QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中四環(huán)素類抗生素

摘 要：本文建立了QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中3種四環(huán)素類抗生素的方法。方法學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素質(zhì)量濃度在2～200 ng·mL-1時，土霉素、金霉素質(zhì)量濃度在1～200 ng·mL-1時，線性關(guān)系良好，線性系數(shù)均大于0.995。四環(huán)素、土霉素和金霉素的檢出限分別為0.8 μg·kg-1、0.4 μg·kg-1、0.4 μg·kg-1，定量限分別為2.6 μg·kg-1、1.3 μg·kg-1、1.3 μg·kg-1。各目標(biāo)化合物的回收率為64.5%～92.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～10.9%。表明本方法靈敏度高、操作簡單，適用于蔬菜中3種四環(huán)素類抗生素的快速檢測。

關(guān)鍵詞：蔬菜；超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法；四環(huán)素類抗生素

Determination of Tetracycline Antibiotics in Vegetables by QuEChERS Combined with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GU Mantun1， WANG Xiang2， GUO Xiaoyu1， LIN Zhifan1， KANG Rui1*

（1.Institute of Food Testing， Hainan Academy of Inspection and Testing， Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety， State Administration for Market Regulation， Haikou 570100， China;

2.School of Tropical Medicine， Hainan Medical University， Haikou 571199， China）

Abstract： In this paper， a method for the determination of three tetracycline antibiotics in vegetables by QuEChERS combined with ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was established. Methodological analysis showed that when the mass concentration of tetracycline was 2 ng·mL-1 to 200 ng·mL-1， the mass concentration of oxytetracycline and chlortetracycline were 1 ng·mL-1 to 200 ng·mL-1， the linear relationship was good， and the linear coefficients were greater than 0.995. The limits of detection of tetracycline， oxytetracycline and aureomycin were 0.8 μg·kg-1， 0.4 μg·kg-1 and 0.4 μg·kg-1， and the limits of quantitation were 2.6 μg·kg-1， 1.3 μg·kg-1 and 1.3 μg·kg-1， respectively. The recoveries of the target compounds were 64.5% to 92.6% and the relative standard deviations were 1.8% to 10.9% The results indicated this method is sensitive and easy to operate， which is suitable for the rapid determination of there tetracycline antibiotics in vegetables.

Keywords： vegetables; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; tetracycline antibiotics

四環(huán)素類抗生素（Tetracyclines，TCs）包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等，是由放線菌產(chǎn)生的一類抗生素。TCs具有良好的廣譜性、穩(wěn)定性，且價格低廉，被廣泛添加至飼料中以預(yù)防動物疾病和促進(jìn)動物生長[1]。由于其在動物體內(nèi)不能被完全分解，部分會經(jīng)消化道隨排泄物排出體外[2]，這些畜禽廢物被用作有機(jī)肥施入土壤中，造成土壤污染，而土壤中種植的蔬菜等農(nóng)作物可能會吸收累積TCs，最終經(jīng)過食物鏈對人體健康造成不良影響，主要包括腸道菌群失調(diào)、過敏、器官病變、牙齒發(fā)黃變黑等[3]。近年來，多有研究報(bào)道在蔬菜中檢測出不同污染程度的TCs。姚圓等[4]在檢測瓜果類、葉菜類及塊根類等9類蔬菜中的四環(huán)素類抗生素時發(fā)現(xiàn)，除冬瓜外，其他蔬菜中均檢出四環(huán)素和土霉素。然而，目前我國還未制定蔬菜中TCs殘留限量以及檢測方法相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，因此探究蔬菜中TCs的檢測方法十分必要。

常見的前處理方法包括微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、固相萃取法以及QuEChERS法等。其中，QuEChERS法是一種新型的前處理方法，具有快速、簡單、廉價、有效、可靠和安全的優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于農(nóng)獸藥殘留檢測中。常用的食品中農(nóng)獸藥殘留檢測方法有分光光度法、酶聯(lián)免疫吸附法、液相色譜法以及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）等[5]。其中，UPLC-MS/MS具有快速、適用性廣、高靈敏度及高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在TCs的檢測中。本文參考四環(huán)素類抗生素已有的提取、凈化方式，建立一種基于QuEChERS前處理技術(shù)的蔬菜中TCs的UPLC-MS/MS測定方法，旨在為評估蔬菜中TCs污染狀況提供技術(shù)支撐，同時為開發(fā)蔬菜中四環(huán)素類抗生素的新型檢測方法提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜，購于海南?？诋?dāng)?shù)夭耸袌觥?/p>

甲酸（質(zhì)譜級），美國ACS公司；乙腈、甲醇（質(zhì)譜級），德國Merck公司；鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度98.4%）、鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度94.1%）、土霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度88.8%），中國食品藥品檢定研究院；乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q制備超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Multi ReaX渦旋振蕩器，德國Heidolph公司；SK7200B超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；5804 R冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Xcelvap氮吹儀，美國Horizon公司；XS204萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；Xevo TQ-XS超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；Milli-Q IQ7000超純水機(jī)，德國Merck公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

0.1 mol·L-1 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：稱取乙二胺四乙酸二鈉37.2 g、磷酸氫二鈉10.9 g、檸檬酸12.9 g，加少量水混合均勻后轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，繼續(xù)加水定容至刻度線，用0.1 moL·L-1鹽酸溶液調(diào)pH=4.0±0.05。

分別精密稱取一定量的3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解配制成濃度分別為100.0 μg·mL-1的土霉素、四環(huán)素和金霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。各取1 mL土霉素、四環(huán)素和金霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，添加甲醇定容至刻度線，配制成濃度為1.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。再用甲醇將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋10倍，得到濃度為0.1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品處理

