(cè)費(fèi)用較普通檢測(cè)方法也較高，造成該技術(shù)未能全面得到應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著分子生物技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用前景十分廣泛。未來(lái)，研究人員還應(yīng)加快優(yōu)化PCR技術(shù)，提高食品微生物檢測(cè)的科學(xué)性、準(zhǔn)確性、規(guī)范性，降低成本，提高效率，為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)保障。

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作者簡(jiǎn)介：銀菊香（1980—），女，甘肅古浪人，本科，主管檢驗(yàn)師。研究方向：微生物檢驗(yàn)。