GC-MS法快速測定淡水魚中丁香酚類化合物的殘留

摘 要：目的：建立一種基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）快速、大批量檢測淡水魚中丁香酚類化合物的方法。對采集的200批次淡水魚樣品（包括黑魚、鱸魚、鯽魚等16個品種）中的丁香酚類化合物殘留進行測定與分析。方法：優(yōu)化樣品前處理方法和氣相色譜條件。結(jié)果：6種丁香酚類化合物在0.02～0.20 mg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999；6種丁香酚類化合物回收率為82.4%～106.0%，相對標準偏差（n=6）為1.6%～9.2%；在200批次淡水魚樣品丁香酚類化合物殘留檢測中，鰱魚、鱸魚、草魚的檢出率較高，均大于50%。結(jié)論：該方法操作簡單、回收率高，可滿足對大批量水產(chǎn)品中丁香酚類化合物的定性檢測和定量分析要求，為水產(chǎn)行業(yè)可持續(xù)發(fā)展和食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品；丁香酚；狀況分析；氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

Rapid Determination of Eugenol Residues in Freshwater Fish by GC-MS

WEI Qinfang， HU Wenbin， LYU Xuhong， ZHU Jinyu， XING Feng*

（Zhejiang Fangyuan Testing Group Co.， Ltd.， Hangzhou 310018， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid and large-scale detection method for eugenol compounds in freshwater fish based on gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Determination and analysis of residual eugenol compounds in 200 batches of freshwater fish samples collected， including 16 species such as black fish， sea bass， and crucian carp. Method： Optimize sample pretreatment methods and gas chromatography conditions. Result： The six eugenol compounds showed a good linear relationship between 0.02 and 0.20 mg·L-1， with correlation coefficients r2 greater than 0.999; the recovery rates of six eugenol compounds ranged from 82.4% to 106.0%， with relative standard deviations （n=6） of 1.6% to 9.2%; in the detection of residual eugenol compounds in 200 batches of freshwater fish samples， the detection rates of silver carp， sea bass， and grass carp were relatively high， all exceeding 50%. Conclusion： This method is simple to operate， has high recovery rate， can meet the requirements for qualitative detection and quantitative analysis of eugenol compounds in large quantities of aquatic products， it provides technical support for the sustainable development of the aquatic industry and food safety supervision.

Keywords： aquatic products; eugenol; condition analysis; gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

丁香酚因具有成本低廉和麻醉效果好等優(yōu)勢，在漁業(yè)中被廣泛用作麻醉劑[1]。丁香酚能夠有效減輕水生動物在搬運過程中的應(yīng)激反應(yīng)，減少其在運輸途中的損傷風險，從而顯著提高水生動物的生存率。因此在國外被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖與運輸領(lǐng)域[2-3]。然而，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)在2017年將丁香酚分類為第三類致癌物質(zhì)，這意味著它被認為具有致癌性、致突變性、致敏性等潛在風險[4-5]。國際上，美國、加拿大等北美國家不允許使用丁香酚；新西蘭、日本等國家允許限量使用丁香酚，且日本規(guī)定了最大殘留限量為0.05 mg·kg-1。在我國，關(guān)于丁香酚在水產(chǎn)品中使用的研究相對較少，缺少完善的政策法規(guī)和標準，也未規(guī)定明確的參考限量，這種情況給水產(chǎn)品中丁香酚的使用帶來了一定的不確定性和挑戰(zhàn)[6-10]。目前，針對丁香酚類化合物的檢測分析技術(shù)主要包括氣相色譜技術(shù)[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等，其中，GC-MS法具有操作簡單、精確度和靈敏度較高等優(yōu)點[14]。食品補充檢驗方法《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測定》（BJS 201908）中有對丁香酚類化合物的前處理方法，但該操作復(fù)雜費時，且回收率較低。

為了深入了解淡水魚中丁香酚的殘留量情況，加強對市售淡水魚的食品安全監(jiān)管[15]。本研究建立了一種氣相色譜-質(zhì)譜法檢測淡水魚中丁香酚類化合物殘留量的方法，為水產(chǎn)行業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及食品安全的管理工作提出參考性意見[16-17]。

1 材料與方法

1.1 試劑

丁香酚（CAS號：97-53-0）、異丁香酚（CAS號：97-54-1）、甲基丁香酚（CAS號：93-15-2）、甲基異丁香酚（CAS號：93-16-3）、乙?；惗∠惴樱–AS號：93-29-8）和乙酸丁香酚酯（CAS號：93-28-7）標準品（純度均≥97%），上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆灰译妫ㄉV純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；氯化鈉、無水Na2SO4，均為分析純，國藥集團；實驗用水（超純水）。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；KQ3200DV超聲波提取儀，昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX GENIUS 3渦旋混勻器，德國IKA公司；JA3003電子天平（0.001 g），上海舜宇恒平儀器有限公司；HP-5MS UI色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國安捷倫科技有限公司。

