建立一種適合本實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的方法

【摘要】目的運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF MS）檢測(cè)產(chǎn)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP），篩選并驗(yàn)證其特征峰，建立一種適用于本實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)產(chǎn)KPC酶型CRKP的方法。方法收集臨床耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌39株，運(yùn)用PCR方法檢測(cè)出其中23株產(chǎn)KPC酶，再采用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測(cè)KPC酶陽(yáng)性CRKP菌株，得到質(zhì)譜圖后用Flex Analyst軟件分析篩選出其中特征峰，并進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證評(píng)估。結(jié)果綜合篩選出產(chǎn)KPC酶CRKP最佳特征峰為m/z 6432，特征峰驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性分別為96.67%和100%。臨床驗(yàn)證評(píng)估特異性和敏感性分別為92.31%和100%。結(jié)論利用MALDI-TOF MS技術(shù)可檢出產(chǎn)KPC酶CRKP的最佳特征峰為m/z 6432，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該特征峰特異性和敏感性高，可為臨床快速診斷和治療產(chǎn)KPC酶CRKP提供理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)；特征峰；肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶

中圖分類號(hào)：R446.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.08.011

Establishment of a suitable method for rapid detection of KPC

producing Klebsiella pneumoniae in our laboratory

TENG Yuanji， YI Xueli， CHEN Xiaoying， LUO Bin， WANG Chunfang

（Department of Clinical Laboratory， Affiliated Hospital of Youjiang

Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】ObjectiveTo detect Klebsiella pneumoniae carbapenemase （KPC） producing carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP） by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）， and to screen and verify its characteristic peak， so as to establish a suitable method for rapid detection of KPC-producing CRKP in our laboratory. Methods39 clinical strains of CRKP were collected， and 23 of them were detected to produce KPC by PCR. MALDI-TOF MS technology was used to detect KPC-positive CRKP strains， Flex Analyst software was used to analyze and screen out their characteristic peaks after the mass spectrum was obtained， and then repeatable experiments and clinical verification evaluations were carried out. ResultsThe best characteristic peak of KPC-producing CRKP was m/z 6432. The specificity and sensitivity of the validation experiment and the repeatability experiment of characteristic peak were 96.67% and 100%， respectively. The specificity and sensitivity of clinical validation evaluation were 92.31% and 100%， respectively. ConclusionThe best characteristic peak of KPC-producing CRKP that can be detected by using MALDI-TOF MS technology is m/z 6432. It is proved by experiments that this characteristic peak has high specificity and sensitivity， which can provide a theoretical basis for rapid clinical diagnosis and treatment of KPC-producing CRKP.

【Keywords】matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）; characteristic peak; carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP）; Klebsiella pneumoniae carbapenemase （KPC）

近年來(lái)，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）在全球范圍內(nèi)迅速蔓延。由于其高發(fā)病率和病死率、有限的治療選擇、長(zhǎng)期住院需求以及高昂的治療費(fèi)用，CRKP對(duì)公共健康構(gòu)成了重大威脅［1］。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)產(chǎn)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase， KPC）型CRKP主要依賴于藥敏實(shí)驗(yàn)的表型篩選、16S rRNA測(cè)序、PCR檢測(cè)和序列分析等方法。然而，這些方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜且成本高昂［2-3］。因此，探索一種更快速、簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確的檢測(cè)產(chǎn)KPC酶CRKP的實(shí)驗(yàn)方法顯得尤為必要。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)。該技術(shù)利用高分辨質(zhì)譜分析對(duì)細(xì)菌蛋白組學(xué)進(jìn)行深入解析，適用于病原微生物的鑒定、分類和耐藥機(jī)制研究，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、高敏感性和高通量等優(yōu)點(diǎn)［4］。因此，本研究旨在利用MALDI-TOF MS檢測(cè)技術(shù)，建立一種適用于本實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)產(chǎn)KPC酶CRKP的實(shí)驗(yàn)方法，并期望能將此檢測(cè)方法推廣開來(lái)。

