液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳品中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量

摘 要：目的：建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳品中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的方法。方法：乳品試樣用2%氨化乙酸乙酯溶液提取，經(jīng)正己烷脫脂，再用2%氨化乙酸乙酯溶液反萃取，濃縮過膜后上機測試。結(jié)果：氟苯尼考和氟苯尼考胺在1～50 μg·L-1線性關(guān)系良好，檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1 μg·kg-1，加標(biāo)回收率為82.5%～100.4%，RSD為3.35%～6.98%。結(jié)論：該方法適用于乳品中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的定性、定量分析。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；乳品；氟苯尼考；氟苯尼考胺

Determination of Flufenicol and Flufenicol Amine Residues in Dairy Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XU Shuran

（Shenzhen Academy of Metrology & Quality Inspection， Shenzhen 518000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of flufenicol and flufenicol amine residues in dairy products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： Milk samples were extracted with 2% ethyl acetate solution， defatted with n-hexane， then back extracted with 2% ethyl acetate solution， concentrated and tested by machine. Result： The linear relationship between flufenicol and flufenicol amine was good in the range of 1～50 μg·L-1. The limit of detection was 0.5 μg·kg-1， the limit of quantitation was 1 μg·kg-1， the recoveries were 82.5% to 100.4%， and the RSD was 3.35% to 6.98%. Conclusion： The method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of flufenicol and flufenicol amide residues in dairy products..

Keywords： liquid chromatography-tandem mass spectrometry; dairy food; flufenicol; flufenicol amide

氯霉素類藥物包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（Flufenicol，F(xiàn)F）等，常用來治療牲畜和家禽的細菌性呼吸系統(tǒng)與腸道系統(tǒng)感染，療效很好[1]。在氯霉素因損害人體造血系統(tǒng)，相繼被歐盟和我國列入動物源性產(chǎn)品禁用名單后，氟苯尼考憑借其抗菌效果相當(dāng)、價格便宜、毒副作用小等優(yōu)勢，成為氯霉素的替代品，被大量用于牲畜飼養(yǎng)、家禽養(yǎng)殖中預(yù)防和治療疾病。然而，經(jīng)研究表明氟苯尼考在畜禽體內(nèi)具有胚胎毒性，人體長期攝入氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺（Flufeni colamide，F(xiàn)FA）也會對健康產(chǎn)生威

脅[2-4]。近年來，我國乳品行業(yè)發(fā)展迅速，產(chǎn)量和總產(chǎn)值增長在10倍以上，乳制品消費市場前景廣闊。然而，在奶牛養(yǎng)殖過程中也會使用到FF等氯霉素類藥物。如果養(yǎng)殖企業(yè)違規(guī)使用抗生素或不按規(guī)定執(zhí)行休藥期，就會導(dǎo)致乳品中FF和FFA殘留，影響消費者健康。因此，本研究參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.20—2022）[5]，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS）測定乳品中FF及FFA殘留量的分析方法，旨在為奶牛養(yǎng)殖或乳品生產(chǎn)企業(yè)加強品控、檢驗檢測機構(gòu)加強監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌純牛奶，購自某超市。

甲醇中FF/FFA混標(biāo)[編號GBW（E）083592，濃度為100 mg·L-1]，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院；甲醇中FF-D3（編號91884a，濃度為100 μg·mL-1）、甲醇中FFA-D3（編號91854a，濃度為100 μg·mL-1），均購自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇、乙腈，美國賽默飛公司；乙酸乙酯、正己烷（色譜純），德國默克公司；氨水（分析純），山東星菲化學(xué)有限公司；無水硫酸鈉、氯化鈉、甲酸銨（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantis高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛公司；GL2202-1SCN分析天平（精度0.01 g），德國賽多利斯公司；HT190R高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HSC-B水浴氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；Multi Reax多管旋渦振蕩器，德國海道爾夫公司；VORTEX MS3渦旋混合儀，德國艾卡公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（5 μg·mL-1）。準(zhǔn)確吸取0.5 mL濃度為100 mg·L-1的甲醇中FF/FFA混標(biāo)于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，配制成FF/FFA混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（2）混合內(nèi)標(biāo)中間液（5 μg·mL-1）。分別吸取0.5 mL濃度為100 μg·mL-1的甲醇中FF-D3、甲醇中FFA-D3于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，配制成FF-D3與FFA-D3混合內(nèi)標(biāo)中間液。

（3）混合內(nèi)標(biāo)工作液（50 μg·L-1）。準(zhǔn)確吸取0.1 mL濃度為5 μg·mL-1的FF-D3與FFA-D3混合內(nèi)標(biāo)中間液于10 mL容量瓶中，用20%甲醇溶液稀釋定容至刻度，配制成FF-D3與FFA-D3混合內(nèi)標(biāo)工作液。

