粉葛PtERF98基因克隆及表達(dá)分析

摘要：乙烯響應(yīng)因子（e山y(tǒng)lene responsive facLor，ERF）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中起重要的調(diào)控作用。為探明PLERF98轉(zhuǎn)錄因子在粉葛（Pueraria thomsonii Benth.）塊根采后生理性變質(zhì)（posL-harvesL physiological deIerioration，PPD）過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，本研究采用RT-PCR技術(shù)從火山粉葛葉組織中克隆PtERF98基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)、組織表達(dá)特異性分析和在PPD過程中的表達(dá)分析。結(jié)果顯示，PtERF98基因CDS序列長450 bp，編碼149個氨基酸殘基，PIERF98蛋白理論分子量為16.93 kDa，理論等電點(diǎn)為8 06，為親水性不穩(wěn)定蛋白。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，PtERF98具有典型的AP2保守結(jié)構(gòu)域，屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，定位于細(xì)胞核，無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，含有1個信號肽和16個磷酸化位點(diǎn)。氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，PtERF98與大豆（Clycine max）CmERF98同源性最高且親緣關(guān)系最近。組織表達(dá)分析顯示，PtERF98基因在火山粉葛的根、莖、葉中均有表達(dá)，且在不同組織中的相對表達(dá)量存在差異，葉中表達(dá)量最高。此外，PtERF98的表達(dá)受到PPD的顯著誘導(dǎo)，表達(dá)水平隨著PPD時間延長呈先升高后下降趨勢，并在采后48 h達(dá)到最高，推測該基因可能參與粉葛塊根的PPD過程。本研究可為深入了解PtERF98基因的功能及其在粉葛PPD過程中的表達(dá)調(diào)控作用奠定研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：粉葛；乙烯信號通路；PIERF98轉(zhuǎn)錄因子；采后生理性變質(zhì)；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號：Q781：S567.9 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）09-0006-07

粉葛（Pueraria thomsonii Benth.）是豆科蝶形花亞科葛屬藤本植物，在我國廣泛分布。它的莖基部木質(zhì)化，并帶有肥厚的塊狀根。研究發(fā)現(xiàn)，粉葛含有多種活性成分，主要包括葛根素、大豆苷元、染料木素、異甘草素等異黃酮類化合物，以及皂角精醇、槐二醇、大豆苷醇等皂苷類物質(zhì)?；鹕椒鄹鹗侵袊鴩业乩順?biāo)志產(chǎn)品之一，因生長在廣東省韶關(guān)市曲江區(qū)大塘鎮(zhèn)火山地區(qū)而得名。與其他產(chǎn)地的粉葛相比，火山粉葛具有肉質(zhì)根，口感綿軟細(xì)嫩，味道甘甜，淀粉含量高，水分和纖維含量低，素有食不留渣的優(yōu)越品質(zhì)。作為一種“藥食同源”作物，火山粉葛具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、降血糖和血脂、抗腫瘤、抗氧化、解酒等生物活性。此外，火山粉葛富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、多糖及多種微量元素，不僅可以作為美食，還有清熱、養(yǎng)肝、理氣、養(yǎng)顏等醫(yī)用功效，具有極高的食用價值和保健價值。同時植株還具有耐寒、抗旱和耐貧瘠等特性，是一種具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ木G色能源植物。然而，粉葛的塊根在采收后2-3 d便會發(fā)生腐爛霉變等采后生理性變質(zhì)（post-harvest physiological deterioration，PPD）現(xiàn)象，嚴(yán)重制約它的貯藏、加工、運(yùn)輸和利用。因此，研究粉葛PPD的分子機(jī)制對于粉葛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

乙烯（2-chloroethylphosphonic acid）是植物重要的內(nèi)源激素，對植物的生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)起重要作用。例如，在植物缺水時，乙烯水平迅速升高，以促進(jìn)植物葉片老化和脫落，維持植物體內(nèi)水分平衡。乙烯前體處理能顯著提高擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗在高鹽脅迫下的存活能力。此外，乙烯信號與活性氧含量變化的相關(guān)性也得到研究證實(shí)。在皇冠梨（Pyrus bretschneideri）中，乙烯通過提高過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性來抑制采后腐爛。擬南芥中的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵成員包括乙烯受體（ethylene receptors）、CTR1蛋白激酶（Raf-like CTRl）、EIN2（ ethylene insensitive 2）、EIN3（ethylene insensitive 3）/EILl（ethylene insensitive like l）、ERFl（ ethylene response factor l）以及EBFl/2（EIN3 binding F-box l and 2）等。作為乙烯信號途徑中的核定位轉(zhuǎn)錄因子，ERF（ethylene responsive factor）轉(zhuǎn)錄因子屬于具有典型ERF結(jié)構(gòu)域的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子大家族。ERF98是ERF家族的重要成員，在多種非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控功能。例如，擬南芥AtERF98通過調(diào)控維生素C合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，增強(qiáng)維生素C的合成能力，以清除鹽脅迫下積累的活性氧，提高鹽脅迫的耐受性。桃樹（Prunus persica）的PpERF98與PpERFl相互作用，共同介導(dǎo)茉莉酸／乙烯信號途徑中的ERF分支，從而負(fù)調(diào)控桃樹對流膠病菌（Lasiodiplodia theobromae）的抗性。然而，目前有關(guān)粉葛ERF轉(zhuǎn)錄因子的研究鮮有報道。

以往的研究顯示，活性氧積累是塊根類作物發(fā)生PPD的根本原因之一，而酶促褐變是PPD過程中最為明顯的表現(xiàn)，其誘因是細(xì)胞組織中原有的酚類物質(zhì)被氧化成醌類化合物進(jìn)而聚集形成褐色或黑色物質(zhì)。課題組前期研究顯示，乙烯處理能夠通過提高抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)來提升抗氧化酶的活性，繼而顯著抑制火山粉葛PPD進(jìn)程，但響應(yīng)機(jī)制尚不明確。因此，本研究基于前期火山粉葛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，從火山粉葛葉組織中克隆PtERF98基因編碼區(qū)（CDS）序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)和組織表達(dá)特異性分析，以明確該基因在PPD不同階段的表達(dá)模式，為深入研究PtERF98基因功能及其在粉葛PPD過程中的分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)，也為通過現(xiàn)代育種技術(shù)培育火山粉葛優(yōu)良品種提供基因資源。