1資料與方法

1.1菌株來(lái)源選取本院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室在2020年4月至2022年8月期間收集的39株CRKP。同時(shí)，選取了最近的5株非CRKP菌株（包括ATCC700603）作為陰性對(duì)照。

1.2試劑和儀器TE緩沖液由Biosharp生物科技有限公司提供。甲酸和乙腈由賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司供應(yīng)，而α-氰基-4-羥基-肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid， CHCA）基質(zhì)則購(gòu)自法國(guó)Bio Mérieux公司。PCR引物和擴(kuò)增試劑盒的供應(yīng)商是寶生物工程（大連）有限公司。血平板、中國(guó)蘭平板和巧克力平板均購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司。MALDI-TOF MS和VITEK 2-c8gxcj/KP3bMM/mFwoeGheTAsIqfN4VoMuhbIlrT27M8=ompact系統(tǒng)由法國(guó)Bio Mérieux公司提供。電泳儀及全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)則購(gòu)自Biorad（美國(guó)）公司。

1.3方法

1.3.1菌株耐藥基因檢測(cè)⑴ 菌株預(yù)處A/NDl/TAYh8hH5iqhmX+nyYmKqvzcVGItV0hfXOCXiI=理：先將之前收集的CRKP菌株在室溫下復(fù)蘇，并轉(zhuǎn)種至血平板上。隨后在35 ℃條件下孵育16～24小時(shí)，選取單個(gè)菌落，制備成4麥?zhǔn)蠞舛龋ù蠹s1.2×109 cfu/mL）的菌懸液以備后續(xù)使用。⑵ 菌株DNA提?。ㄖ蠓蟹ǎ喝?00 μL TE Buffer緩沖液，加入100 μL的菌懸液，充分振蕩混合后，于100 ℃煮沸13分鐘，然后置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。?利用PCR技術(shù)檢測(cè)CRKP菌株中的KPC耐藥基因：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)碳青霉烯酶耐藥基因的引物，其名稱及序列（5'→3'）為：KPC-R： CGCCCAACTCCTTCAGCAACA 和 KPC-F： GCGGAACCATTCGCTAAACTC，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為340 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。⑷ PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，包括上下游引物各0.5 μL，Premix Taq 12.5 μL，模板（提取的細(xì)菌DNA）5 μL，以及ddH2O 6.5 μL。⑷ PCR反應(yīng)條件：首先在94 ℃下預(yù)變性10分鐘，接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98 ℃下10秒，55 ℃下30秒，以及72 ℃下30秒。⑸ 使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳法（使用1×Tae緩沖液，加入5 μL DNA）檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。若檢測(cè)到約340 bp的PCR產(chǎn)物，則表明該分離株為KPC基因陽(yáng)性。

1.3.2MALDI-TOF MS 質(zhì)譜檢測(cè)菌株預(yù)處理（乙醇-甲酸-乙腈提取法）：⑴先將之前收集的CRKP在室溫下復(fù)蘇，并轉(zhuǎn)種至血平板中，隨后在35 ℃下孵育16～24小時(shí)以備使用。⑵在0.5 mL離心管中加入15～20 μL無(wú)水乙醇，使用1 μL的一次性接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，與無(wú)水乙醇充分混合（通過(guò)渦旋振蕩5～10秒以重懸菌液）。⑶在菌懸液中加入15～20 μL的70%甲酸，進(jìn)行15～20秒的渦旋震蕩，接著加入15～20 μL的乙腈，再次進(jìn)行15～20秒的渦旋震蕩。⑷取1～2 μL的菌懸液涂布于靶板上，待其完全干燥后，加入1 μL的CHCA基質(zhì)液，自然干燥后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，以觀察并收集特征峰。質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置為：m/z范圍在2000～20 000之間，激光強(qiáng)度為85%，使用質(zhì)控菌株ATCC8739大腸埃希菌進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3.3特征峰篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)10株產(chǎn)KPC酶的CRKP（A組）、5株非產(chǎn)KPC酶的CRKP（B組）以及5株非CRKP（包括ATCC700603）（C組）這三組菌株進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定分析。首先，對(duì)A組菌株進(jìn)行了歸類比對(duì)，并利用Flex Analyst軟件進(jìn)行分析，同時(shí)輔以肉眼觀察，以篩選出最佳的特征峰。其次，從A、B、C三組中各選出鑒定度達(dá)到99%的5株菌株（A組2株，B組1株，C組2株，包括ATCC700603）進(jìn)行進(jìn)一步的歸類比對(duì)，觀察候選特征峰的特異性。最后，確定產(chǎn)KPC酶CRKP的最佳特征峰。

