不僅僅是基因編輯
——CRISPR工具包擴(kuò)展出三個(gè)新技能

編譯 凌寒

近期發(fā)表在《科學(xué)》雜志的三項(xiàng)研究中，全球領(lǐng)先的CRISPR實(shí)驗(yàn)室在這項(xiàng)技術(shù)上展示了一些極具創(chuàng)造性的新發(fā)現(xiàn)，將這位編輯高手變成了一名病毒偵探，抑或是一位目光敏銳的歷史學(xué)家，將細(xì)胞的整個(gè)歷史寥寥幾筆記錄在DNA中。

與CRISPR一樣，這些新技術(shù)也被冠以可愛(ài)的縮略詞，例如“照相機(jī)”（CAMERA）、“探測(cè)器”（DETECTR）和“神探夏洛克”（SHERLOCK）。CRISPR的“創(chuàng)意性用途”突然爆發(fā)式涌現(xiàn)清楚地表明，科學(xué)家還遠(yuǎn)未完成這項(xiàng)技術(shù)所能提供的所有潛在應(yīng)用的開發(fā)。

為了讓CRISPR變成一個(gè)真正的多用型工具，研究團(tuán)隊(duì)充分發(fā)揮創(chuàng)造性：“照相機(jī)”，即細(xì)胞記錄器，使用DNA環(huán)作為細(xì)胞歷史——比方說(shuō)暴露在抗生素或毒素中——的指示讀數(shù)。

相比之下，“神探夏洛克”則引入了“犧牲型”RNA分子，這些RNA分子在有病毒或癌癥DNA的情況下被切碎，從而產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。這就好比記錄紙帶上顯示的藍(lán)線，就像懷孕測(cè)試一樣的。

“（它）強(qiáng)調(diào)了人們利用CRISPR技術(shù)中的發(fā)現(xiàn)來(lái)構(gòu)建這些合成途徑的真正創(chuàng)造性的方式?！贝鞣颉に_維奇（Dave Savage）博士說(shuō)道。他是加州大學(xué)伯克利分校的一名蛋白質(zhì)工程師，他并未參與這項(xiàng)研究。

細(xì)胞記錄器

在航行出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，飛機(jī)黑匣子是調(diào)查人員的寶貴資源。同樣地，科學(xué)家一直以來(lái)都希望能有一種細(xì)胞時(shí)間機(jī)器來(lái)詳細(xì)描述細(xì)胞生命中發(fā)生的事件——輻射劑量，微量藥物用量，或者是將健康細(xì)胞推向患病狀態(tài)的內(nèi)部混亂。

除了DNA之外，還有什么更好的記錄細(xì)胞歷史的方法呢？

在哈佛大學(xué)，劉如謙（David Liu）博士利用CRISPR能夠精確切割DNA片段的能力，開發(fā)了一種“分子歷史學(xué)家”，稱為“照相機(jī)”（CAMERA）——CRISPR-介導(dǎo)的模擬多事件錄音設(shè)備（一口氣讀下來(lái)！）的簡(jiǎn)稱。

以下是它的工作原理。首先，在細(xì)菌細(xì)胞中，研究小組對(duì)CRISPR的向?qū)Х肿印跋驅(qū)А盧NA——進(jìn)行了微調(diào)，使其只有在觸發(fā)后才被激活生效：比方說(shuō)，在被抗生素或其他化學(xué)物質(zhì)攻擊后。一旦被激活，向?qū)NA就會(huì)將Cas9——即CRISPR剪刀——募集至靶位點(diǎn)。沒(méi)有向?qū)NA，就不會(huì)發(fā)生切割行動(dòng)。

除了將CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)外，該團(tuán)隊(duì)還為細(xì)胞提供了兩個(gè)額外的DNA小片段，這兩段DNA小片段被整編為環(huán)狀DNA，稱作“質(zhì)?！?。正常情況下，細(xì)胞以穩(wěn)定的比率表達(dá)這兩個(gè)質(zhì)粒。但是一旦向?qū)NA被激活，它（和Cas9）僅會(huì)追蹤其中一個(gè)質(zhì)粒，并將其切碎，而另一個(gè)則完好無(wú)損。

