煙草NPR1基因家族鑒定及其在南方根結(jié)線蟲脅迫下的表達(dá)分析

摘要：本研究旨在挖掘煙草抗南方根結(jié)線蟲病程相關(guān)基因非表達(dá)子NPRJ（non-expressor of PR genes）家族成員，并明確其功能。基于擬南芥AtNPR1家族成員蛋白序列，利用生物信息學(xué)方法鑒定分析煙草NtNPRI基因家族成員及其特征。通過qRT-PCR檢測南方根結(jié)線蟲侵染后抗?。∟C95）、感?。ㄩL脖黃）煙草品種NtNPRI家族重要候選抗性基因的相對(duì)表達(dá)量，采用LC-MS/MS方法對(duì)2個(gè)品種煙草根系內(nèi)源水楊酸含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，從普通煙草基因組中共鑒定到12個(gè)NlNPRI基因，這些基因被分為3個(gè)亞組，同一亞組中NtNPRI家族成員蛋白結(jié)構(gòu)、保守基序的長度和位置都極為相似。編碼氨基酸長度范圍為462～588，均為親水性蛋白，均位于細(xì)胞核。南方根結(jié)線蟲侵染抗、感煙草品種后，根系中水楊酸含量、NtNPR1基因家族成員表達(dá)量在抗病品種中均升高，在感病品種中則降低，其中NtNPR6的變化最為明顯。綜上，NPRJ基因與煙草南方根結(jié)線蟲抗性密切相關(guān)，NtNPR6基因可作為煙草響應(yīng)南方根結(jié)線蟲脅迫的重要基因。

關(guān)鍵詞：煙草；NPR1基因家族；生物信息學(xué)分析；南方根結(jié)線蟲；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q781：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）09-0022-12

煙草為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，生產(chǎn)過程中受到各種病蟲害的危害，其中南方根結(jié)線蟲病是制約煙葉生產(chǎn)的一個(gè)主要因素，針對(duì)該病害的防治主要集中在生物、化學(xué)防治上，但并未從根本上解決問題。病程相關(guān)基因非表達(dá)子（non-expres-sor of PR genes，NPRl）是水楊酸SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的一類關(guān)鍵調(diào)控因子，也是SA的受體蛋白，在植物系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）及葉、花的形成發(fā)育過程中起著重要作用。目前，關(guān)于NPR1基因介導(dǎo)SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在南方根結(jié)線蟲脅迫下煙草相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制的研究較少。因此，挖掘煙草抗南方根結(jié)線蟲基因?qū)剐云贩N選育和病害防治具有重要意義和參考價(jià)值。

前人研究表明，在大豆中過表達(dá)NPRI基因能有效抑制寄生線蟲形成根癭、卵囊、卵和二齡幼蟲的能力。較野生型植株，AtNPR1轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)南方根結(jié)線蟲表現(xiàn)出更好的抗性?？共浞N毛白楊在感染歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌（Lonsdalea quercina subsp，populi）后體內(nèi)NPRI-1、NPR1-2被誘導(dǎo)表達(dá)。Molla等通過在水稻中組織特異性表達(dá)AtNPR1基因發(fā)現(xiàn)，水稻對(duì)稻紋枯病的抗性顯著升高，表明該基因在植物抗性反應(yīng)建立過程中起關(guān)鍵作用。外源茉莉酸（JA）和乙烯（EL）處理紅麻后，紅麻抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因NPRI表達(dá)量均有提高，表明NPR1在JA/EL激素信號(hào)通路中被誘導(dǎo)表達(dá)，從而激活植物系統(tǒng)抗性（induced systenuc resistance，ISR）。NPR1作為兩條不同形式抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要交匯中心之一，在SAR和ISR反應(yīng)中具有重要調(diào)控作用，是植物抗性激活方面不可缺少的調(diào)控因子，且NPR1具有平衡JA/EL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑強(qiáng)弱的能力。在缺少NPRI的情況下，擬南芥nprl突變體植株對(duì)SAR誘導(dǎo)物無法應(yīng)答，并且病程相關(guān)基因（pathogenesis related gene，PR）也幾乎不表達(dá)，導(dǎo)致植株對(duì)病原菌的防御力降低；相反，在NPRI存在時(shí)，SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的SAR反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與到PR基因表達(dá)調(diào)控，使植株抗性提升。

目前，在擬南芥（Arabidopsis thatiana）基因組中共鑒定出5個(gè)與NPR1具有高同源性的旁系基因，并將其分別命名為NPR2、NPR3，NPR4、NPR5（又稱為BOP2）、NPR6（又稱為BOPl）。有研究表明，擬南芥AtNPR1、AtNPR2在SA介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中具有正向調(diào)控作用：AtNPR3、AtNPR4在SA誘導(dǎo)的抗性基因表達(dá)過程中發(fā)揮反向調(diào)控作用；AtNPR5、AtNPR6對(duì)植物花、冠等器官發(fā)育與形成具有促進(jìn)作用。經(jīng)典的NPR1基因結(jié)構(gòu)包含BTB/POZ（broad-complex，tramtrack，andbric-a-brac/poxvinls and zinc-finger）結(jié)構(gòu)域、錨蛋白重復(fù)序列（ankyrin repeats，ANK-r）結(jié)構(gòu)域以及NPRl-like-C轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)。其中，BTB和ANK-r結(jié)構(gòu)域與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用促使植物SAR反應(yīng)建立。位于N端的BTB結(jié)構(gòu)域通過介導(dǎo)NPR1與EIN3（乙烯受體蛋白）結(jié)合，使頂端彎鉤形成受阻。并且BTB結(jié)構(gòu)域還可與TGA2抑制區(qū)相互作用抑制PR基因的表達(dá)，與本身C端相互作用抑制NPR1的表達(dá)，當(dāng)C端通過Cu2+與SA結(jié)合后，又重新激活NPR1與TGA形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，誘導(dǎo)PR基因表達(dá)。

隨著越來越多的植物全基因組測序工作的完成，不同植物的NPR1基因家族被陸續(xù)鑒定出來，如小麥、棉花、番木瓜和鱷梨中分別鑒定出1、1、4個(gè)和5個(gè)NPRI基因。煙草屬于經(jīng)濟(jì)類模式作物，鑒定其NPR1基因家族對(duì)研究煙草抗性獲得以及響應(yīng)生物脅迫調(diào)控等方面具有重要意義。本研究通過同源比對(duì)和生物信息學(xué)方法從普通煙草基因組中鑒定NPR1基因家族，并系統(tǒng)分析候選基因理化性質(zhì)、物種進(jìn)化關(guān)系、蛋白結(jié)構(gòu)及在南方根結(jié)線蟲脅迫下的表達(dá)等特性，以期為明確煙草NPRI在響應(yīng)脅迫過程中的調(diào)控機(jī)制提供理論指導(dǎo)。