1.3.4特征峰驗(yàn)證和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)遵循上述操作指南，使用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)10株CRKP進(jìn)行檢測(cè)并獲取相應(yīng)的質(zhì)譜圖譜。在此過(guò)程中，仔細(xì)分析以確定是否存在產(chǎn)KPC酶CRKP的特異性峰。選取那些展現(xiàn)出產(chǎn)KPC酶CRKP特異性峰的菌株，采用乙醇-甲酸-乙腈提取法對(duì)這些菌株的單個(gè)菌落進(jìn)行裂解處理。隨后，取1 μL的裂解液均勻涂抹于靶板上，并對(duì)每個(gè)菌株進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分別涂抹于三個(gè)不同的孔位。通過(guò)分析特征峰的峰值，評(píng)估其重復(fù)性并計(jì)算重復(fù)率。

1.3.5臨床驗(yàn)證評(píng)估選取日常臨床工作中用MALDI-TOF MS檢出的肺炎克雷伯菌（含CRKP）共53株，分析觀察其檢測(cè)圖譜中是否存在產(chǎn)KPC酶CRKP最佳特征峰，并對(duì)所有菌株進(jìn)行相關(guān)耐藥基因檢測(cè)（步驟同1.3.1），最后計(jì)算特征峰的特異性和敏感性。

2結(jié)果

2.1菌株耐藥基因檢測(cè)結(jié)果提取39株CRKP的DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及0.01 agarose電泳分析（圖1），在340 bp處出現(xiàn)一條均一條帶，結(jié)果符合產(chǎn)KPC酶基因條帶大小，因此最終確定有23株CRKP產(chǎn)KPC酶。

2.2MALDI-TOF MS 質(zhì)譜檢測(cè)特征峰的篩選將A組質(zhì)譜峰值進(jìn)行歸類比對(duì)，用Flex Analyst軟件及肉眼觀察分析篩選得出m/z 6432為最佳特征峰（圖2a）。從A、B、C三組中各挑選出鑒定度99%的5例菌株（A組2株，B組1株，C組2株，含ATCC700603 KPN）進(jìn)行歸類比對(duì)，發(fā)現(xiàn) m/z 6432為產(chǎn)KPC酶CRKP特征峰（圖2b）。

2.3特征峰驗(yàn)證和重復(fù)實(shí)驗(yàn)選取10株確定產(chǎn)KPC酶CRKP進(jìn)行驗(yàn)證和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，肉眼觀察到10株CRKP均存在m/z 6432特征峰，敏感性為100%（10/10）。每株CRPK重復(fù)3次鑒定，肉眼觀察到有29個(gè)m/z 6432特征峰，特異性96.67%（29/30）。

2.4臨床驗(yàn)證評(píng)估收集2021年1月—2021年8月肺炎克雷伯菌（含CRKP）53株，用MALDI-TOF MS鑒定并分析圖譜結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行PCR測(cè)序分析，其中產(chǎn)KPC酶CRKP 12株，非該型別CRKP 4株，其余非CRKP 37株。肉眼觀察MALDI-TOF MS鑒定圖譜是否存在m/z 6432特征峰，結(jié)果顯示其特異性92.31%（12/13），敏感性為100%（12/12）。見表1。

3討論

產(chǎn)KPC酶的CRKP是一種具有極高危險(xiǎn)性的革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌，其耐藥性極強(qiáng)［5］。常規(guī)抗生素對(duì)CRKP的療效不佳，導(dǎo)致患者治療選擇受限，住院時(shí)間延長(zhǎng)，治療成本增加，以及病死率上升，這給公共衛(wèi)生帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［6］。因此，在臨床微生物學(xué)中，快速檢測(cè)產(chǎn)KPC酶菌株顯得至關(guān)重要。MALDI-TOF MS作為一種迅速發(fā)展的技術(shù)，在臨床、科研和工業(yè)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［7］。