通過(guò)這種方式，團(tuán)隊(duì)可以很容易地測(cè)量出兩個(gè)質(zhì)粒的比例。使用這個(gè)系統(tǒng)，研究小組就能夠檢測(cè)出一個(gè)細(xì)胞是否用四環(huán)素這種常見(jiàn)抗生素處理過(guò)。

但是第一個(gè)系統(tǒng)只能在細(xì)菌細(xì)胞中工作。劉如謙和他的團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開發(fā)了二代“照相機(jī)”，二代“照相機(jī)”使用了修飾后的Cas9。這些剪刀不再切割目標(biāo)基因，而是找到特定的DNA字母，并將其換成另一個(gè)。

和上一個(gè)系統(tǒng)一樣，這個(gè)系統(tǒng)僅僅可被細(xì)胞對(duì)某些信號(hào)的應(yīng)答所觸發(fā)，例如藥物、營(yíng)養(yǎng)、光線，甚至是細(xì)胞中與癌癥相關(guān)的信號(hào)分子 。該記錄器不僅能記錄信號(hào)的存在；通過(guò)讀取交換DNA字母的比例，研究小組同樣能夠確定信號(hào)持續(xù)的時(shí)間和強(qiáng)度。

CRISPR，基因編輯界的超級(jí)英雄，新近又獲得了一些超能力

而與上一代細(xì)胞記錄器不同的是，劉的系統(tǒng)具有高靈敏度，只需要12個(gè)細(xì)胞就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的信號(hào)。時(shí)間回到2014年，麻省理工學(xué)院的蒂莫西·盧（Timothy Lu）博士開發(fā)了一種名為“抄寫員”（SCRIBE）的類似的記錄儀，它要求更高“數(shù)量級(jí)”的細(xì)胞，而其信噪比卻低得多。

“照相機(jī)”也有其他引以為豪的有用功能。例如，它可以同時(shí)記錄多個(gè)信號(hào)。獲得的這些數(shù)據(jù)也可以通過(guò)能將質(zhì)粒比恢復(fù)到基線的藥物來(lái)清除掉。

盧對(duì)此印象深刻。他表示，這項(xiàng)新工作完成得“非常漂亮”并且是一項(xiàng)“重要的進(jìn)步”。盡管任何醫(yī)學(xué)應(yīng)用都有很長(zhǎng)一段路要走，但該系統(tǒng)可以幫助檢測(cè)環(huán)境污染物，或者幫助科學(xué)家追蹤將干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元、肌肉或其他細(xì)胞類型的各種分子信號(hào)。

病毒獵手

另外兩項(xiàng)研究探討了將CRISPR轉(zhuǎn)變?yōu)殪`敏的一步法診斷工具的方法。

“探測(cè)器”利用了Cas9那個(gè)不太出名的堂兄弟——Cas12。

和Cas9一樣，Cas12也能跟隨一個(gè)向?qū)NA靶向目標(biāo)，然后將其切除。

但是剪刀并不會(huì)就此罷手。一個(gè)由加州大學(xué)伯克利分校的CRISPR先驅(qū)詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組驚奇地發(fā)現(xiàn)，在切除預(yù)期靶標(biāo)后，Cas12仍然保持活性——它會(huì)立即追蹤單鏈DNA分子并將其破壞。

利用這種特殊的活性，研究小組在他們的向?qū)NA上加入了分子熒光標(biāo)記，一旦Cas12被激活，熒光標(biāo)記就會(huì)發(fā)出明亮的綠色熒光。

在概念驗(yàn)證試驗(yàn)中，他們?cè)O(shè)計(jì)了幾種可以與人類乳頭瘤病毒（HPV）的不同病毒株相結(jié)合的向?qū)NA，而這些病毒株中有幾種會(huì)導(dǎo)致宮頸癌。該“探測(cè)器”系統(tǒng)能夠在不同病毒株混合液中識(shí)別出兩種特別危險(xiǎn)的HPV病毒株。