1.3 樣品采集

基于水產(chǎn)養(yǎng)殖習慣和產(chǎn)品流通特性，本研究對水產(chǎn)品在餐飲服務(wù)及流通領(lǐng)域的狀況進行了全面調(diào)研。調(diào)研范圍涵蓋了11個地級區(qū)域的大小型餐館、批發(fā)及零售市場、綜合性超市、傳統(tǒng)農(nóng)貿(mào)集市、小型食品雜貨店以及網(wǎng)絡(luò)購物平臺等眾多銷售渠道。本次調(diào)查共采集了200份淡水魚類樣本，涉及16個不同品種。樣品采集完成后，立即送往實驗室進行預(yù)處理并冷藏保存。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準溶液配制

丁香酚類化合物標準儲備溶液：精確量取6種丁香酚類化合物標準樣品各10.0 mg，用乙腈溶劑溶解，并定容至100 mL，制備得100.0 mg·L-1標準儲備液。分別吸取丁香酚、異丁香酚、甲基丁香酚、甲基異丁香酚、乙?；惗∠惴?、乙酸丁香酚酯各1.0 mL標準溶液儲備液，用乙腈稀釋配制成1.0 mg·L-1標準溶液混合中間液。

混合標準工作液：分別吸取標準溶液混合中間液40 μL、80 μL、200 μL、300 μL、400 μL，用鯽魚空白基質(zhì)液稀釋配制成0.02 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.15 mg·L-1、0.20 mg·L-1的混合標準工作液。

1.4.2 樣品前處理

準確取2 g樣品置于50 mL的離心管中，加入20 mL乙腈，4 g氯化鈉，5 g無水硫酸鎂，用均質(zhì)器勻漿。以5 000 r·min-1離心3 min，取上清液，加入5 mL用乙腈飽和的正己烷，渦旋混勻。再以5 000 r·min-1離心3 min，棄去上層正己烷溶液。將乙腈層于40 ℃氮吹，用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，過0.45 μm微孔濾膜，待上機檢測。

1.4.3 儀器條件

氣相條件：進樣口溫度：250 ℃；取樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；溫度程序：起始60 ℃維持1 min，以40 ℃·min-1的速率上升至180 ℃，以20 ℃·min-1的速度升至260 ℃。質(zhì)譜條件：離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電子轟擊源能量：70 eV；溶劑延遲時間：5 min。6種丁香酚類化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Word 2007、Excel 2007、Photoshop CC2017軟件對本研究數(shù)據(jù)進行繪圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

參考《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測定》（BJS 201908）中儀器條件，對氣相條件進行優(yōu)化。如圖1所示，通過優(yōu)化初始溫度和升溫速率，6種丁香酚類化合物可以達到良好的分離效果且分析時間較短。

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

由于丁香酚類化合物溶于有機溶劑，本研究分別考察了乙腈、丙酮、乙酸乙酯和乙醇4種提取溶劑對丁香酚類化合物回收率的影響。如圖2所示，提取溶劑為乙醇時，丁香酚類化合物的回收率最低；當提取溶劑為乙酸乙酯時，6種丁香酚類化合物的回收率在66.4%～70.5%，提取效果較差；而在采用乙腈和丙酮作為提取溶劑時，6種丁香酚化合物的回收率均大于80%。相較于丙酮處理的樣本，使用乙腈所得樣本中的雜質(zhì)含量較低。因此，本研究選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 提取過程的優(yōu)化

本實驗將樣品以15 000 r·min-1勻漿2 min后進行提取，并與BJS 201908標準中的提取方法進行回收率比較實驗。由圖3可知，相較于優(yōu)化前，優(yōu)化樣品提取過程后，6種丁香酚類化合物回收率較高，穩(wěn)定性較好。其主要原因是優(yōu)化后的提取方法可以保證樣品充分浸潤和混勻，以縮短提取時間，并提升提取效果。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

采用優(yōu)化后的儀器條件，將1.4.1配制的混合標準工作液上機測定。以目標物的質(zhì)量濃度（mg·L-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。由表2可知，6種丁香酚化合物在0.02～0.20 mg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999；6種丁香酚化合物的檢出限為0.01 mg·kg-1，滿足丁香酚類化合物檢測要求。

2.5 方法的回收率和精密度

對鯽魚樣品進行加標（加標水平為0.01 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1）回收實驗，每個濃度平行測定6次。由表3可知，6種丁香酚化合物的回收率為82.4%～106.0%，相對標準偏差均小于10%，表明此方法準確度和回收率高，重復(fù)性好。