在本項(xiàng)研究中，我們運(yùn)用乙醇-甲酸-乙腈提取法對(duì)菌株蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并通過(guò)MALDI-TOF MS技術(shù)獲取了敏感株和CRKP的質(zhì)譜圖。經(jīng)過(guò)分析，我們注意到僅在產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌中出現(xiàn)了m/z 6432的特征峰。對(duì)碳青霉烯類敏感的肺炎克雷伯菌進(jìn)行圖譜分析時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)相同的m/z 6432特征峰。后續(xù)的重復(fù)性試驗(yàn)和臨床驗(yàn)證進(jìn)一步確認(rèn)了CRKP中存在m/z 6432特征峰。因此，在臨床實(shí)踐中，我們可以通過(guò)檢測(cè)單株肺炎克雷伯菌的質(zhì)譜圖中是否存在m/z 6432特征峰來(lái)快速識(shí)別產(chǎn)KPC酶的菌株。這一方法顯著縮短了CRKP的檢測(cè)時(shí)間，為臨床早期預(yù)防和治療CRKP提供了重要依據(jù)。MALDI-TOF MS技術(shù)自引入臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室以來(lái)尚不足15年，但其優(yōu)勢(shì)已日益顯現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)該技術(shù)的研究也在持續(xù)深入［8］。例如，國(guó)內(nèi)學(xué)者余佳佳等［9］的研究報(bào)告指出，利用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測(cè)ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)了m/z 4521的特征峰。GAIBANI等［10-11］的研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)KPC酶型肺炎克雷伯菌株中檢測(cè)到了m/z 11109特征峰，進(jìn)一步分析顯示，該特征峰對(duì)應(yīng)P019蛋白基因，該基因通常與轉(zhuǎn)座子Tn4401a亞型相關(guān)，并廣泛存在于產(chǎn)KPC酶型的肺炎克雷伯菌中。然而，攜帶P019基因的肺炎克雷伯菌主要流行于日本地區(qū)，在其他國(guó)家較為罕見，因此在本次實(shí)驗(yàn)中，我們未在待測(cè)菌株中檢測(cè)到m/z 11109特征峰。由于菌株遺傳背景的差異性以及流行地區(qū)地域環(huán)境的影響［12］，不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)到的同種細(xì)菌特征峰可能存在差異。因此，確定適合本實(shí)驗(yàn)條件下的特征峰是本研究的關(guān)鍵所在。

MALDI-TOF MS技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于臨床中對(duì)常見革蘭陰性桿菌（例如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等）的耐藥基因檢測(cè)，還適用于對(duì)常見革蘭陽(yáng)性球菌、厭氧菌、罕見菌以及疑難菌的耐藥基因檢測(cè)［8］。例如，EDWARDS-JONES等人首次報(bào)道了利用MALDI-TOF MS技術(shù)成功檢測(cè)出MSSA和MRSA的特征峰，而GRIFFIN等人則報(bào)道了該技術(shù)能夠檢測(cè)出攜帶vanB基因的萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌（VRE）［13-14］。此外，NAGY等人［15］利用MALDI-TOF MS技術(shù)識(shí)別出cfiA基因，這是編碼第二類脆弱擬桿菌碳青霉烯酶的特異性基因。該方法能夠迅速檢測(cè)并區(qū)分脆弱擬桿菌與脆弱芽孢桿菌，極大地便利了臨床對(duì)罕見及疑難菌種的檢測(cè)。