稱取粉碎均勻的蔬菜樣品5 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋1 min后超聲15 min，再加入20 mL0.1%甲酸-乙腈混合溶液，渦旋5 min，在10 000 r·min-1、4 ℃條件下離心5 min。離心結(jié)束后，取上清液移至干凈的50 mL離心管中，加入無水硫酸鈉5 g，渦旋2 min，在10 000 r·min-1、4 ℃條件下離心3 min。取10 mL上層液體轉(zhuǎn)移至干凈的15 mL離心管中，向其中加入300 mg C18粉末，渦旋2 min后，在10 000 r·min-1、4 ℃下離心3 min，再將上層液體全部轉(zhuǎn)至另一干凈的15 mL離心管中。放入氮吹儀，在40 ℃條件下，氮吹至近干。用初始比例的流動相定容至1 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待上機(jī)。

1.3.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，依次加入7份經(jīng)凈化處理后的空白樣液中，氮吹至近干，用初始比例的流動相定容至1 mL，配制成濃度分別為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1及200 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.4 儀器條件

（1）液相條件。色譜柱：Waters ACQUITY-UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2 μL。洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～0.5 min，10%B；0.5～4.0 min，10%→30%B；4.0～4.5 min，30%B；4.5～5.0 min，30%→10%B；5.0～6.0 min，10%B。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；去溶劑溫度：500 ℃；毛細(xì)管電壓：0.5 kV；錐孔電壓：65 V；以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣，氬氣為碰撞氣。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用液質(zhì)聯(lián)用儀自帶的MassLynx V4.2.lnk軟件對采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為獲得最佳的質(zhì)譜參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，得到目標(biāo)物的母離子，再調(diào)整優(yōu)化碰撞能量，得到穩(wěn)定性好的子離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

研究乙腈、0.1%的甲酸-乙腈對白菜中四環(huán)素類抗生素的提取效果，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的回收率低于10%，提取效果較差，無法滿足相關(guān)要求。因此，本文參照歐亞紅[6]研究方法和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素殘留量的測定》（GB 31656.11—2021）中四環(huán)素類的提取方法，發(fā)現(xiàn)選用0.1 mol·L-1 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液和0.1%甲酸-乙腈作為蔬菜中四環(huán)素類的提取劑時，回收率能夠達(dá)到要求。

考察超聲時間（5 min、10 min、15 min和20 min）以及加入酸化乙腈后的渦旋時間（5 min、10 min、15 min）對目標(biāo)物質(zhì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲時間為15 min、渦旋時間為5 min時，既能保證目標(biāo)物質(zhì)有較高的回收率，又能節(jié)省提取時間。C18因能吸附蔬菜中的色素、有機(jī)酸等物質(zhì)，常被用作蔬菜中農(nóng)獸藥殘留檢測的凈化劑[7]。本文比較了不同加入量的C18（50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、300 mg和500 mg）對白菜提取液的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入300 mg C18時，回收率最佳。

綜上，本研究選用0.1 mol·L-1 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液和0.1%甲酸-乙腈作為提取劑，按照超聲時間為15 min、渦旋時間為5 min以及C18加入量為300 mg進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

以四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以其定量離子對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各四環(huán)素類抗生素的線性相關(guān)系數(shù)、線性方程見表2。四環(huán)素質(zhì)量濃度在2～200 ng·mL-1（質(zhì)量濃度為1 μg·kg-1時，儀器未檢出四環(huán)素物質(zhì)），土霉素、金霉素質(zhì)量濃度在1～200 ng·mL-1時，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，表明各物質(zhì)均具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，得出四環(huán)素、土霉素、金霉素的檢出限分別為0.8 μg·kg-1、0.4 μg·kg-1、0.4 μg·kg-1，定量限分別為2.6 μg·kg-1、1.3 μg·kg-1、1.3 μg·kg-1。

2.3.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

以白菜為樣品空白基質(zhì)，添加低、中、高3個水平（2.5 μg·kg-1、25.0 μg·kg-1、50.0 μg·kg-1）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平分別進(jìn)行6次平行測定，得到的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）見表3。由表中數(shù)據(jù)可知，3種化合物在不同加標(biāo)水平下的回收率為64.5%～92.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～10.9%。因此，經(jīng)過系列方法學(xué)驗(yàn)證可知，本方法靈敏度以及精密度均較高，回收率滿足要求。

2.4 實(shí)際樣品檢測

在菜市場隨機(jī)購買四季豆、白菜、油麥菜、韭菜及番茄等蔬菜，共計(jì)40批次。采用本方法進(jìn)行蔬菜中3種四環(huán)素類化合物檢測，結(jié)果顯示，僅有1批四季豆檢出土霉素，含量為0.48 μg·kg-1，低于方法定量限，其余蔬菜中均未檢出3種四環(huán)素類化合物。

3 結(jié)論

本研究對提取條件和凈化條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一種QuEChERS結(jié)合超高效液相-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測定蔬菜中3種四環(huán)素類抗生素的檢測方法。該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，可用于蔬菜中的四環(huán)素、金霉素及土霉素含量的分析檢測。

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基金項(xiàng)目：國家市場監(jiān)督管理總局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全）（ZZ-2023021；ZZ-2024012）。

作者簡介：谷滿屯（1991—），男，河南信陽人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢測。

通信作者：康蕊（1987—），女，河南泌陽人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全檢測。E-mail： 550446653@qq.com。