2.6 實際樣品測定

按照本研究優(yōu)化方法對采集的200批次淡水魚產(chǎn)品（包括魚、鱸魚、鯽魚等16個品種）進行丁香酚化合物殘留檢測分析。由表4可知，60批次水產(chǎn)品中檢出丁香酚化合物，檢出率為30.00%，其中，鰱魚、鱸魚、草魚、大頭魚、鳊魚、包頭魚、黑魚和鯽魚中均有丁香酚類化合物檢出，鰱魚、鱸魚、草魚的檢出率較高，分別為80.00%、72.41%和55.56%。表明淡水魚中存在較為嚴重的丁香酚化合物殘留問題，相關(guān)監(jiān)測機構(gòu)應(yīng)加強對水產(chǎn)品養(yǎng)殖、運輸和銷售等環(huán)節(jié)的監(jiān)督檢查，確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全。此外，草魚最高檢出濃度為5.60 mg·kg-1，是檢出限（0.01 mg·kg-1）的560倍；鱸魚最高檢出濃度為4.40 mg·kg-1，是檢出限的440倍。而鱸魚的檢出率與檢出濃度偏高，可能與它的市場價值有關(guān)，由于鱸魚需求旺盛且價格較高，一些商家傾向于添加漁用麻醉劑來提高其存活率，從而獲得更高的經(jīng)濟回報。

3 結(jié)論

本研究建立了一種快速測定淡水魚中丁香酚類化合物殘留的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法。該方法在0.02～0.20 mg·L-1線性關(guān)系良好，回收率在82.4%～106.0%，具有靈敏度高、準確性好、操作簡單、可大批量檢測等優(yōu)點。通過本方法可以對養(yǎng)殖環(huán)節(jié)和流通環(huán)節(jié)水產(chǎn)品中的丁香酚類化合物殘留進行快速檢測和分析，這有助于指導(dǎo)養(yǎng)殖戶和水產(chǎn)商合理使用藥物，并制定適當?shù)男菟幤谝钥刂茪埩羲剑M而提升淡水魚產(chǎn)品安全水平。此外，該技術(shù)為加強食品安全的抽檢監(jiān)測和日常監(jiān)管提供了有力的支持，確保了監(jiān)管工作的針對性、有效性和系統(tǒng)性，對實現(xiàn)食品安全治理的精準化和科學化起到了促進作用。

參考文獻

[1]王鵬，李濤，賈立平，等.水產(chǎn)品流通環(huán)節(jié)丁香酚類麻醉劑殘留現(xiàn)狀及評價[J].中國水產(chǎn)，2021（11）：88-90.

[2]方曉磊，柯常亮，劉奇，等.水產(chǎn)品中丁香酚殘留的人體健康風險分析[J].水產(chǎn)科學，2018，37（1）：140-144.

[3]朱曉玲，張菊，劉杰，等.湖北省水產(chǎn)品獸藥殘留狀況分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2021，12（1）：69-77.

[4]鄭婷.魚用麻醉劑在水產(chǎn)品運輸中的應(yīng)用[J].當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2017（11）：59-60.

[5]ZHU X L，ZHANG J，LIU J，et al.Analysis of veterinary drug residues in aquatic products in Hubei province[J].J Food Saf Qual，2021，12（1）：69-77.

[6]金元，何雅靜，程波，等.丁香酚類麻醉劑的安全性探討[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2017，8（1）：33-40.

[7]李曉芹，朱振華，翟紋靜，等.漁用麻醉劑使用現(xiàn)狀和檢測技術(shù)研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2017，45（29）：72-73.

[8]李芹，穆樹荷，韓剛，等.水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留檢測技術(shù)研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2021，37（12）：86-91.

[9]邵曼，姚歡，余曉琴.水產(chǎn)品及養(yǎng)殖水中丁香酚類化合物風險研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2021，12（8）：3352-3357.

[10]李元，黃寶生，張長峰.魚用麻醉劑研究進展與安全性評價[J].食品工業(yè)，2019，40（12）：251-255.

[11]陳煥，黃和，高平，等.分散固相萃取-氣相色譜法同時測定水產(chǎn)品中六種丁香酚類麻醉劑的殘留量[J].食品工業(yè)科技，2015，36（8）：88-92.

[12]陸添文，柯常亮，劉奇，等.氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定池塘養(yǎng)殖水中3種丁香酚類麻醉劑[J].分析試驗室，2021，40（5）：518-522.

[13]林晨，吳敏，王凱，等.QuEChERS-超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中的6種丁香酚類麻醉劑[J].食品科學，2023，44（8）：324-329.

[14]王正全，倪玲，謝慶超，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品運輸水和暫養(yǎng)水中丁香酚殘留[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2019，9（1）：56-63.

[15]翟紋靜，朱振華，陳娟，等.2018年江蘇部分地區(qū)流通環(huán)節(jié)水產(chǎn)品中麻醉劑和多種抗生素殘留監(jiān)測[J].衛(wèi)生研究，2020，49（2）：313-316.

[16]楊潔，朱曉玲.丁香酚在水產(chǎn)品中的殘留及風險評估研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2020，11（18）：6523-6529.

[17]穆迎春，韓剛，宋金龍，等.水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實踐與建議[J].中國水產(chǎn)，2019（10）：45-47.

作者簡介：魏琴芳（1993—），女，浙江杭州人，本科，工程師。研究方向：食品安全與檢測。

通信作者：邢峰（1986—），男，浙江衢州人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全與檢測。E-mail： xingff_1986@163.com。