綜合以上分析，本研究采用MALDI-TOF MS技術(shù)篩選出適用于本實(shí)驗(yàn)室的產(chǎn)KPC酶CRKP的特征峰m/z 6432，并通過(guò)多種方法驗(yàn)證了其可靠性，確認(rèn)了該特征峰具有顯著的臨床應(yīng)用潛力。同時(shí)，我們期望這一方法能夠促進(jìn)其在各實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用。然而，本研究也存在一些局限性，例如未對(duì)本次CRKP進(jìn)行KPC酶亞型分析，未進(jìn)行CRKP同源性分析，以及收集的樣本數(shù)量有限等?；诒狙芯康某晒覀儗⑦M(jìn)一步運(yùn)用MALDI-TOF MS技術(shù)，深入且多維度地開展探索性研究，旨在為臨床常見型別肺炎克雷伯菌的早期診斷、治療和流行病學(xué)研究提供堅(jiān)實(shí)的理論支持。參考文獻(xiàn)［1］ KARAISKOS I， GALANI I， PAPOUTSAKI V， et al. Carbapenemase producing Klebsiella pneumoniae： implication on future therapeutic strategies［J］. Expert Rev Anti Infect Ther， 2022，20（1）：53-69.

［2］ DOERN C D， DUNNE W M J R， BURNHAM C A. Detection of Klebsiella pneumoniae carbapenemase （KPC） production in non-Klebsiella pneumoniae Enterobacteriaceae isolates by use of the Phoenix， Vitek 2， and disk diffusion methods［J］. J Clin Microbiol，2011，49（3）：1143-1147.

［3］ JOHNSON J S， SPAKOWICZ D J， HONG B Y， et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis［J］. Nat Commun， 2019，10（1）：5029.

［4］ KARGER A. Current developments to use linear MALDI-TOF spectra for the identification and typing of bacteria and the characterization of other cells/organisms related to infectious diseases［J］. Proteomics Clin Appl， 2016，10（9/10）：982-993.

［5］ LIAO Q F， DENG J， FENG Y， et al. Emergence of ceftazidime-avibactam resistance due to a novel blaKPC-2 mutation during treatment of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infections［J］. J Infect Public Health， 2022，15（5）：545-549.

［6］ LIU C， LIU L， JIN M M， et al. Molecular epidemiology and risk factors of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae bloodstream infections in Wuhan， China［J］. Curr Med Sci， 2022，42（1）：68-76.

［7］ HLEBA L，HLEBOV M，KOVIK A， et al. Carbapenemase producing Klebsiella pneumoniae （KPC）： what is the best MALDI-TOF MS detection method［J］. Antibiotics， 2021，10（12）：1549.

［8］ 唐克文，李從榮，汪倩鈺，等.基于MALDI-TOF MS質(zhì)譜峰分析細(xì)菌耐藥性的研究進(jìn)展［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2021，41（3）：242-248.

［9］ 余佳佳，劉婧嫻，李媛睿，等.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速檢測(cè)ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2018，33（6）：536-542.

［10］ GAIBANI P， GALEA A， FAGIONI M， et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of KPC-producing Klebsiella pneumoniae［J］. J Clin Microbiol， 2016，54（10）：2609-2613.

［11］ GAIBANI P， AMBRETTI S， TAMBURINI M V， et al. Clinical application of Bruker Biotyper MALDI-TOF/MS system for real-time identification of KPC production in Klebsiella pneumoniae clinical isolates［J］. J Glob Antimicrob Resist， 2018，12：169-170.

［12］ SZABADOS F， KAASE M， ANDERS A， et al. Identical MALDI TOF MS-derived peak profiles in a pair of isogenic SCCmec-harboring and SCCmec-lacking strains of Staphylococcus aureus［J］. J Infect， 2012，65（5）：400-405.

［13］ EDWARDS-JONES V， CLAYDON MA， EVASON D J， et al. Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry［J］. J Med Microbiol， 2000，49（3）：295-300.

［14］ GRIFFIN P M， PRICE G R， SCHOONEVELDT J M， et al. Use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry to identify vancomycin-resistant enterococci and investigate the epidemiology of an outbreak［J］. J Clin Microbiol， 2012，50（9）：2918-2931.

［15］ NAGY E， BECKER S， SKI J， et al. Differentiation of division I （cfiA-negative） and division II （cfiA-positive） Bacteroides fragilis strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry［J］. J Med Microbiol， 2011，60（Pt 11）：1584-1590.

（收稿日期：2023-12-22修回日期：2024-04-25）

（編輯：梁明佩）