（4）混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液。分別吸取2 μL、5 μL、10 μL、20 μL、50 μL和100 μL濃度均為5 μg·mL-1的FF與FFA混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于6個10 mL容量瓶中，再向各容量瓶中加入1.0 mL濃度為50 μg·L-1的FF-D3與FFA-D3混合內(nèi)標(biāo)工作液，用20%甲醇溶液稀釋定容至刻度，配制成濃度均為1.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、25.0 μg·L-1和50.0 μg·L-1的FF與FFA混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液，F(xiàn)F-D3與FFA-D3濃度均為5 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液。

1.4 試樣處理

稱取2 g（精確至0.01 g）混勻的乳品試樣于50 mL離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻，再加入10 mL 2%氨化乙酸乙酯溶液、3 g無水硫酸鈉，置于多管旋渦振蕩器上渦旋振蕩10 min，使用8 000 r·min-1冷凍離心機離心5 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移入另一支離心管中，在殘渣中加入10 mL 2%氨化乙酸乙酯溶液，重復(fù)渦旋提取一次，離心，合并兩次上清液，置于水溫50 ℃的氮吹儀上吹干，待凈化。

向待凈化的殘渣中加入3 mL 4%氯化鈉溶液，渦旋使殘渣溶解。加入5 mL 4%氯化鈉飽和的正己烷，渦旋混勻，使用8 000 r·min-1冷凍離心機離心5 min，棄去上層溶液，再重復(fù)脫脂一次。加入5 mL 2%氨化乙酸乙酯溶液，置于多管旋渦振蕩器上渦旋振蕩5 min，使用8 000 r·min-1冷凍離心機離心5 min，取上層有機相，重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取后的有機相，置于水溫50 ℃的氮吹儀上吹干，加入1.0 mL 20%甲醇溶液復(fù)溶，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.5 儀器分析條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：1 μL；流動相：0.1%甲酸水（A）+乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～0.5 min、90%A+10%B，0.5～2.0 min、90%A+10%B，2.0～3.5 min、5%A+95%B，3.5～3.6 min、90%A+10%B，3.6～5.0 min、90%A+10%B。

1.5.2 質(zhì)譜測試條件

電離方式：電噴霧電離；離子源：FF與FF-D3為ESI-，F(xiàn)FA與FFA-D3為ESI+；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細管電壓：3 500 V；離子源溫度：350 ℃；鞘氣壓力：45 Arb；輔助氣壓力：10 Arb；監(jiān)測離子（m/z）：FF 356.0＞185.0、356.0＞219.0（定性），356.0＞336.0（定量）；FFA 356.0＞219.0、248.0＞130.0（定性），248.0＞230.0（定量）；FF-D3 359.2＞339.0（定性），359.2＞339.0（定量）；FF-D3 251.2＞233.1（定性），251.2＞233.1（定量）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系

將配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列上機測定，以混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列中FF和FFA的濃度為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)測得的定量離子峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，由儀器配置的工作站自動計算線性方程與相關(guān)系數(shù)。由表1可知，F(xiàn)F和FFA在1～50 μg·L-1，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對線性的要求。

2.2 方法的檢出限與定量限

稱取2 g純牛奶陰性樣品，添加50 μL FF和FFA濃度均為50 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4試樣處理過程進行試樣前處理，在1.5儀器分析條件下分析測定，以FF和FFA測得定量離子峰面積與基線的信噪比S/N≥3對應(yīng)的濃度來確定方法的檢出限，以信噪比S/N≥10對應(yīng)的濃度來確定方法的定出限。結(jié)果表明，F(xiàn)F和FFA的檢出限均為0.5 μg·kg-1，定量限均為1 μg·kg-1，檢出限與定量限均符合方法標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.20—2022中靈敏度的要求。

2.3 加標(biāo)回收率及精密度

選擇陰性純牛奶為加標(biāo)樣品，按照1倍、2倍、10倍定量限對應(yīng)的含量，分別添加低（1 μg·kg-1）、中（2 μg·kg-1）、高（10 μg·kg-1）3個濃度水平的FF/FFA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4試樣處理過程進行試樣前處理，在1.5儀器分析條件下分析測定，加標(biāo)試樣的各個濃度水平均平行測定6次，計算加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表2可知，F(xiàn)F加標(biāo)回收率為82.5%～95.1%，RSD為3.79%～5.22%；FFA加標(biāo)回收率為85.6%～100.4%，RSD為3.35%～6.98%，回收率與精密度符合GB 31658.20—2022關(guān)于準(zhǔn)確度和精密度的要求。

3 結(jié)論

本研究參照GB 31658.20—2022，建立了LC-MS法測定乳品中FF及其代謝物FFA殘留量的分析方法，F(xiàn)F和FFA在1～50 μg·L-1線性關(guān)系良好，檢出限均為0.5 μg·kg-1，定量限均為1 μg·kg-1，加標(biāo)回收率在82.5%～100.4%，RSD在3.35%～6.98%，可以為乳品中FF及其代謝物FFA殘留量提供確證方法，有助于檢驗檢測機構(gòu)加強乳品中獸藥殘留的監(jiān)控能力。

參考文獻

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作者簡介：徐舒然（1995—），女，廣東深圳人，本科。研究方向：食品安全問題。