“這種蛋白質(zhì)是一種強(qiáng)大的工具，可以檢測(cè)多種來(lái)源的DNA，”研究報(bào)告的作者珍妮絲·陳（Janice Chen）說(shuō)道，“我們想要推進(jìn)這項(xiàng)技術(shù)的極限，它可能適用于任何涉及DNA成分的即時(shí)診斷情景，包括癌癥和傳染性疾病?！?/p>

缺點(diǎn)呢？Cas12的過(guò)分熱情可能會(huì)限制其在治療人類遺傳疾病方面的應(yīng)用。CRISPR創(chuàng)業(yè)公司愛(ài)迪塔斯已經(jīng)授權(quán)批準(zhǔn)Cas12進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)，這一發(fā)現(xiàn)可能會(huì)給他們的雄心壯志澆上一盆冷水。

話雖如此，把Cas12逐出基因編輯治療隊(duì)伍還為時(shí)尚早。當(dāng)人類的DNA解旋成為單鏈DNA（這正好是Cas12靶標(biāo)）時(shí)，這種酶主要與基因組DNA結(jié)合。這就限制了它在細(xì)胞中四處游蕩尋找潛在單鏈靶標(biāo)的能力，博德研究所的張鋒博士解釋道。他也在最近公布了一項(xiàng)基于CRISPR的病毒檢測(cè)系統(tǒng)，名為“神探夏洛克”。

這是一套“神探夏洛克”檢測(cè)紙帶。左：未使用的紙帶。中：檢測(cè)紙帶顯示陽(yáng)性“神探夏洛克”讀數(shù)。右：檢測(cè)紙帶顯示陰性“神探夏洛克”讀數(shù)

“神探夏洛克”：特殊高靈敏度報(bào)告系統(tǒng)unLOCKing，基于2017年首次開發(fā)出的一個(gè)系統(tǒng)，使用Cas13作為切割工具。Cas13同樣具有一種瘋狂的傾向，在它摧毀了它的初始靶標(biāo)之后，它就開始超速運(yùn)轉(zhuǎn)了。

在“神探夏洛克”中，張和同事們加入了“犧牲型”RNA分子，這些分子一旦被裂解就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)。在病毒DNA或RNA——比如寨卡病毒、埃博拉病毒或登革熱病毒——存在的情況下，Cas13會(huì)將靶標(biāo)病毒和犧牲型RNA切割成小塊，從而釋放出陽(yáng)性信號(hào)。

《科學(xué)》雜志在線發(fā)布的“神探夏洛克”2.0版，靈敏度是最初版本的100倍，可以同時(shí)探測(cè)到最多4個(gè)不同的靶標(biāo)。

它在野外作業(yè)中也非常實(shí)用：所有的試劑都結(jié)合在一張紙條上，這張紙條會(huì)被浸入測(cè)試樣品中。如果有一條線出現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果即是陽(yáng)性的，不需使用昂貴的專用儀器。

像“探測(cè)器”一樣，這使得“神探夏洛克”在疫情暴發(fā)時(shí)特別有用。這種技術(shù)很容易改進(jìn)優(yōu)化，以追蹤血液中的其他DNA分子，例如，那些通常與癌癥或老化細(xì)胞有關(guān)的DNA分子。

這些研究合在一起，新增了一種越來(lái)越明顯的研究趨勢(shì)，即熱衷于探索CRISPR技術(shù)在基因療法以外的應(yīng)用。與基于CRISPR技術(shù)的療法相比，這種療法需要多年的嚴(yán)格的安全性和有效性測(cè)試，這些“替代”療法可能會(huì)以更快的速度悄無(wú)聲息地匯入科學(xué)和診斷界主流。

盡管CRISPR的新技能在相應(yīng)領(lǐng)域的應(yīng)用還有待測(cè)試，但專家們?nèi)詽M懷希望。

“真正的能力在于接下來(lái)會(huì)發(fā)生什么，”薩維奇說(shuō)道，“現(xiàn)在，殺手級(jí)應(yīng)用還在開發(fā)中?！?/p>